يمكن استخدام هذا البروتوكول لمعالجة الأسئلة الهامة في البحوث الأساسية والسريرية من خلال النظر في التعبير البروتيني عبر الأنسجة ونقاط الزمن المختلفة. لتنفيذ كمية موثوقة النشاف الغربية، ونحن الجمع بين وصمة عار البروتين الكلي الفلورسنت مع عنصر تحكم التحميل الداخلية. هذا يتغلب على القيود التي تنشأ عند مقارنة الأنسجة المختلفة عبر الظروف التجريبية.
لاستخراج البروتينات من عينات الخلايا أو الأنسجة المجمدة ، اذاب العينات ناقص 80 درجة على الجليد قبل غسل العينات حسب الاقتضاء ، وفقا للجدول. باستخدام المجانسة الكهربائية المحمولة مع مبيد البولي بروبلين، التجانس العينات غسلها، شطف الآفات في الماء المقطر المزدوج وتجفيف مع الأنسجة النظيفة بين العينات. اترك العينات على الجليد لمدة 10 دقائق، تليها الطرد المركزي.
ثم، نقل البروتين عينة التي تحتوي على supernatant إلى أنبوب جديد على الجليد دون إزعاج بيليه. لتحديد كمي من تركيز البروتين، ووضع معايير الألبومات مصل الأبقار في زيادة تركيزات في ثلاث نسخ، وإضافة ميكرولتر واحد من كل عينة البروتين في مكررة إلى الآبار المناسبة من لوحة بصرية 96 جيدا. احتضان البروتين على كتلة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو أكثر إذا كان من المتوقع أن يكون تركيز البروتين منخفضًا وقياس الامتصاص عند 560 نانومتر على قارئ لوحة.
تصدير قياسات قارئ لوحة وحساب تركيز البروتين من خلال مقارنة متوسط قيم الامتصاص لكل عينة إلى منحنى قياسي تم الحصول عليها باستخدام معيار البروتين. لتطبيع كمية البروتين، وإعداد التخفيفات من عينات البروتين في المخزن المؤقت للعينة والمياه النقية للغاية واحتضان العينات في كتلة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ضع العينات على الجليد قبل الدوامة والطرد المركزي لفترة وجيزة.
بالنسبة للكهربية، قم بإعداد هلام متدرج من أربعة إلى 12٪ Bis-Tris في نظام الحجرة الكهربائية الهلامية وتحميل 3.5 ميكرولترات من معيار البروتين في البئر. عند استخدام معيار داخلي للتطبيع بين الغشاء، قم بتحميل كمية تساوي العينات الأخرى في الآبار الثلاثة الأولى بجوار سلم البروتين وتحميل 30 ميكروغرام من كل عينة في الآبار المتبقية. ثم، تشغيل العينات من خلال هلام التراص في 80 فولت لمدة 10 دقائق تليها 150 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة إضافية.
في نهاية electrophoresis، لتجميع كومة نقل، ووضع هلام البروتين على كومة أسفل تحتوي على غشاء ثنائي فلوريد بولي فينيلايدين تليها ورقة التصفية. استخدام الأسطوانة النشاف لإزالة أي فقاعات الهواء ووضع كومة أعلى على الجزء العلوي من ورقة التصفية قبل المتداول المكدس مرة أخرى لإزالة فقاعات الهواء. نقل المكدس كله إلى جهاز نقل مع القطب على الجانب الأيسر من الجهاز ووضع الإسفنج هلام على رأس المكدس بحيث يتم محاذاة الاسفنج مع الاتصالات الكهربائية المقابلة على الجهاز.
بعد إغلاق الغطاء، حدد البرنامج المناسب وابدأ تشغيله. في نهاية البرنامج ، قم بقطع الغشاء إلى حجم الجل وغسل الغشاء المقطوع بسرعة بالماء المقطر المزدوج قبل الاستمرار في وصمة البروتين الإجمالية. بالنسبة إلى تلطيخ البروتين الكلي ، الف الغشاء إلى أنبوب 50 ملليلتر مع جانب البروتين الذي يواجه الداخل وتسمية الغشاء بخمس ملليلتر من محلول وصمة عار البروتين على الأسطوانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان.
