Dieses Protokoll kann verwendet werden, um wichtige Fragen in der grundlagen- und klinischen Forschung zu behandeln, indem die Proteinexpression über verschiedene Gewebe und Zeitpunkte hinweg untersucht wird. Um eine zuverlässige quantitative Western-Blotting durchzuführen, kombinieren wir einen fluoreszierenden Gesamtproteinfleck mit einer internen Belastungskontrolle. Dadurch werden Die Grenzen überwunden, die beim Vergleich verschiedener Gewebe über experimentelle Bedingungen hinweg entstehen.
Um Proteine aus snap-gefrorenen Zell- oder Gewebeproben zu extrahieren, tauen Sie die Minus-80-Grad-Proben auf Eis auf, bevor Sie die Proben entsprechend der Tabelle waschen. Mit einem handgeführten elektrischen Homogenisator mit einem Polypropylen-Stößel die gewaschenen Proben homogenisieren, den Stößel in doppelt destilliertem Wasser spülen und mit einem sauberen Gewebe zwischen den Proben trocknen. Lassen Sie die Proben 10 Minuten auf Eis, gefolgt von zentrifugieren.
Dann übertragen Sie den proteinhaltigen Überstand in eine neue Röhre auf Eis, ohne das Pellet zu stören. Zur Quantifizierung der Proteinkonzentration sollten Rinderserumalbumin-Standards bei zunehmender Konzentration in Dreifacharbeit festgelegt und ein Mikroliter jeder Proteinprobe doppelt in die entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Optikplatte gegeben werden. Inkubieren Sie das Protein auf einem 60-Grad-Celsius-Wärmeblock für 10 Minuten oder länger, wenn die Proteinkonzentration voraussichtlich niedrig ist, und messen Sie die Absorption bei 560 Nanometern auf einem Plattenleser.
Exportieren Sie die Plattenlesermessungen und berechnen Sie die Proteinkonzentration, indem Sie die durchschnittlichen Absorptionswerte jeder Probe mit einer Standardkurve vergleichen, die mit dem Proteinstandard ermittelt wurde. Um die Menge an Protein zu normalisieren, bereiten Sie Verdünnungen der Proteinproben in Probenpuffer und reinem Reinstwasser vor und inkubieren Sie die Proben in einem 70-Grad-Celsius-Wärmeblock für 10 Minuten. Dann legen Sie die Proben auf Eis, bevor Sie wirbeln und kurz zentrieren.
Für die Elektrophorese ein vorgefertigtes Vier- bis 12%Bis-Tris-Gradientengel im Gelelektrophorese-Kammersystem einrichten und 3,5 Mikroliter eines Proteinstandards in den Brunnen laden. Wenn Sie einen internen Standard für die Normalisierung zwischen der Membran verwenden, laden Sie eine Menge, die den anderen Proben entspricht, in die ersten drei Brunnen neben der Proteinleiter und laden Sie 30 Mikrogramm jeder Probe in die verbleibenden Bohrungen. Führen Sie dann die Proben bei 80 Volt für 10 Minuten durch das Stapelgel, gefolgt von 150 Volt für weitere 45 bis 60 Minuten.
Legen Sie das Proteingel am Ende der Elektrophorese, um den Transferstapel zu montieren, auf den unteren Stapel, der die Polyvinyliden-Difluoridmembran gefolgt vom Filterpapier enthält. Verwenden Sie die Blottwalze, um Luftblasen zu entfernen und legen Sie den oberen Stapel auf der Oberseite des Filterpapiers, bevor Sie den Stapel wieder rollen, um Luftblasen zu entfernen. Übertragen Sie den gesamten Stapel mit der Elektrode auf der linken Seite des Geräts in die Übertragungsvorrichtung und legen Sie den Gelschwamm auf den Stapel, so dass der Schwamm an den entsprechenden elektrischen Kontakten am Gerät ausgerichtet ist.
Nachdem Sie den Deckel geschlossen haben, wählen Sie das entsprechende Programm aus und starten Sie es. Am Ende des Programms die Membran auf die Gelgröße schneiden und die geschnittene Membran schnell mit doppelt destilliertem Wasser waschen, bevor Sie mit dem gesamten Proteinfleck fortfahren. Für die gesamte Proteinfärbung die Membran in ein 50-Milliliter-Rohr mit der nach innen gerichteten Proteinseite rollen und die Membran mit fünf Millilitern Proteinflecklösung auf einer Walze fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Dunstabzugshaube beschriften.
