Dieses Protokoll wurde durch unsere Arbeit im und in Zusammenarbeit mit den Labors von Paul Martin und Antonio Jacinto entwickelt. Wir danken der Bloomington Lager Zentrums für seinen ausgezeichneten Service und die Drosophila-Community für die Weiterbildung zu fliegen Linien teilen. BS wird derzeit von einer BBSRC Projektförderung finanziert. WW wird durch eine Wellcome Trust Career Development Fellowship gefördert.

Vorbereitung <ol><li> Erhalten entsprechenden Drosophila-Linien mit einer hemocyte-spezifische Gal4-Treiber (zB SRP-Gal4 2) und einem genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter unter UAS Kontrolle (z. B. UAS-GFP). Fliegen homozygot für SRP-Gal4, UAS-GMA 3 oder CRQ-Gal4, UAS-GFP 4, 5 sind besonders nützlich für die Bildgebung Zwecke (nb GMA ist GFP fusioniert mit dem Aktin-bindende Domäne von Moesin), siehe unten für eine Diskussion über Bereich von Gal4 Treiber und uas Konstrukte zur Verfügung (die Bloomington Lager Zentrum enthält ein breites Spektrum). </li><li> Typischerweise genetische Kreuze sind so ausgeführt, dass mutierte Allele ausgeglichen sind unter Verwendung von fluoreszierenden Balancer CTG oder TTG 6, mit Gal4 Treiber und uas Konstrukte auf alternative homologen Chromosomen durchgeführt. Dadurch ist es möglich, um homozygote Mutanten auf der Grundlage der Abwesenheit von CTG / TTG-assoziierten GFP-Fluoreszenz (dies ist in der Stufe 2,11 getan) zu wählen. </li><li> Amplify Aktien und Platz fliegt in das Mauerwerk Käfig mit einem Apfelsaft-Agar-Platte 7. Die Fliegen müssen mindestens zwei Tage, um die Verlegung Käfig zu akklimatisieren, bevor genügend Embryonen verlegt werden beginnen. Im Allgemeinen twenty fliegt von jedem Geschlecht sollte ausreichen, um genügend Embryonen für die Bildgebung erzeugen, aber es ist zu beachten, dass verschiedene Linien haben unterschiedliche Grade der Fruchtbarkeit. Wir verwenden 55mm Petrischalen, die in den Boden eines Kunststoffbecher passen, an ihrer Basis punktiert, um den Luftstrom zu ermöglichen. Die genaue mittels Embryo-Entnahme ist unwichtig, aber die Zeiten sind, um vollständig zu sammeln kritischen inszeniert Embryonen. </li><li> Sammeln Embryonen aus einer Übernachtkultur Apfelsaft-Agar-Platte bei 25 ° C oder von einer zeitlich Platte erhalten. Für letztere haben wir in der Regel erlauben die Fliegen auf einer vorgewärmten Platte für 4 Stunden lag, bevor Sie die Platte und stellen Sie es bei 18 ° C für 15-16 Stunden vor der Montage von Embryonen, dies sorgt für Embryonen aus späten Stadium 12 bis bis 15 der Entwicklungsphase. Eine Übernachtung Platte enthält eine größere Vielfalt der Stadien, sondern bietet den Vorteil der höheren Ebenen von fluoreszierenden Reporter Ausdruck in Blutzellen durch eine längere Zeit bei 25 ° C als Gal4-UAS-System ist temperaturempfindlich. </li></ol> Verfahren <ol><li> Verdrängen Embryonen aus der Apfelsaft-Agar-Platte mit einer geringen Menge Wasser und einer weichen Spitze Pinsel. Entfernter Embryonen können leicht mit dem bloßen Auge gesehen werden. </li><li> -Embryonen eine Zelle Sieb (Fisher) oder hausgemachte Warenkorb 7 von strömendem Wasser aus der Apfelsaft-Agar-Platte in den Korb über einen Becher gehalten, um Abwasser zu sammeln. