Dieses Protokoll zeigt, dass Strahlung die extrazellulären Matrixeigenschaften des Fettgewebes im murinen Brustfettpad beeinflusst. Die Zugabe von Strahlung in einem Dezellularisierungsmodell wurde bisher nicht durchgeführt. Diese Technik verwendet mehrere Waschschritte, die jeweils einem einzigartigen chemischen Zweck im Dezellularisierungsprozess dienen.
Die Spezifität dieser Technik ermöglicht sanftere chemische Spülungen, um die Gewebeeigenschaften besser zu erhalten. Brustkrebs-Rückfall tritt nach der Therapie auf, vor allem in dreifach negativen Fällen. Die Bewertung, wie die bestrahlte extrazelluläre Matrix das Verhalten von Tumorzellen verändert, führt zu wichtigen Entdeckungen über Rezidivmechanismen.
Nach der Bestrahlung von Proben, mit einer Cäsiumquelle, übertragen Sie die bestrahlten MFP und komplette RPMI-Medien in einen Biosicherheitsschrank. Füllen Sie sechs Zentimeter oder 10 Zentimeter Geschirr mit genügend Medien, um die MFP zu versenken. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, mit 5% Kohlendioxid, für zwei Tage.
Platzieren Sie zunächst die MFP es in sechs Zentimeter großen Gerichten mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA-Lösung. Die Teller mit 70% Ethanol besprühen und abwischen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius brüten. Verwenden Sie 0,7 Milliliter-Siebe, um die MFP mit entionisiertem Wasser zu waschen, indem Sie dreimal Wasser über das Gewebe gießen.
Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Wärten manuell zu massieren. Als nächstes trocknen Sie das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz und wiegen. Legen Sie das getrocknete Gewebe in einen vorautoklavierten Becher, der einen entsprechend großen Rührstab enthält, und bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern 3%t-Octylphenoxypolyethethanol pro Gramm Gewebe.
Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Dann den Inhalt des Bechers in ein Sieb werfen. Spülen Sie den Becher mit entionisiertem Wasser und gießen Sie es auf das Gewebe.
Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zwei weitere Male, stellen Sie sicher, dass Zangen verwenden, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren. Danach das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen. Legen Sie die Gewebe und die Rührstäbe wieder in die gleichen Becher und bedecken Sie sie mit 60 Millilitern 4%Desoxycholsäure pro Gramm Gewebe.
Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Als nächstes den Inhalt des Bechers in ein Netzsieb werfen, den Becher mit entionisiertem Wasser abspülen und auf das Gewebe gießen. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zwei weitere Male, stellen Sie sicher, dass Zangen verwenden, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.
Das spülende Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und abwischen. Legen Sie die getrockneten Gewebe in das gleiche Becherglas, zusammen mit frischem deionisiertem Wasser, ergänzt mit 1%Penicillin-Streptomycin. Den Becher fest mit Paraffinfolie bedecken und bei 4 Grad Celsius über Nacht verlassen.
Am nächsten Tag den Becherinhalt in ein Sieb abtropfen lassen, das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen. Legen Sie dann die MFP es in den gleichen Becher mit einer entsprechenden Größe Rührstange. Bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern einer Lösung, die 4% Ethanol und 0,1% Peressigsäure pro Gramm Gewebe enthält.
Bei Raumtemperatur zwei Stunden rühren. Den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb zu werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren und den Inhalt wieder in den Becher zu legen.
Waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Millilitern 1X PBS pro Gramm Gewebe bedecken. 15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang noch einmal.
Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb. Mit Zangen das Gewebe manuell massieren und den Inhalt wieder in den Becher legen. Waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Milliliter entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.
15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang noch einmal. Das gewaschene Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen.
Dump das Gewebe und den Inhalt in ein Sieb und verwenden Zange, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher und decken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern 100%n-Propanol pro Gramm Gewebe ab. Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren.
Dann trocknen Sie das Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz und wiegen Sie es. Dump das Gewebe und den Inhalt in ein 0,7-Millimeter-Sieb und verwenden Zange, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in das Becherglas und waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Milliliter entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.
15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal. Danach das Gewebe bei einer heiklen Aufgabe kurz trocknen und abwischen.
Übertragen Sie das Gewebe in eine beschriftete 15-Milliliter-Röhre und frieren Sie bei negativen 80 Grad Celsius über Nacht ein. Füllen Sie zunächst einen flachen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Entfernen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und wiegen Sie jedes lyophilisierte MFP.
