Die Lösung der Struktur der Ryanodin-Rezeptor-Domäne kann bei unserem Verständnis des molekularen Mechanismus der Proteinfunktion, insektizid-Wirkung und Der Entwicklung der Insektizidresistenz helfen. Diese Maßnahme impliziert die Verwendung der Röntgenkristallographie zur Strukturillustration, die als Goldstandard für die Bestimmung der Proteinstruktur bei nahezu atomarer Auflösung gilt. Diese hochauflösende Struktur der Insektenryanodin-Rezeptor-Domäne zeigt den Mechanismus der Kanalgating und stellt eine wichtige Vorlage für die Entwicklung von artspezifischen Insektiziden mit strukturbasierten Arzneimitteldesign-Ansätzen.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu mit dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil angehende Proteinkristallographen in Biochemie, Biophysik, Informatik und Mathematik beherrschen müssen. Beginnen Sie mit der Verstärkung der DNA, die dem Protein von Interesse durch Polymerase-Kettenreaktion entspricht. Am Ende der Reaktion die gesamten 50 Mikroliter Reaktionsmischung auf einem 2%Agarose-Gel laufen lassen und die DNA mit einem Gelextraktionskit nach Standardprotokollen extrahieren.
Als nächstes linearisieren Sie die LIC-Vektor-DNA, indem Sie 20 Mikroliter der Vektor-DNA mit 6 Mikrolitern 10X Reaktionspuffer und 4 Mikroliter SspI-Restriktionsenzym in 30 Mikroliter doppeldestilliertem Wasser mischen. Inkubieren Sie diese Reaktionsmischung für drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Führen Sie am Ende der Inkubation den gesamten Reaktionsmix auf einem 1%agarose Gel aus, gefolgt von der Extraktion der linearisierten Vektor-DNA mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Als nächstes führen Sie separate T4-DNA-Polymerase-Behandlungen auf 5 Mikroliter der linearisierten Vektor-DNA und der PCR-verstärkten Insert-DNA gemäß Standardprotokollen durch. 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von 20 Minuten Enzymwärmeinaktivierung bei 75 Grad Celsius. Führen Sie die ligationsunabhängige Klon-Glühreaktion durch, indem Sie 2 Mikroliter der t4 behandelten Insert-DNA mit 2 Mikrolitern der t4 behandelten LIC-Vektor-DNA für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur kombinieren.
Um BL21(DE3)E. Coli-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid zu transformieren, 50 Mikroliter kompetenter Zellen auf Eis aufzutauen und etwa 1 Mikroliter des geglühten Plasmids in die Röhre zu geben. Streichen Sie die Röhre zwei- bis dreimal sanft, um die Zellen und die DNA zu mischen, und legen Sie die Röhre 20 Minuten lang wieder auf Eis.
Am Ende der Inkubation, Hitze-Schock die Zellen bei 42 Grad Celsius für 40 Sekunden, gefolgt von zwei Minuten zurück auf Eis. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter Raumtemperatur-LB-Medium in die Röhre und legen Sie die Zellen 45 Minuten bei 37 Grad Celsius auf einen 250 U/min-Shaker. Am Ende der Schüttelinkubation 150 bis 200 Mikroliter dieser Mischung auf Selektionsplatten aufpressen und die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius umkehren.
Am nächsten Tag, Kultur eine einzelne Kolonie in 100 Milliliter 2-YT Medium, ergänzt mit Kanamycin, in einem Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen, impfen Sie einen Liter 2-YT Medium, ergänzt mit Kanamycin, mit 10 Millilitern Nachtkultur, und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, bis die OD600-Messung etwa 0,6 erreicht. Dann induzieren Sie die Kultur mit IPTG zu einer Endkonzentration von 0,4 Millimolar, und wachsen die Zellen für fünf Stunden bei 30 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet auf 10 Gramm Bakterien pro 40 Milliliter Lysepufferkonzentration wieder auf. Stören Sie die Zellwände durch Beschallung bei einer 65%-Amplitude und eine Sekunde auf eine Sekunde aus, für acht Minuten. Entfernen Sie die Zellablagerungen durch Zentrifugation.
Filtern Sie dann den Überstand durch einen 22-Mikrometer-Filter, und laden Sie die Lösung in eine Probenschleife. Um das Fusionsprotein zu reinigen, injizieren Sie den gefilterten Überstand aus der Probenschleife in eine fünf Milliliter Nickel-Nitrolotriacetic-Säule auf einem Reinigungssystem mit einem linearen Gradienten von 20 bis 250 Millimolar Imidazol. Das eluierte Zielprotein mit der Protease des Tabak-Ätzvirus im Verhältnis 1 bis 50 über Nacht bei 4 Grad Celsius spalten und die Spaltreaktionsmischung auf einer Amylose-Harzsäule und einer Nickel-Nitrolotriacetic-Säule reinigen, um die Tag- und die Tabak-Etch-Virus-Protease zu entfernen.
Dialysieren Sie den Durchfluss aus der nickelnitrolotriacetic-Säule gegen den Dialysepuffer, um die Salzkonzentration zu reduzieren, und reinigen Sie die Probe auf einer Anionenaustauschsäule durch einen linearen Gradienten von 20 bis 500 Millimolaren Kaliumchlorid im Elutionspuffer. Konzentrieren Sie das Protein dann in einem Zentrifugalkonzentrator. Injizieren Sie das konzentrierte Protein in eine Superdex 200 26/600 Gelfiltrationssäule, um die Homogenität zu überprüfen und die Reinheit des Proteins um 15%SDS-PAGE zu bewerten.
