Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung von Aminopeptidasen mit verschiedenen oligomeren Zuständen und oligomerisierungsabhängigen Aktivitäten, die zwischen inaktiven Dimern und aktiven Dodecamern ausgeglichen sind. Diese herkömmliche Technik kann leicht in jedem Labor durchgeführt werden. Abgesehen davon, dass der Zugang zu einer Beamline- oder Röntgenkristallographie-Anlage erforderlich ist, sind keine speziellen Geräte erforderlich.
Mit einer gewissen Anpassung kann diese Methode auf jedes andere Protein mit einer Aktivität oder Funktion angewendet werden, die vom Grad der Oligomerisierung abhängt. Um die Röntgendaten verarbeiten zu können, müssen Benutzer über ein minimales Verständnis der Kristallographie verfügen. Wir laden Benutzer ein, Schulungen zu verfolgen, XDS Wiki zu besuchen und Phenix-Tutorials zu sehen.
Um einen Aktivitätstest durchzuführen, fügen Sie 25 Mikroliter 100 mM L-Leucin p-Nitroanilid zu 965 Mikroliter50 Millimolar MOPS, 250 Mikromolar Kobalt zwei Chlorid und 10% Methanol Vor inkubieren sie die Reaktionsmischung in einem 75 Grad Celsius trockenen Bad, bevor das Enzym zu einer einmikromollaren Endkonzentration mit zusätzlichen 50 Millimolar MOPS verdünnt wird. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter eines Mikromolaren-Enzyms in den Reaktionsmix und Wirbel die resultierende Lösung, bevor Sie die Reaktion auf das 75 Grad Celsius trockene Bad für nicht mehr als eine Stunde. Wenn die Lösung gelb geworden ist, stoppen Sie die Reaktion mit einem Milliliter 20%Saursäure und wirbeln Sie das Gemisch, bevor Sie es auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Dann übertragen Sie ein Aliquot des Reaktionsmixes auf eine Spektralphotometerzelle und lesen Sie die Absorber bei 410 Nanometern gegen einen inkubierten Reaktionsmix ohne Enzym, als Negativkontrolle. Zur Apoenzym-Präparation 10 Mikroliter 1, 10-Phenanthroline-Stammlösung zu 890 Mikroliter50 Millimolar MOPS, 0,5 Molaren-Ammoniumsulfat und 100 Mikroliter gereinigtem TmPep1050 hinzufügen. Überprüfen Sie den Aktivitätsverlust mit dem Aktivitätstest, wie gezeigt, ohne die Zugabe von Kobalt zwei Chlorid.
Nach dem Test die Probe in ein Dialyserohr geben und die Probe gegen 200 Milliliter 50 Millimolar MOPS und 0,5 Molar-Ammoniumsulfat bei vier Grad Celsius dialysieren. Das Dialysat während der 48-stunden-Dialyse dreimal mit frischem Puffer tauschen und Proben aus dem Dialyserohr sammeln. Mit Hilfe von Ultrafiltrationseinheiten mit einem 30-Kilodalton-Cutoff konzentrieren Sie die Probe wieder auf 100 Mikroliter und überprüfen Sie die Konzentration auf einem Nanovolumenspektrophotometer auf 280 Nanometer.
Um die Dimere vorzubereiten, verdünnen Sie das Apoenzym in 50 Millimolar MOPS und 0,5 Molar-Ammoniumsulfat auf eine mikromolare Konzentration und inkubieren Sie die Reaktion für zwei Stunden in einem 75 Grad Celsius trockenen Bad. Konzentrieren Sie dann die Enzymprobe auf mindestens 50 Mikroliter Konzentration und überprüfen Sie das Molekulargewicht durch Größenausschlusschromatographie. Um die Form, Größe und Kristallinität der Proteinkristalle zu verbessern, fügen Sie das entsprechende Volumen der optimierten Kristallisationslösung zu einem Tropfen Kristalle hinzu, um das Kristalltröpfchenvolumen auf 10 Mikroliter zu bringen.
Übertragen Sie das Tröpfchen auf ein 1,5 Milliliter Mikrorohr und fügen Sie dem ausgesäten Brunnen 90 weitere Mikroliter Kristallisationslösung hinzu. Für jede Samenverdünnung 500 Mikroliter Kristallisationsreagenz pro Brunnen in die entsprechende Anzahl von Brunnen in einer Kristallisationsplatte geben und zwei Mikroliter Proteinprobe mit zwei Mikroliter Kristallisationsreagenz und 0,2 Mikroliter Samen in einer Kristallisationsunterstützung pro Brunnen mischen. Befestigen Sie dann die Stützen an jedem Brunnen des Kristallisationsreagenzes.
Für die Kristallkommissionierung ein Bad mit flüssigem Stickstoff füllen und alle Fläschchen oder Korb, die für die Probenhandhabung verwendet werden, in den Stickstoff tauchen. Der Umgang mit flüssigem Stickstoff ist gefährlich, es kann zu starken Frostbissen führen. Achten Sie darauf, den richtigen individuellen Schutz wie kryogene Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.
Richten Sie Probenaufnahmeschlaufen unterschiedlicher Größe entsprechend der Kristallgröße ein und wählen Sie mit einem Fernglas einen Tropfen aus, der Kristalle enthält. Dann verwenden Sie eine Schleife, um vorsichtig einen isolierten Kristall aus einem Brunnen auszuwählen und sofort die Schleife in flüssigen Stickstoff zu tauchen, bevor Sie die Schleife in eine geeignete Durchstechflasche legen. Um die Beugungspunktintensitäten zu messen, erstellen Sie einen Ordner, aus dem XDS ausgeführt wird, und suchen Sie den Pfad zu den Bildern.
