Questo protocollo facilita lo studio delle amminopeptidasi con diversi stati oligomerici e attività dipendenti dall'oligomerizzazione che sono bilanciate tra dimeri inattivi e dodecamer attivi. Questa tecnica convenzionale può essere facilmente eseguita in qualsiasi laboratorio. E oltre a richiedere l'accesso a una funzione di cristallografia beamline o a raggi X, non richiede dispositivi speciali.
Con un certo adattamento, questo metodo può essere applicato a qualsiasi altra proteina con un'attività o una funzione che dipende dal suo grado di oligomerizzazione. Per elaborare i dati a raggi X, gli utenti devono avere una comprensione minima della cristallografia. Invitiamo gli utenti a seguire corsi di formazione, a visitare XDS Wiki e a guardare tutorial Phenix.
Per eseguire un test di attività, aggiungere 25 microlitri di 100 mM L-Leucine p-Nitroanilide a 965 microlitri di MOPS da 50 millimolare, 250 micromolare cobalto due cloruri e 10%metanolo Pre incubare la miscela di reazione in un bagno secco di 75 gradi Celsius, prima di diluire l'enzima a una concentrazione finale micromolare con mops 50 millimolare aggiuntivo. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di un enzima micromolare alla miscela di reazione e vortice la soluzione risultante prima di restituire la reazione al bagno secco di 75 gradi Celsius per non più di un'ora. Quando la soluzione è diventata gialla, interrompere la reazione con un millilitro di acido acido al 20% e vortice la miscela prima di lasciare raffreddarla a temperatura ambiente.
Quindi trasferire un'aliquota della miscela di reazione a una cella spettrofotometrica e leggere gli assorbenti a 410 nanometri contro una miscela di reazione incubata senza enzima, come controllo negativo. Per la preparazione dell'apoenzima, aggiungere 10 microlitri di soluzione di 1, 10 fenantrolina a 890 microlitri di MOPS millimolare, 0,5 solfato di ammonio molare e 100 microlitri di TmPep1050 purificato. Controllare la perdita di attività utilizzando il saggio di attività come dimostrato senza l'aggiunta di cobalto due cloruri.
Dopo il test, trasferire il campione in un tubo di dialisi e dializzare il campione contro 200 millilitri di MOPS millimolare e 0,5 solfato di ammonio molare a quattro gradi Celsius. Scambiare il dialisato con tampone fresco tre volte durante la dialisi di 48 ore e raccogliere il campione dal tubo di dialisi. Utilizzando unità di ultra filtrazione con un taglio di 30 kilodalton, concentrare il campione a 100 microlitri e controllare la concentrazione su uno spettrofotometro a nano volume a 280 nanometri.
Per preparare i dimeri diluire l'apotenzima a una concentrazione micromolare in MOPS millimolare e 0,5 solfato di ammonio molare e incubare la reazione per due ore in un bagno secco di 75 gradi Celsius. Quindi concentrare il campione enzimatico a quando almeno 50 microliter di concentrazione e controllare il peso molecolare per dimensione esclusione cromatografia. Per migliorare la forma, le dimensioni e la cristallinità dei cristalli proteici, aggiungere il volume appropriato di soluzione di cristallizzazione ottimizzata a una goccia di cristalli per portare il volume della goccia di cristallo a 10 microlitri.
Trasferire la goccia in un microtubo da 1,5 millilitri e aggiungere altri 90 microlitri di soluzione di cristallizzazione al pozzo seminato. Per ogni diluizione del seme, aggiungere 500 microlitri di reagente di cristallizzazione per pozzo al numero appropriato di pozzi in una piastra di cristallizzazione e mescolare due microlitri di campione proteico con due microlitri di reagente di cristallizzazione e 0,2 microlitri di semi in un unico supporto di cristallizzazione per pozzo. Quindi fissare i supporti su ogni pozzo di reagente di cristallizzazione.
Per la raccolta del cristallo, riempire un bagno con azoto liquido e immergere eventuali fiale o cesto utilizzati per la manipolazione del campione nell'azoto. La manipolazione dell'azoto liquido è pericoloso, può causare forti congelamento. Assicurati di indossare protezioni individuali adeguate come guanti criogenici e occhiali protettivi per gli occhi.