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.2 bis Sie zufrieden sind, Sie haben genug Embryonen aus der Apfelsaft-Agar-Platte übertragen. </li><li> Wash Embryonen in Zellsieb / Korb mit Wasser. </li><li> Legen Sie Zellsieb / Korb in der Petrischale Deckel der Apfelsaft-Agar-Platte, und fügen Sie genug saubere Bleichmittel auf Embryonen in die Zelle Sieb / Korb auszusetzen. </li><li> Folgen Sie dechorionation der Embryonen auf einem Dissektionsmikroskop unter Hellfeld: dechorionation ist abgeschlossen, wenn die Rückenanhänge aufgelöst haben, die innerhalb von zwei Minuten auftreten. </li><li> Entfernen Zellsieb / Korb mit Embryonen aus der Bleich-und abwaschen Bleichmittelreste mit Wasser. Alle Spuren von Bleichmittel sollten, bevor Sie fortfahren bis 2,8 entfernt werden. Ein Trick, um festzustellen, ob alle der Bleiche entfernt wurde ist es, abtupfen Restwasser auf blauen Labor Gewebe - wenn es Bleichmittelreste die blaue Farbe wird gebleicht weiß / rosa sein. </li><li> Blot off restliche Wasser mit Labor Gewebe / mediwipes angewendet an der Unterseite der Zelle Sieb / Korb. </li><li> Legen Sie einen Tropfen Wasser in eine Petrischale Deckel. Mit einem feinen Pinsel, sammeln Sie alle dechorionated Embryonen aus dem Embryo Korb und resuspendieren sie in den Tropfen. Next trocknen die Embryonen durch Absaugen Wasser mit einer Mikropipette oder sorgfältig absorbierenden es mit einem Labor Gewebe / mediwipes. </li><li> Einmal wurden die Embryonen getrocknet worden, einen Tropfen Öl Voltalef alle Embryonen zu decken. Setzen Sie einen zweiten kleinen Tropfen Öl neben der Tröpfchen mit den Embryonen. NB es uns nicht gelungen, eine in Großbritannien ansässige Anbieter von Voltalef Öl zu finden; Halocarbonöl 700 (Sigma) können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Unter einem fluoreszierenden Dissektionsmikroskop wählen entsprechend inszeniert Embryonen des gewünschten Genotyp mit einem Paar Uhrmacher Pinzette (Nummer 5) aus der Öltröpfchen. Diese Zange ist nach innen gebogen (Abbildung 1) werden, um zu schöpfen die Embryonen ohne Durchstechen der Dotterhaut. Transfer ausgewählter Embryonen in die zweite Öltröpfchen. Es ist wichtig, dass Sie in der Lage, fluoreszierenden Blutzellen auf dem Binokular sehen, um in der Lage sein, um gute Bilder auf dem konfokalen Mikroskop (Abbildung 2) zu sammeln. Wir typischerweise montieren Bühne 13/14 Embryonen Bild seitliche Migration von Blutzellen auf der ventralen Mittellinie oder Stufe 15 Embryonenzur Abbildung der Motilität von Blutzellen nach Zerstreuung über den Embryo. </li><li> Stick zwei Deckgläsern (18x18mm, Dicke 1) an der Unterseite eines Petriperm / lumox Schale (Sarstedt), mit 2 kleinen Tropfen Voltalef Öl, so dass ca. 1 cm zwischen ihnen (Abb. 3), diese werden verwendet, um ein Deckglas platziert über Unterstützung die Embryonen, um nicht zu zerquetschen. Petriperm Gerichte (50mm Durchmesser) enthalten eine hydrophobe, gasdurchlässige Membran. Wir finden, dass die Gerichte einfacher zu bedienen, wenn sie bereits mehrfach verwendet haben (Gerichte können mit 70% Ethanol abgewischt und wieder verwendet werden) zu werden. </li><li> Unter Hellfeld auf die Dissektionsmikroskop, abholen ausgewählten Embryonen eins nach dem anderen mit dem gebogenen Pinzette und Line sie Bauchseite nach oben und parallel zur Kante der Deckgläser (Abbildung 3). Es ist möglich, richten bis zu 15 Embryonen auf diese Weise, je nach Geschicklichkeit und Geduld. Es ist wichtig, um die Embryonen vorsichtig zu manipulieren, da sowohl die Embryonen und Petriperm Gericht Membran zerbrechlich sind und kann leicht gebrochen werden. </li><li> Sobald die Embryonen ausgerichtet fügen Sie einen kleinen Tropfen Öl und lassen Sie es verbreitet zu einer homogenen Schicht zwischen den beiden Deckgläsern bilden. Nachdem das Öl ausgebreitet hat (dies kann einige Minuten dauern) zu überprüfen, dass die Embryonen noch Bauchseite auf. Wenn die Embryonen leicht gerollt haben, positionieren Sie sie wieder mit der Zange. </li><li> Schließlich mit einer Pinzette (Nummer 3) statt einem Deckglas (18x18mm, Dicke 1) über die Embryonen, gestützt auf die beiden zuvor eingehalten Deckgläser. Kleben Sie dieses Deckglas auf das Deckglas unterstützt die Verwendung von Nagellack (Abbildung 3). </li><li> Nehmen