Этот протокол показывает, что излучение влияет на внеклеточные матричные свойства жировой ткани в мурине молочной жировой прокладки. Добавление излучения в модель децеллюляризации не было сделано раньше. Этот метод использует несколько шагов стирки, каждый из которых служит уникальной химической цели в процессе децеллюляризации.
Специфика этого метода позволяет более мягко химическое мытье, чтобы лучше сохранить свойства тканей. Рак молочной железы рецидив происходит после терапии, особенно в тройных негативных случаях. Оценка того, как облученая внеклеточная матрица изменяет поведение опухолевых клеток, приведет к важным открытиям о механизмах рецидивов.
После облучения образцов, используя источник цезия, передать облученных MFP и полный RPMI средств массовой информации в кабинет биобезопасности. Заполните шесть сантиметров или 10 сантиметров тарелки с достаточным количеством средств массовой информации, чтобы погрузить MFP's. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию, с 5%углекислым газом, в течение двух дней.
Во-первых, поместите MFP в шестиметровой посуде с пятью миллилитров решения Trypsin-EDTA. Спрей и протрите посуду с 70% этанола и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Используйте 0,7 миллилитровых ситечкой для мытья MFP с деионизированной водой, наливая воду над тканью три раза.
Используйте типсы, чтобы вручную массировать ткани между моет. Далее, кратко высушить ткань на деликатной задачей протрите и взвесить его. Поместите высушенные ткани в предварительно автоматический стакан, содержащий соответствующий размер перемешать бар и покрыть ткани с 60 миллилитров 3%t-octylphenoxypolyethoxyethanol на грамм ткани.
Перемешать в течение одного часа при комнатной температуре. Затем сбросите содержимое стакана в ситечко. Промыть стакан деионизированной водой и залить его на ткани.
Повторите этот процесс полоскания еще два раза, убедившись, что использовать типсы вручную массаж ткани между полосканиями. После этого, кратко высушить ткань на деликатной задачей протрите и взвесить. Поместите ткани и бары перемешать обратно в те же стаканы и покрыть их 60 миллилитров 4%деоксихолевая кислота на грамм ткани.
Перемешать при комнатной температуре в течение одного часа. Затем сбросите содержимое стакана в сетчатый ситечко, промойте стакан деионизированной водой и вылейте его на ткани. Повторите этот процесс полоскания еще два раза, убедившись, что использовать типсы вручную массаж ткани между полосканиями.
Кратко высушите промытую ткань на деликатной задаче протрите и взвесите ее. Поместите высушенные ткани в тот же стакан, вместе со свежей деионизированной водой, дополненной 1%пенициллин-стрептомицин. Обложка стакан плотно с парафиновой пленкой и оставить при 4 градусах по Цельсию на ночь.
На следующий день слейте содержимое стакана в ситечко, кратко высушите ткань на деликатной задаче протрите и взвесите ее. Затем поместите MFP в тот же стакан с соответствующим размером перемешать бар. Обложка ткани с 60 миллилитров раствора, содержащего 4%этанола и 0,1% ператетической кислоты на грамм ткани.
Перемешать при комнатной температуре в течение двух часов. Сбросите содержимое стакана в 0,7-миллиметровый ситечко. Используйте типсы, чтобы вручную массировать ткани и поместить содержимое обратно в стакан.
Вымойте ткань, покрыв ее 60 миллилитров 1X PBS на грамм ткани. Перемешать при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите весь этот процесс стирки еще раз.
Затем сбросите содержимое стакана в 0,7-миллиметровый ситечко. Используя типсы, вручную массируйте ткани и поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 миллилитров деионизированной воды на грамм ткани.
Перемешать при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите весь этот процесс стирки еще раз. Кратко высушите промытую ткань на деликатной задаче протрите и взвесите ее.
Свалить ткани и содержимое в ситечко и использовать миппы для ручного массажа тканей. Поместите содержимое обратно в стакан и покройте ткани 60 миллилитров 100%n-пропанола на грамм ткани. Перемешать при комнатной температуре в течение одного часа.
Затем, кратко высушить ткань на деликатной задачей протрите и взвесить его. Сбросите ткань и содержимое в 0,7-миллиметровый ситечко и используйте типсы для ручного массажа тканей. Поместите содержимое обратно в стакан и мыть ткани, покрывая его 60 миллилитров деионизированной воды на грамм ткани.