في نهاية الحضانة ، اغسل الغشاء بسرعة بخمسة ملليلترات من محلول الغسيل ، ويعيد الأنبوب لفترة وجيزة إلى الأسطوانة بين الغسيل ، يليه شطف قصير مع مياه نقية للغاية. إضافة ثلاثة ملليلتر من العازلة حظر إلى الغشاء والعودة الغشاء إلى الأسطوانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استبدال العازلة حظر مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في التركيز الأمثل المناسب واحتضان الغشاء على الأسطوانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، اغسل الغشاء ست مرات لمدة خمس دقائق مع خمسة ملليلترات من PBS الطازجة لكل غسل على الأسطوانة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير، احتضان الغشاء مع حل الأجسام المضادة الثانوية المناسبة على الأسطوانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل لمدة 30 دقيقة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، جفف الغشاء واستخدم رقائق الألومنيوم للحفاظ على الغشاء المحمي من الضوء.
للحصول على الصورة، ضع الغشاء على الماسح الضوئي مع توجيه جانب البروتين لأسفل وحدد منطقة المسح الضوئي في البرنامج. ثم، الحصول على الصور في كل من القناتين وتصدير الصور إلى برنامج مناسب لتحليل الصور. عرض قناة 700 نانومتر لإظهار مجموع نتيجة تلطيخ البروتين وحدد تحليل ورسم مستطيل لتحديد المنطقة ذات الأهمية للتطبيع.
ثم نسخ ولصق منطقة المستطيل الأول على كل عينة الفردية لضمان المنطقة المحددة هو نفس الحجم لجميع الممرات تحليلها. لتحديد كمية تركيز البروتين في كل حارة، انسخ النتائج من كل من مجموع وصمة عار البروتين والبروتين الذي يهم لبرنامج جدول البيانات وتحديد أعلى إشارة وصمة عار البروتين الكلي. ثم، قم بتقسيم قيمة إشارة بقعة البروتين الإجمالية حسب هذه القيمة للحصول على قيمة تحميل البروتين الطبيعية وتقسيم قيمة إشارة 800 نانومتر من كل عينة فردية حسب قيمتها البروتينية العادية المقابلة لحساب نسبة التعبير البروتيني النسبي في عينات مختلفة.
في هذه البقع الغربية التمثيلية، يتم مقارنة البروتينات المستخرجة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من يوم ما بعد الولادة خمسة فئران بالبروتينات المستخرجة من الفئران البالغة التي يبلغ عمرها 10 أسابيع. تم تحقيق القياس الكمي بكثافةة الفلورية من مجموع وصمة عار البروتين من خلال قياس شدة الفلوريسنس داخل مربع المستطيل على كل حارة. عند تحليل الممرات بأكملها، تظل شدة الفلوريسين متشابهة نسبيًا عبر العينات، مما يشير إلى أن استخدام وصمة البروتين الإجمالية للتطبيع مناسب لهذا الغرض.
ويمكن أيضا أن تستخدم وصمة عار البروتين الفلورسنت الكلية لمقارنة مستويات البروتين في نقاط زمنية مختلفة للتنمية. على سبيل المثال، على الرغم من أن مستويات البروتين العصبي الحري على قيد الحياة تنخفض بوضوح مع التقدم في العمر في الفئران، فإن إجمالي الكم الملون بالبروتين لا يزال ثابتًا. إن استخدام المعايير الداخلية، والتطبيع القائم على الفلور، والإحصاءات الكافية يزيد من قوة تحليل التعبير البروتيني المعقد عبر الظروف المختلفة.
ويضيف هذا البروتوكول إلى تقنيات البقع الغربية التقليدية، والتغلب على قضايا الضوابط التحميل المناسبة والمقارنات عبر دفعات تجريبية، وتوفير المرونة لتحليل التعبير البروتيني. ويمكن توسيع نطاق هذا النهج لمقارنة التعبير البروتيني في ظل ظروف تجريبية أخرى.