Am Ende der Inkubation die Membran schnell mit fünf Millilitern Waschlösung waschen und das Rohr zwischen den Waschungen kurz auf die Walze zurückgeben, gefolgt von einer kurzen Spülung mit reinem Reinstwasser. Fügen Sie der Membran drei Milliliter Sperrpuffer hinzu und geben Sie die Membran bei Raumtemperatur für 30 Minuten an die Walze zurück. Ersetzen Sie den Sperrpuffer bei entsprechender optimierter Konzentration durch den primären, von Interesse, und brüten Sie die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius auf die Walze.
Am nächsten Tag die Membran sechsmal für fünf Minuten mit fünf Millilitern frischer PBS pro Wäsche auf der Walze bei Raumtemperatur waschen. Nach der letzten Wäsche die Membran mit der entsprechenden Sekundärantikörperlösung auf der Walze für eine Stunde bei Raumtemperatur bebrüten, gefolgt von drei Wäschen für 30 Minuten pro Wäsche. Trocknen Sie nach der letzten Wäsche die Membran und verwenden Sie Aluminiumfolie, um die Membran vor Licht zu schützen.
Legen Sie zur Bildaufnahme die Membran auf den Scanner mit der Nachwärtsseite des Proteins und wählen Sie den Scanbereich in der Software aus. Erfassen Sie dann Bilder in beiden Kanälen, und exportieren Sie die Bilder in ein entsprechendes Bildanalyseprogramm. Zeigen Sie den 700-Nanometer-Kanal an, um das Gesamtergebnis der Proteinfärbung anzuzeigen, und wählen Sie Analyse und Rechteck zeichnen aus, um den Bereich von Interesse für die Normalisierung zu definieren.
Kopieren Sie dann den ersten Rechteckbereich in jedes einzelne Beispiel, und fügen Sie ihn in jedes einzelne Beispiel ein, um sicherzustellen, dass der definierte Bereich für alle analysierten Bahnen die gleiche Größe hat. Um die Proteinkonzentration in jeder Spur zu quantifizieren, kopieren Sie die Ergebnisse sowohl aus dem gesamten Proteinfleck als auch aus dem Protein von Interesse in ein Tabellenkalkulationsprogramm und bestimmen Sie das höchste Proteinflecksignal insgesamt. Dividieren Sie dann jeden Gesamtwert des Proteinflecksignals durch diesen Wert, um den normalisierten Proteinbelastungswert zu erhalten, und dividieren Sie den 800-Nanometer-Signalwert von jeder einzelnen Probe durch den entsprechenden normalisierten Proteinwert, um das relative Proteinexpressionsverhältnis in verschiedenen Proben zu berechnen.
In diesen repräsentativen westlichen Flecken werden Proteine, die aus Geweben gewonnen wurden, die aus postnatalen Fünf-Mäusen gewonnen wurden, mit Proteinen verglichen, die von 10 Wochen alten erwachsenen Mäusen extrahiert wurden. Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität des gesamten Proteinflecks wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität innerhalb der Rechteckbox auf jeder Spur erreicht. Wenn ganze Bahnen analysiert werden, bleibt die Fluoreszenzintensität in den Proben relativ ähnlich, was darauf hindeutet, dass die Verwendung des gesamten Proteinflecks für die Normalisierung für diesen Zweck geeignet ist.
Der fluoreszierende Gesamtproteinfleck kann auch verwendet werden, um Proteinspiegel zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten zu vergleichen. Zum Beispiel, obwohl überlebenmotorische Neuronenproteinspiegel deutlich mit dem Alter bei Mäusen abnehmen, bleibt die gesamte proteingefleckte Quantifizierung konstant. Die Verwendung interner Standards, fluoreszenzbasierte Normalisierung und angemessene Statistiken erhöhen die Robustheit komplexer Proteinexpressionsanalysen unter verschiedenen Bedingungen.
Dieses Protokoll ergänzt die traditionellen westlichen Blot-Techniken, überwindet die Probleme geeigneter Ladekontrollen und Vergleiche über experimentelle Chargen hinweg und bietet Flexibilitäten für die Proteinexpressionsanalyse. Dieser Ansatz kann auf den Vergleich der Proteinexpression unter anderen experimentellen Bedingungen ausgedehnt werden.