Um xdsme auszuführen, geben Sie den Befehl in ein Terminalfenster ein. Nachdem XDS den Auftrag beendet hat, überprüfen Sie die richtige lp-Datei und notieren Sie sich die Wahrscheinlichkeit der Raumgruppenbestimmung, Datenvollständigkeit, höchste Auflösung, Kristallmosaik und Datenqualität. Nachdem Sie das xDS-Protokoll ohne Punkt überprüft haben, um die Wahrscheinlichkeit von Speicherplatzgruppen zu erhalten, verwenden Sie die Befehle, um xdsme mit verschiedenen von XDS vorgeschlagenen Raumgruppenlösungen in einem separaten Ordner erneut auszuführen, um ein Überschreiben des vorherigen Prozesses zu vermeiden.
Nachdem Sie die beste Lösung basierend auf den Datenstatistiken ausgewählt haben, geben Sie die Befehle ein, um XSCALE und XDSCONV auszuführen. Um die Phase ohne anomale Streuung zu bestimmen, verwenden Sie 4P X, Y-Koordinaten, um das Startmodell für den molekularen Ersatz vorzubereiten. Aus der PDB-Datei, verwenden Sie die Phenix PDB-Datei-Editor, um die A-Monomer zu extrahieren und seine Aminosäuren in Alanin zu reduzieren.
Führen Sie X triaged mit der von XDSCONV generierten Reflektionsdatei und der Sequenz als Eingänge aus. Überprüfen Sie die Protokolldatei von Xtriage. Beachten Sie die Vollständigkeit, die Anzahl der Untereinheiten in der asymmetrischen Einheit, die Anisotropie, das Vorhandensein von Eisringen und das Twinning-Vorkommen.
Um Phaser-MR in Phenix für den molekularen Ersatz auszuführen, wählen Sie die Reflexionsdatei, die Sequenz und das Startmodell 4P sechs Y in Polyalanin abgeschnitten aus und klicken Sie auf Ausführen. überprüfen Sie nach Abschluss, ob ein Modell gefunden wurde, und überprüfen Sie die Punktzahl des molekularen Ersatzes. Ein Übersetzungsfaktor Z-Score von mindestens acht gibt an, dass die Lösung definitiv korrekt ist.
Nachdem Sie die Phase durch molekularen Austausch bestimmt haben, wählen Sie Auto Build ausführen aus, und klicken Sie auf Ausführen. Alle erforderlichen Dateien werden automatisch hinzugefügt. Überprüfen Sie nach Abschluss des Modells in COOT und erstellen und verfeinern Sie das Modell manuell gemäß der Elektronendichtekarte in COOT.
Mit diesem Modell, die Sequenz und die Beugungsdaten als Eingaben, verfeinern Sie das manuell kuratierte Modell in Phenix, unter Bezugnahme auf Phenix, um die richtige Strategie zu wählen. Nach der Verfeinerung überprüfen Sie die Ergebnisse, Verfeinerungfrei und Verfeinerung smüssen abnehmen. MolProbity-Indikatoren müssen respektiert werden und Ausreißer mit geringer realer Raumkorrelation, müssen begrenzt werden.
Wenn das am besten verfeinerte Modell generiert wurde, führen Sie MolProbity auf dem Server aus und überprüfen Sie alle vom Programm identifizierten Ausreißer. Größenausschlusschromatographie kann verwendet werden, um das scheinbare Molekulargewicht des gereinigten Proteins zu bestimmen. Der Kristallisationszustand des Peptids kann optimiert werden, indem der pH-Wert im Vergleich zur PEG-Konzentration um den Zustand des Dimers variiert wird.
Zum Beispiel wurden die besten TmPep1050 H60A H307A Kristalle in 0,1 molaren Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 5,2 und 20%PEG 3350 Konzentration, nach einem Zyklus der Mikrosaat, um die Mikrokristallinität zu verbessern erhalten. In dieser Analyse zeigte die Datenindizierung, dass die Raumgruppe des TmPep1050 H60A H307A Kristalls C2221 war, aber XDS schlug eine andere Lösung vor, die MP-Raumgruppe. Die Struktur des TmPep1050 H60A H307A konnte nach mehreren Zyklen der automatisierten und manuellen Veredelung abgeschlossen werden.
Bestätigung des oligomeren Zustands mit einer Grenzfläche von 1. 710 quadratischen Angstroms zwischen beiden Monomeren und einer freien Energie der Grenzflächenbildung von minus 16,2 Kilokalorien pro Mol. Hier kann eine Nahaufnahme der aktiven Fundstelle TmPep1050 H60A H307A im Vergleich zur aktiven Stelle des Dimers und Dodedesamers TmPep1050 beobachtet werden. Achten Sie beim Erstellen eines Modells darauf, nur das zu erstellen, was Sie in der Elektronendichte sehen, um eine Überinterpretation der Daten zu vermeiden und sich die Zeit zu nehmen, Ihr Modell zu polieren.
Das Molekulargewicht von Dimer und Dodecamer kann auch durch native Massenspektrometrie bestimmt werden. Und die Methoden können nützlich sein, um Übergangsoligomere zu erkennen.