Sie die Petriperm Gericht mit montiertem Embryonen in die konfokale oder Weitwinkel-Mikroskop und montieren Sie die Petriperm Gericht auf der Bühne mit einem entsprechenden Adapter. Entweder eine aufrechte oder inverse Mikroskop verwendet werden, mit dem Objektiv Fokussierung durch das Deckglas (wie durch die Membran entgegen). </li></ol> Vertreter Ergebnis: Dieses Protokoll beschreibt, wie Drosophila-Embryonen für die Live-Darstellung von Blutzellen auf der Bauchseite des Embryos zu montieren. Wenn es richtig gemacht wird es leicht sein, um entweder Standbilder oder Filme von Blutzellen zu generieren. Die wichtigste Determinante ist das Mikroskop zur Abbildung der Blutzellen (insbesondere das Objektiv), aber die Art der Bilder erworben werden sie auch auf der Stufe der Entwicklung ab, die Temperatur der Embryonen wurden bei angehoben und die Gal4 und UAS-Linien verwendet. Höhere fluoreszierende Protein-Expression ermöglicht Blutzellen mit größerer Leichtigkeit abgebildet werden, daher ist es wichtig zu können Blutzellen zu sehen, wenn die Embryonen im Stadium 2.11 des Protokolls (Abbildung 2 enthält Beispiele für klare Blutzellen innerhalb Embryonen mit einer getroffen werden Kamera ausgestattet, eine Dissektionsmikroskop). Deshalb erhöhte Anzahl von Gal4 und UAS-Konstrukte ermöglichen ein größeres Signal-Rausch-Verhältnis. Des Weiteren wird diese reduziert den Bedarf an hohen Intensitäten oder erhöhte Belichtungszeiten bei der Abbildung, was wiederum ermöglicht hemocyte Verhalten für längere Zeit zu folgen. Sehr hohe GFP-Expression zeigen sich feine Details der hemocyte Morphologie, besonders die dünnen flächigen Lamellen, dass die kreisförmige Zellkörper (Abb. 4A-B) umgeben. Circular Regionen ohne GFP vertreten Phagosomen (Abb. 4A-C). Finger-wie Filopodien ist auch ersichtlich, die sich aus den Lamellen (Abbildung 4B) werden. Zwei Gal4-Treiber noch ausreichen, um diese Prozesse (4C), siehe vor allem, wenn einer oder mehr SRP-Gal4 (siehe Diskussion), aber langsamer Scangeschwindigkeit oder mehr Laserleistung auf dem konfokalen Mikroskop kann erforderlich sein. Als Ausdruck Niveau sinken, wird es schwieriger zu Bild die Vorsprünge von Blutzellen, trotzdem ist es immer noch möglich, die Migration von Blutzellen unter diesen Bedingungen Spur wie die Zellkörper bleibt offensichtlich auch dann, wenn Vorsprünge weniger deutlich (Abbildung 4D) sind. In früheren Stadien der Entwicklung (bis 13 Stufe) Blutzellen in engem Kontakt zu einer anderen migrieren und es ist oft schwer zu einzelnen Zellen zu unterscheiden. Bis zum Ende der 13. Etappe Blutzellen haben eine einzige Linie in der ventralen Mittellinie (Abbildung 5A) gebildet, dann, immer beweglich, seitlich wandern, um die Kanten des Bauchmark (Abbildung 5B). Das Aktin-Zytoskelett in der dynamischen Vorsprünge Blutzellen können direkt durch die Expression des GMA (Abbildung 5C) oder Kirschbaum-Moesin beobachtet werden. Montage des Embryos auf diese Weise ermöglicht Gasaustausch und verhindert das Austrocknen und Embryonen lebensfähig bleiben folgende Abbildung. Wenn der Embryo bei der Montage ist es im Allgemeinen auf der Hand, da der Embryo Inhalt durch seine Dotterhaut Leck wird beschädigt. Wenn ein Embryo nicht zu starten, um dann austrocknen kann dies oft durch Verformungen in der Dotterhaut gesehen worden. Gelegentlich ein Embryo wird im Laufe eines Zeitraffer Film roll, allerdings nur tendenziell länger Zeitskala Filme problematisch. Lastly, der Montage von mehreren Embryonen auf einmal gibt der Experimentator die beste Chance auf ein Embryo in die perfekte Orientierung für ihr Experiment. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Pinzetten zur Manipulation von dechorionated Embryonen. Die Spitzen der Uhrmacher Pinzette (Größe Nr. 5) sollte nach innen gebogen werden, um Mode ein Werkzeug aufnehmen Embryonen wie hier gezeigt. Die äußere Oberfläche des gebogenen Region ist auch nützlich, um Embryonen zu manipulieren, wenn die Positionierung auf dem Petriperm Membran, da sie keine scharfen Kanten sein, die die Embryos besitzen. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Repräsentative Bilder von Embryonen, die gute Live-Imaging-Ergebnisse zu erhalten. Bilder von dechorionated Embryonen in Voltalef Öl (auf Stufe 2.11 des Protokolls) auf einem fluoreszierenden Präpariermikroskop genommen. Seitenansichten der Stufe 13 (A) und der Stufe 15 (B) SRP-Gal4, UAS-GFP; CRQ-Gal4, UAS-GFP Embryonen. Seitliche Ansicht einer Stufe 15 SRP-Gal4, UAS-GFP / +; CRQ-Gal4, uas-GFP/uas-N17Rac Embryo (C) in die Blutzellen haben es versäumt, die Migration aus dem Kopf, zu zeigen, was Embryonen aussehen, wenn Blutzellen nicht entlang ihrer Migrationsrouten erkennbar. Seitliche Ansicht einer Stufe 17 SRP-Gal4, UAS-GFP; CRQ-Gal4, UAS-GFP Embryo zeigt die verschlungenen Struktur des Darms in diesem Stadium der Entwicklung (D), das Auftreten von Muskel-Kontraktion wird verhindert, Live-Aufnahmen von Embryonen jenseits dieser Stadium der Entwicklung. Ventral Blick auf Stufe 13 (E) und der Stufe 14 (F) SRP-Gal4, UAS-rote Stachel Embryonen zeigen die Verbreitung von Blutzellen mit fluoreszenzmarkierten Kernen. Die Beobachtung der Blutzellen durch Fluoreszenz im Stadium 2.11 des Protokolls ist eine Voraussetzung für gute Bilder zu erhalten; vordere ist auf der rechten Seite für alle Bilder. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Montage von Embryonen auf einem Petriperm / lumox Gericht. Zwei 18x18mm Deckgläser (Dicke 1) sind an der Unterseite des Petriperm Teller mit einem kleinen Tropfen Öl, um etwa 1cm als getrennt dargestellt stecken. Die Embryonen werden dann bis Bauchseite aufgereiht mit ihren langen (anterior-posterior)-Achse parallel zu den Rändern der Deckgläser und mit einem kleinen Tropfen Öl. Sobald das Öl ausgebreitet hat, um die Lücke zwischen den beiden Deckgläsern ein Drittel Deckglas (18x18mm Dicke 1) vorsichtig auf der Öl-bedeckten Embryonen mit Hilfe der beiden zuvor eingehalten Deckgläser als Brücke zu den Embryonen entfernt, zerquetscht zu verhindern, ist in Verkehr gebracht. Das Deckglas wird dann an den beiden Brücken Deckglas mit zwei kleinen Tropfen Nagellack verklebt. Einmal eingestellt, kann die Embryonen auf eine aufrechte oder inverse Mikroskop mit dem Objektiv Fokussierung nach unten durch das Deckglas (wie durch die Membran im Gegensatz Petriperm) abgebildet werden. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse aus Live-Aufnahmen von GFP-markierten Blutzellen. Z-Projektionen von Blutzellen auf der Bauchseite eines Stufe 14 SRP-Gal4, UAS-GFP; CRQ-Gal4, UAS-GFP Embryo (AB). (A) ist eine niedrigere Vergrößerung Bild wie zur hemocyte Entwicklungs-Migrationen in Zeitraffer-Filme zu überwachen. (B) ist ein höherer Vergrößerung immer noch von Blutzellen auf der ventralen Mittellinie, zeigt feine Details ihrer Morphologie. (C) ist ein einzelner 1 m Scheibe Blutzellen auf der ventralen Mittellinie in einer Stufe 14 SRP-Gal4, UAS-GFP / +; CRQ-Gal4, UAS-GFP / + Embryonen und enthüllt, dass niedrigere Kopienzahlen Gal4 Treiber und uas Konstrukte sind auch ausreichend, um gute Bilder zu erzeugen. (D) zeigt eine z-Projektion der Blutzellen in einer Stufe 14 CRQ-Gal4, UAS-GFP Embryo. Hier hemocyte Vorsprünge sind weniger offensichtlich aufgrund der geringeren Expression von GFP, aber es ist immer noch möglich, Filme zu machen und zu verfolgen hemocyte Migration mit dieser Kombination von Gal4-Treiber und Fachhochschulen zu errichten. Die Bilder wurden auf einem Leica LSM510 konfokalen Mikroskop aufgenommen; vordere ist in allen Bildern, die Ringe an der Peripherie der Bilder sind durch Dotterhaut Autofluoreszenz verursacht. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse aus Live-Aufnahmen von GMA Ausdruck Blutzellen. Z-Projektionen von Blutzellen auf der ventralen Mittellinie der Stufe 13 (A) und der Stufe 14 (B) SRP-Gal4, UAS-GMA Embryonen aus Zeitraffer-Filme getroffen, um Entwicklungs-Migrationen von Blutzellen zeigen. Detaillierte Informationen über Aktindynamik kann durch höhere Vergrößerung Bildgebung von GMA Ausdruck Blutzellen (C) bezogen werden. GMA besteht aus GFP fusioniert mit dem Aktin-bindende Domäne von Moesin und Etiketten Aktinfilamente. Anterior ist in allen Bildern, Bilder wurden auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen.

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Die wichtigsten Elemente dieses Verfahrens sind die Auswahl gesunder Embryonen mit deutlich gekennzeichneten Blutzellen und sie vorsichtig montieren, ohne sie zu beschädigen. Sobald die Embryonen in die Halocarbonöl sind, sind sie resistent gegen Austrocknung und einmal montiert werden kann für mehrere Stunden abgebildet werden. In unseren Händen können wir Bild Blutzellen für drei Stunden, mit vernachlässigbarer Austrocknung des Embryos oder offensichtliche Foto-Schäden, wobei ein z-Stapel von Bildern alle drei Minuten auf unserer Zeiss LSM510 konfokalen Mikroskop mit einer 40X-Objektiv. Da Blutzellen hochdynamischen gibt es möglicherweise einen Trade-off zwischen räumlicher und zeitlicher Auflösung: wenn ein sehr hoher Auflösung ist die hemocyte und Strukturen innerhalb es erforderlich sein können während des Scanvorgangs zu bewegen. Die genauen Einzelheiten, wie Bilder werden anschließend gesammelt werden, durch die experimentellen Fragen geklärt werden bestimmt werden. Wir verwenden in der Regel UAS-GFP oder FH-GMA 3 bis label Blutzellen; uas-GMA ist besonders nützlich, da neben der Kennzeichnung Blutzellen, es ist ein read-out bietet der Aktin-Filament-Dynamik. Andere uas Konstrukte verwendet werden, um hemocyte Verhalten Sonde werden: z. B. UAS-Kirsche Konstrukte 9 kann als alternative Fluorophore oder FH-tau-GFP 10 verwendet, um die Mikrotubuli innerhalb einer hemocyte visualisieren könnte genutzt werden. Uas Konstrukte mit einem nuklearen Etikett kann als besonders wertvoll für die automatisierte Verfolgung von hemocyte Bewegungen (Abbildung 2E-F). Zwei-Farben-Bildgebung ist auch möglich (z. B. kann man sowohl das Aktin und Mikrotubuli-Zytoskelett mit UAS-Kirsch-Moesin und UAS-tau-GFP-Label, jeweils unter der Kontrolle eines hemocyte-spezifische Gal4-Treiber). Wie bereits erwähnt, ist ein entscheidender Faktor in Live-Aufnahmen von Blutzellen des Gal4-Treiber eingesetzt: in Bezug auf aktuelle hemocyte-spezifische Promotoren SRP-Gal4 2&gt; CRQ-Gal4 11&gt; pxn-Gal4 4, mit nur SRP-Gal4 ausreichend zu kennzeichnen Haemocyten wenn heterozygot, während mindestens zwei Kopien des CRQ-Gal4 oder pxn-Gal4 sind nötig, um zu beobachten Blutzellen leben. Dennoch optimale Bildgebung mit SRP-Gal4 erfordert Homozygotie (oder das Vorhandensein eines alternativen Gal4-Treiber). Mit folgenden Blutzellen auf diese Weise zu leben ist es möglich, ihre Entwicklungs-Verteilung aus dem Kopf 8 zu studieren und beobachten, wie sie mit den Hinweisen zu interagieren, die Muster dieser Prozess, Kaution Matrix und verschlingen apoptotischen Leichen. Blutzellen auch einen interessanten, mit dem die Maschinerie der Zellwanderung Sonde; durch die Untersuchung der Migration von Blutzellen im Embryo, die Komponenten des Aktin-Zytoskelett oder Mikrotubuli Mangel ist es möglich, die in vivo-Funktion besser zu verstehen (zB Rho GTPasen 4, 12). Ausbeutung von uas Konstrukte zur Kennzeichnung