ينتج عن هذا البروتوكول مناطق سليمة لتنظيم ضربات القلب في الحوض الكلوي ، وهو عضو العضلات الملساء داخل الكلى الذي يضخ البول إلى الحالب وإلى المثانة. على عكس عزل الخلايا عن الحوض الكلوي ، يوفر هذا النهج سليما في البيئات الموقعية لمناطق تنظيم ضربات القلب في الحوض الكلوي وإعدادا أكثر فسيولوجيا لدراسة عملية صنع ضربات الحوض الكلوي. الفرد الذي لم يسبق له أن أدى هذه التقنية قد النضال من أجل قطع أقسام موحدة.
يجب على المستخدم لأول مرة التأكد من أن الكلى مستوية على مرحلة الهزاز ولا تسرع عملية القطع. باستخدام ملقط الأنسجة الداخلية ومقص التشريح الداخلي، قرصة الأمعاء ورفعها بعيدا عن جدار البطن. قطع في وقت واحد الجانب السفلي من الأمعاء خالية من الجسم في الاثني عشر القريبة والقولون البعيدة للوصول إلى الفضاء الرجعية التي تحتوي على الكلى.
قرصة بلطف ورفع نهاية البعيدة من الحالب مع ملقط الأنسجة. باستخدام مقص تشريح، وقطع تحت الحالب مقروص نحو الكلى حتى أصبح محررا من النسيج الضام المحيطة بها. بمجرد تعرض الكلى، استخراجها بشكل فردي.
ملء طبق السيليكون المغلفة الاستومر مع الجليد الباردة KRB الحل. نقل الكلى إلى طبق تشريح وضمان أن تكون مغمورة تماما. استخدام مقص الربيع غرامة والملقط الداخلي لإزالة الأنسجة الدهنية من قاعدة الكلى لفضح الحوض الكلوي البعيدة، أو RP، والمجر القريب.
إزالة الحالب القريبة وجزء من RP البعيدة من القاعدة باستخدام مقص الربيع غرامة والملقط. بيرس كبسولة الكلى الخارجي مع ملقط تلميح غرامة، والصيد نصائح بعيدا عن الجسم الكلي. باستخدام ملقط مع كل يد، قرصة نهايات فضفاضة من الكبسولة وقشر لهم بعيدا حتى تتم إزالة غشاء كبسولة الكلى المتبقية تماما.
أدخل شفرة حلاقة في حامل النصل لأداة الهزاز وضبط زاوية إزالة النصل إلى حوالي 18 درجة. ضبط معلمات النصل كما هو مذكور في مخطوطة النص، مع التأكد من أن سمك قسم الكلى لا يتجاوز 150 ميكرومتر، مما سيؤثر سلبا على تجارب تصوير أيونات الكالسيوم. استخدام ملقط حادة النهاية لفهم بلطف وإزالة الكلى المعدة من محلول KRB الجليد الباردة.
ضع الكلى فورا على ورق ماصة لمدة تتناهز من ثانيتين إلى أربع ثوان لإزالة الرطوبة الخارجية الزائدة. لفة بلطف الكلى عبر ورقة ماصة لضمان أن جميع جوانب parenchyma قد جفت بحيث يكون هناك التصاق الأمثل للكلى إلى مرحلة الهزاز. تطبيق طبقة رقيقة على الفور من الغراء سيانواكريلات إلى قاعدة لوحة عينة هزاز واستخدام ملقط حادة النهاية لوضع الجانب الحالب الكلى إلى أسفل على المنطقة المغطاة في الغراء.
تطبيق بلطف الضغط النزولي إلى أعلى الكلى مع حافة مسطحة من ملقط لمدة 10 إلى 20 ثانية تقريبا لتجفيف الغراء. تأمين بحزم لوحة عينة إلى الجزء السفلي من علبة العازلة وضبط مستوى محلول KRB بحيث يتم مغمورة تماما الجزء العلوي من الكلى. بالنسبة لقسم الهزاز التلقائي، حدد موضعي بداية ونهاية دورة قطع شفرة الهزاز التي تتراوح بين 0.5 و1 سنتيمتر من الكلى لضمان تقسيم مستوى الكلى بأكمله.