Um das Protein für die Kristallisation vorzubereiten, konzentrieren Sie die gereinigte Proteinprobe auf 10 Milligramm pro Milliliter im Zentrifugalkonzentrator und Pufferaustausch zu Kristallisationspuffer vor 80 Grad Celsius Lagerung. Um das Kristallisationsscreening durchzuführen, verwenden Sie die Sitztropfendampfdiffusionsmethode bei 295 Kelvin mit mehreren Kristallisationskits und einem automatisierten Flüssigkeitshandling-System im 96-Well-Format. Am Ende der Falleinstellung die 96-Well-Kristallisationsplatte versiegeln, um Verdunstung zu verhindern und die Ausgleichung des Proteintropfens innerhalb des Reservoirpuffers zu ermöglichen.
Legen Sie die Platten in einen Kristall-Inkubator bei 18 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Platten regelmäßig unter einem Lichtmikroskop, um die Kristallbildung und das Wachstum zu überwachen. Um die Proteinkristalle von den Salzkristallen zu unterscheiden, fügen Sie dem Zieltropfen einen Mikroliter Proteinkristallfarbstoff hinzu und beobachten Sie die Kristalle nach einer Stunde unter dem Mikroskop.
Die Proteinkristalle erscheinen blau. Um die Kristalle weiter zu optimieren, verwenden Sie die positiven Kristallisationsbedingungen und die hängende Tropfendampfdiffusionsmethode in 24-Well-Platten, gefolgt von inkubation im Kristallinkubator bei 18 Grad Celsius. Um die Proteinstruktur zu bestimmen, montieren Sie die Kristalle auf einem Kryoloop unter einem Lichtmikroskop für die Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff und legen Sie die Kristalle in einen Unibuk für lagerungs- und Transport.
Vorababschirmen der Kristalle in einem hauseigenen Röntgendiffierer, mit der manuellen Zentrierfunktion, um die Kristalle zu montieren und zu zentrieren. Verwenden Sie dann die Röntgenbeugungssoftware, um die Daten zu sammeln. Um den Datensatz mit Der HKL-2000-Suite zu indizieren, zu integrieren und zu skalieren, wählen Sie zunächst den Detektor aus, und laden Sie den Datensatz.
Führen Sie dann die Spitzensuchfunktion aus, um die Beugungsflecken zu finden. Indexierung der Spots, Auswählen der richtigen Raumgruppe und Spitzenintegration. Skalieren Sie als Nächstes den Datensatz.
Passen Sie das Fehlermodell an, und skalieren Sie es erneut. Speichern Sie die Ausgabe-Sca-Datei. Um die Struktur mit der Phenix Software Suite zu bestimmen, erstellen Sie ein neues Projekt.
Führen Sie zunächst Extriage mit der Sca-Datei aus, um die mögliche Kopieranzahl von Proteinmolekülen in der asymmetrischen Einheit zu berechnen. Um das Phasenproblem durch molekularen Ersatz zu lösen, führen Sie Phaser mit der Beugungsdatendatei, der Vorlagenstrukturdatei mit hoher Sequenzidentität und struktureller Ähnlichkeit als Zielprotein und der Proteinsequenzdatei aus, um die Lösung zu finden. Führen Sie den automatischen Build in Phenix durch, um das ursprüngliche Modell zu generieren, indem Sie die Ausgabedatei von Phaser und die Sequenzdatei aus dem Zielprotein verwenden.
Bauen Sie die Struktur manuell in die modifizierte experimentelle Elektronendichte mit COOT und verfeinern Sie mit Phenix Verfeinern in iterativen Zyklen. Überprüfen Sie das endgültige Modell mit den Validierungstools in Phenix. In diesem repräsentativen Experiment ergab die Reinigung der Endterminaldomäne des Diamantrücken-Motten-Ryanodin-Rezeptorproteins, wie gezeigt, durch STS-PAGE-Analyse ein einzelnes Band bei etwa 21 Kilodaltonen.
Das Elutionsvolumen aus der Gelfiltrationskolonne bestätigte die gereinigte Ryanodin-Rezeptor-Endterminal-Domäne als Monomer. Für die Kristallisation waren die optimalsten Bedingungen, unter denen hochwertige plattenförmige Kristalle gebildet wurden, in Gegenwart von 1 molaren HEPES mit einem pH-Wert von 7 und 1,6 molaren Ammoniumsulfat. Bestimmung der Proteinstruktur aus dem Beugungsdatensatz unter Verwendung von Software, wie gezeigt, ergab die Diamantrücken-Motte Ryanodin-Rezeptor-Endterminal-Domäne, die Rückstände 1 bis 205 abdeckt.
Proteine mit großen Störungen, flexiblen Regionen oder mit schwachen Affinitäten sind eine Herausforderung zu kristallisieren. In diesen Szenarien können Protein-Engineering-Strategien wie Oberflächenentropiereduktion, Schleifenkürzung und Vernetzung die Wahrscheinlichkeit erhöhen, bessere Proteinkristalle zu erhalten. Neben der Aufdeckung hochauflösender Proteinstrukturen kann die Röntgenkristallographie auch verwendet werden, um Protein-Pestizid-Wechselwirkungen zu untersuchen, die bei der strukturbasierten Pestizidkonstruktion helfen könnten.