Перемешать при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите этот процесс мытья три раза. После этого, кратко высушить ткань на деликатной задачей протрите и взвесить его.
Перенесите ткань в помеченную 15 миллилитровую трубку и заморозьте при минус 80 градусах по Цельсию на ночь. Во-первых, заполнить мелкий контейнер с жидким азотом. Удалите образцы из морозильной камеры и взвесить каждый лиофилизированных MFP.
Поместите один образец в раствор, используйте криогенную перчатку, чтобы держать раствор в жидком азоте. Затем используйте пестик, прикрепленный к ручной дрелью, для фрезерования образца. Мельница в одну минуту интервалы, чтобы проверить прогресс и удалить перчатку руку из жидкого азота.
Повторите этот процесс фрезерования для всех образцов, убедившись, что спрей и протрите раствор и пестик с этанолом между каждым образцом. Храните порошкообразные образцы в 15 миллилитровых трубках при отрицательном 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию. Для начала удалите образцы из морозильной камеры и оттаивать при комнатной температуре.
В то время как образцы оттаивают, смешайте пепсин в соляную кислоту, чтобы сформировать раствор Pepsin-HCL. Затем добавьте образец порошка и раствор Pepsin-HCL в 15-миллилитровую трубку, добавьте небольшой батончик и перемешайте в течение 48 часов. После этого поместите трубки на лед на пять минут.
Добавьте 10X PBS к каждому образцу, так что окончательное решение имеет концентрацию 1X PBS. Затем добавьте 10%volume/volume, 0.1 молярный гидроксид натрия к каждому раствору, чтобы достичь pH 7.4, используя бумагу pH для проверки каждого решения индивидуально. Используя раствор рН 7,4 геля, повторно посовещен гранулированное GFP и люцифераза помечены 4T1 клеток в концентрации либо 500000 или 1000000 клеток на миллилитр геля раствора.
Добавьте 16 микролитров раствора гель-клеток к каждому колодец 16-хорошо камерной горки и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После этого добавьте 100 микролитров полного RPMI-медиа к каждой колодец. Продолжайте инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов.
Затем используйте флуоресцентный микроскоп для наблюдения за клетками на восклицающей длине волны 519 нанометров и длине волны выбросов 618 нанометров. В этом исследовании, нормальные эффекты излучения тканей изучаются, используя внеклеточные матричные гидрогели. Гематоксилин и эозин окрашивание используется для подтверждения децеллюляризации, через потерю ядер и других следов ДНК.
В то время как масло Красного O окрашивания используется для оценки содержания липидов и подтвердить сохранение морфологии дипасита. Реологические свойства гидрогелей ЭКМ оцениваются в 37 градусов по Цельсию. Модуль хранения выше, чем модуль потери для всех условий, демонстрируя стабильное образование гидрогеля.
GFP и люцифераза помечены 4T1 клетки молочной карциномы затем инкапсулируются в гидрогелях. Распространение клеток изучается с помощью микроскопии флуоресценции, измерениями иллюминации и окрашивания жизнеспособности, через 48 часов после инкапсуляции. Облученые гидрогели показывают растущую тенденцию к распространению опухолевых клеток.
Фаллоидин конъюгируется используется для визуализации F-Actin в инкапсулированных клетках. Не забудьте охладить раствор перед размещением ткани внутри мельницы, теплый раствор может привести к неполному фрезеровать. Используйте осторожность при обращении с n-пропанальным и пепсином, только открытым n-пропанальным и другими децеллюлярными агентами под химическим капотом.
Если возможно, взвесить пепсин под химическим капюшоном, так как существует опасность вдыхания. Изменения состава ЭКМ после облучения и децеллюляризации можно оценить с помощью масс-спектрометрии и рамановской спектроскопии. Кроме того, структуру волокна гидрогелей ECM можно проанализировать путем сканирования электронной микроскопии.
Этот метод имеет потенциал для расширения для изучения воздействия радиации на не только опухолевые клетки, но и иммунные клетки, а также ткани, которые испытывают повреждения излучения, в результате терапии. Этот метод децеллюляризации позволит исследователям оценить внеклеточные матричные свойства ткани после облучения, что является важным вариантом лечения в большинстве видов рака.