dieser Zytoskelette bietet noch detailliertere Informationen über ihre Regulierung. Wir haben diese Technik modifiziert, um hemocyte Verhalten in einer Vielzahl von Zusammenhängen, wie ihre Reaktionen auf laser-induzierter wounds4 und Injektion von fluoreszenzmarkierten Bakterien 13-Sonde. Darüber hinaus kann diese Methode leicht an image anderen Zelltypen, indem Sie verschiedene Gal4 Treiber angepasst werden. Zum Beispiel haben wir zuvor dorsalen Verschluss aufgenommen mit epithelialen Gal4-Treiber 14, 15. Die Anwendung dieser Technik auf andere Zelltypen wird durch die Stärke des Gal4-Treiber, die Position der Zellen im Embryo und die Art des Mikroskops für die Bildgebung verwendet abgebildet werden begrenzt; Multiphotonen konfokale Mikroskope ermöglichen es dem Benutzer, Bildzelle Verhalten tief innerhalb des Embryos (zB Keimzelle transepithelialen Migration 16), während konventionelle konfokale Mikroskope sind nicht in der Lage, diese Tiefen zu erreichen (dies ist, warum wir Bild entlang der ventralen Mittellinie, wo Blutzellen sind sehr oberflächlich, zwischen den Entwicklungsländern Bauchmark und Epidermis eingeschlossen). Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es ein Umfeld zu Embryonen in einem gesunden Zustand für Live-Bildgebung zu halten bietet. Während ein gewisses Maß an manueller Geschicklichkeit ist erforderlich, um die Embryonen Position, ist es eine einfache Technik zu beherrschen und schnell gibt reproduzierbare Ergebnisse und können leicht geändert werden, mit verschiedenen Gal4 Treiber und uas Konstrukte zu viele verschiedene Aspekte der Biologie hemocyte Sonde. Darüber hinaus ist das Protokoll nicht zu Blutzellen beschränkt, da die Nutzung alternativer Gal4-Treiber ermöglicht das Verhalten anderer Gewebetypen zu analysieren.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>70&mu;m pores</td>
</tr>
<tr>
<td>Halcarbon oil 700</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8898</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lumox/Petriperm dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>96077305</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations

Viele Studien befassen sich mit der Zellwanderung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Methoden, während die physiologisch relevanten Umwelt ist, dass der Organismus selbst. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Montage von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embryonen und anschließender Live-Darstellung von fluoreszenzmarkierten Blutzellen, die embryonale Makrophagen dieses Organismus. Mit dem Gal4-UAS-System<sup&gt; 1</sup&gt; Fahren wir die Expression einer Vielzahl von genetisch kodierten, fluoreszenzmarkierten Marker in Blutzellen, ihre Entwicklungs-Verbreitung in den Embryo zu folgen. Nach dem Sammeln von Embryonen in der gewünschten Ausbaustufe ist die äußere Chorion entfernt und die Embryonen werden dann in Halocarbonöl zwischen einem hydrophoben, Gas-Membran und einem Deckglas für Live-Bildgebung montiert. Zusätzlich zu grob wandernde Parameter wie Geschwindigkeit und Ausrichtung, höhere Auflösung Bildgebung mit der Verwendung von fluoreszierenden Reporter von F-Aktin und Mikrotubuli Nähere Informationen über die Dynamik dieser Zytoskelett-Komponenten bieten gekoppelt.

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Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

live-imaging-of-drosophila-melanogaster-embryonic-hemocyte-migrations

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

15.6K Aufrufe.  University of Bath. Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Serie: Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Forschung

Biologie

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...