Legen Sie eine Probe in den Mörtel, verwenden Sie einen kryogenen Handschuh, um den Mörtel im flüssigen Stickstoff zu halten. Verwenden Sie dann einen Stößel, der an einem Handbohrer befestigt ist, um die Probe zu fräsen. Fräsen Sie in einem Minutentakt, um den Fortschritt zu überprüfen und die handgeliebte Hand aus dem flüssigen Stickstoff zu entfernen.
Wiederholen Sie diesen Fräsvorgang für alle Proben, und achten Sie darauf, den Mörtel und den Stößel mit Ethanol zwischen jeder Probe zu sprühen und abzuwischen. Bewahren Sie die pulverförmigen Proben in 15 Milliliter-Rohren bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit sind. Zunächst die Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur auftauen.
Während die Proben auftauen, mischen Sie Pepsin in Salzsäure, um eine Pepsin-HCL-Lösung zu bilden. Als nächstes Probenpulver und die Pepsin-HCL-Lösung in ein 15-Milliliter-Rohr geben, einen kleinen Rührstab hinzufügen und 48 Stunden rühren. Danach die Rohre für fünf Minuten auf Eis legen.
Fügen Sie jeder Probe 10X PBS hinzu, sodass die endgültige Lösung eine Konzentration von 1X PBS aufweist. Fügen Sie dann 10% Volumen/Volumen, 0,1 molches Natriumhydroxid zu jeder Lösung hinzu, um pH 7,4 zu erreichen, wobei pH-Papier verwendet wird, um jede Lösung einzeln zu testen. Mit einer pH 7,4-Gel-Lösung setzen Sie das pelletierte GFP und die mit 4T1-Zellen gekennzeichnete Luziferase auf eine Konzentration von entweder 500, 000 oder 1 000 000 Zellen pro Milliliter Gellösung aus.
Fügen Sie 16 Mikroliter Gelzelllösung zu jedem Brunnen einer 16-Well-Kammerrutsche hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Danach fügen Sie 100 Mikroliter komplette RPMI-Medien zu jedem Brunnen hinzu. Weiter bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden inkubieren.
Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen bei einer Anregungswellenlänge von 519 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 618 Nanometern zu beobachten. In dieser Studie werden normale Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen untersucht. Hämatoxylin und Eosin Färbung wird verwendet, um die Dezellularisierung zu bestätigen, durch den Verlust von Kernen und anderen Spuren von DNA.
Während Oil Red O Färbung verwendet wird, um den Lipidgehalt zu bewerten und die Retention einer Dipasitmorphologie zu bestätigen. Die rheologischen Eigenschaften der ECM-Hydrogele werden bei 37 Grad Celsius bewertet. Der Speichermodul ist höher als der Verlustmodul für alle Bedingungen, was eine stabile Hydrogelbildung zeigt.
GFP und Luziferase mit der Bezeichnung 4T1-Mammakarzinomzellen werden dann in den Hydrogelen verkapselt. Die Zellproliferation wird 48 Stunden nach der Verkapselung durch Fluoreszenzmikroskopie, durch Beleuchtungsmessung und Lebensfähigkeitsfärbung untersucht. Bestrahlte Hydrogele zeigen einen zunehmenden Trend bei der Tumorzellproliferation.
Phalloidin-Konjugat wird verwendet, um F-Actin in den gekapselten Zellen zu visualisieren. Denken Sie daran, den Mörtel zu kühlen, bevor Sie das Gewebe in der Mühle platzieren, ein warmer Mörtel kann zu unvollständigem Fräsen führen. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit n-Propanal und Pepsin, nur öffnen n-propanal und andere dezellularisationäre Mittel unter einer chemischen Haube.
Wiegen Sie das Pepsin nach Möglichkeit unter einer chemischen Haube, da die Gefahr des Einatmens besteht. ECM-Zusammensetzungsänderungen nach Bestrahlung und Dezellularisierung können mittels Massenspektrometrie und Raman-Spektroskopie ausgewertet werden. Darüber hinaus kann die Faserstruktur der ECM-Hydrogele durch Rasterelektronenmikroskopie analysiert werden.
Diese Methode hat das Potenzial, erweitert zu werden, um die Auswirkungen von Strahlung auf nicht nur Tumorzellen, sondern auch Immunzellen, sowie Gewebe, die Strahlenschäden erleben, als Ergebnis der Therapie zu untersuchen. Diese Dezellularisierungstechnik wird es den Forschern ermöglichen, die extrazellulären Matrixeigenschaften des Gewebes nach der Strahlung zu bewerten, was bei den meisten Krebsarten eine wichtige Behandlungsoption ist.