Impostare cicli di prelievo campioni di dimensioni diverse in base alle dimensioni del cristallo e utilizzare un binocolo per selezionare una goccia contenente cristalli. Quindi utilizzare un anello per selezionare delicatamente un cristallo isolato da un pozzo e immergere immediatamente l'anello in azoto liquido prima di posizionare l'anello in una fiala adatta. Per misurare le intensità spot di diffrazione, create una cartella da cui verrà eseguito XDS e individuate il percorso delle immagini.
Per eseguire xdsme, immettere il comando in una finestra terminale. Dopo che XDS ha terminato il lavoro controlla il file lp corretto e nota la probabilità della determinazione del gruppo spaziale, la completezza dei dati, la massima risoluzione, la mosaicità cristallina e la qualità dei dati. Dopo aver controllato il log inutile XDS per ottenere la probabilità di gruppi spaziali, utilizzare i comandi per rieseguire xdsme con diverse soluzioni di gruppi spaziali proposte da XDS, in una cartella separata per evitare di ignorare il processo precedente.
Dopo aver selezionato la soluzione migliore in base alle statistiche sui dati, immettere i comandi per eseguire XSCALE e XDSCONV. Per determinare la fase senza un elemento di scattering anomalo, utilizzare le coordinate 4P X, Y, per preparare il modello iniziale per la sostituzione molecolare. Dal file PDB, utilizzare l'editor di file PDB Phenix per estrarre il monomero A e troncare i suoi amminoacidi in alanina.
Eseguire X triaged con il file di riflessione generato da XDSCONV e la sequenza come input. Controllare il file di registro da Xtriage. Si noti la completezza, il numero di subunità nell'unità asimmetrica, l'anisotropia, la presenza di anelli di ghiaccio e l'evento di gemellaggio.
Per eseguire Phaser-MR in Phenix per la sostituzione molecolare, selezionate il file di riflessione, la sequenza e il modello iniziale 4P six Y troncato in polialanina e fate clic su Esegui (Run). al termine, verificare se è stato trovato un modello e controllare il punteggio della sostituzione molecolare. Un punteggio Z del fattore di traduzione di almeno otto indica che la soluzione è definitivamente corretta.
Dopo aver determinato la fase mediante sostituzione molecolare, selezionare Esegui compilazione automatica e fare clic su Esegui. Tutti i file richiesti verranno aggiunti automaticamente. Al termine, controllare il modello in COOT e costruire e perfezionare il modello manualmente, in base alla mappa di densità degli elettroni in COOT.
Utilizzando questo modello, la sequenza e i dati di diffrazione come input, perfezionare il modello curato manualmente in Phenix, riferendosi a Phenix per aiutare a selezionare la strategia giusta. Dopo il perfezionamento controllare i risultati, il lavoro di perfezionamento e perfezionamento deve diminuire. Gli indicatori di MolProbity devono essere rispettati e gli outlier con bassa correlazione dello spazio reale devono essere limitati.
Quando è stato generato il modello più raffinato, eseguire MolProbity sul server ed e controllare eventuali valori anomali identificati dal programma. La cromatografia ad esclusione di dimensioni può essere usata per determinare il peso molecolare apparente della proteina purificata. La condizione di cristallizzazione del peptide, può essere ottimizzata variando il pH rispetto alla concentrazione PEG intorno alla condizione del dimero.
Ad esempio, i migliori cristalli TmPep1050 H60A H307A, sono stati ottenuti in citrato di sodio molare 0.1 con un pH di concentrazione di 5,2 e 20%PEG 3350, dopo un ciclo di micro semina per migliorare la microcristalinità. In questa analisi, l'indicizzazione dei dati ha mostrato che il gruppo spaziale del cristallo TmPep1050 H60A H307A era C2221, ma XDS ha proposto un'altra soluzione, il gruppo spaziale MP. La struttura di TmPep1050 H60A H307A, potrebbe essere completata dopo diversi cicli di perfezionamento automatizzato e manuale.
Conferma dello stato oligomerico con una superficie di interfaccia di 1.710 angstrom quadrati tra monomeri e un'energia libera di formazione dell'interfaccia di meno 16,2 chilocalorie per talpa. Qui si può osservare un primo piano del sito attivo TmPep1050 H60A H307A rispetto al sito attivo del dimero e del dodecamer TmPep1050. Quando si costruisce un modello, fare attenzione a costruire solo ciò che si vede nella densità degli elettroni per evitare un'interpretazione troppo elevata, i dati, e prendersi il tempo necessario per lucidare il modello.
Il peso molecolare del dimero e del dodecamero può anche essere determinato dalla spettrometria di massa nativa. E i metodi possono essere utili per rilevare oligomeri di transizione.