ابدأ عملية القطع التلقائية، مع التأكد من أن النصل يتواصل مع الكلى. باستخدام ملقط، وجمع المقاطع التي يتم تحريرها من الكلى ونقلها على الفور إلى الآبار الفردية. مواصلة بروتوكول الأقسام واستخدام المجهر الخفيف لتحديد مناطق PKJ في شرائح الكلى حتى تصبح مناطق PKJ أكثر وضوحا.
ملء طبق تصوير مغلفة الاستومر السيليكون مع الجليد الباردة KRB الحل. نقل شريحة الكلى الفردية إلى الطبق. أدخل دبابيس Minutien حول محيط شريحة الكلى لتأمين القسم إلى قاعدة طبق التصوير.
ضع طبق التصوير على خشبة المسرح من المجهر كونفوجكال القرص الغزل تستقيم وتبدأ على الفور perfusing مع حل KRB. استخدام منخفضة التكبير المياه الغمر الهدف عدسة لتحديد موقع شريحة الكلى. مركز حقل التصوير على مناطق من شريحة حيث PKJ موجود باستخدام المعالم.
مرة واحدة يقع PKJ، استخدم أعلى التكبير المياه الغمر الهدف عدسة لتكبير منطقة الاهتمام. تميز الخلايا المختلفة ذات الاهتمام في أنواع مختلفة من الفترات العابرة لأيونات الكالسيوم في جدار PKJ. بمجرد تحديد الخلايا ذات الاهتمام، قم بضبط كثافة الليزر لتسفر عن نسبة جيدة من الإشارة إلى الضوضاء وتسجيل الصور على تردد أخذ العينات الزمني بين 16 و 32 هيرتز.
تظهر الصور المجهرية الخفيفة لأقسام الكلى بأكملها معالم مشروحة لمنطقة PKJ واحدة. مناطق PKJ متعددة موجودة بالقرب من النخاع الداخلي والكلى البعيدة. تظهر هنا مواقع الشرايين الكلوية PKJ وحدود PKJ.
يظهر هنا مقطع PKJ من ماوس يعبر عن GCaMP في خلايا PDGFR ألفا الإيجابية. يمكن تمييز جدار PKJ الرقيق المعلق بين الأنسجة الطبيعية باستخدام معالم مثل الشريان الكلوي. وينتشر التعبير عن GCaMP6f في هذا النسيج المعدلة وراثيا محددة عبر العرض الكامل للPKJ عبر كل من العضلات والطبقات السبتية.
في شرائح الكلى الإيجابية PDGFR ألفا GCaMP6f ، شبكة من الخلايا التي تمتد عادة على عرض جدار PKJ هي الفلورسنت ويعرض عابري أيونات الكالسيوم المتذبذبة من مختلف المدد والترددات. في شرائح الكلى الإيجابية SMC GCaMP3 ، توجد طبقة من الخلايا الإيجابية GCaMP3 في طبقة العضلات. تظهر خريطة ندوات أن الخلايا الإيجابية PDGFR ألفا الموجودة في PKJ adventitia تثير عابري أيونات الكالسيوم منخفضة التردد لفترات طويلة ، في حين أطلقت الشركات الصغيرة والمتوسطة عابري أيونات الكالسيوم أقصر مدة بشكل أكثر تكرارا.
وبالمثل، لوحظت أيضا مجموعة من إشارات أيونات الكالسيوم الفلورية داخل قنوات التجميع المحيطة بها ومركبات أيونات الكالسيوم المتذبذبة في الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تكون الكلية على أعلى مستوى ممكن أثناء تقسيم الهزاز لضمان تحرير شرائح الكلى الموحدة من الكتلة. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل عزل الخلية الواحدة والكيمياء المناعية والدراسات الجزيئية لزيادة فهمنا لآليات تنظيم ضربات القلب في الحوض الكلوي.
