Dieses Protokoll ist unsere zellbasierte Methode zur Cholesterinbeendigung des Cholesterinrefluxes im ceramalen Plasma. Vor allem bei Screenings. Dies kann angewendet werden, um kardiovaskuläre samtolare Risiken zu diagnostizieren, und cholesterinsenkende Erhaltung zu identifizieren oder zu bewerten.
Diese Technik vermeidet das Risiko und die Belastungen, da die Sicherheit mit dem Umgang mit abgestrahlten Materialien durch die Bereitstellung von Ergebnissen mit vergleichbaren Qualitätsniveaus, zu denen von Cholesterin-Reflux wurde berichtet, um mit So, das Plasma oder ceramal Cholesterin Reflux der akzeptierten verglichen werden kann, um unsere Referenzkontrolle und kann das Risiko, von dieser Methode leiden wird auch auf die Zelllinien angewendet werden , wie andere menschliche Zelllinien oder sogar primäre Makrophasen. Makrophasen oder und vom Menschen induzierte Sprühknopfstammzellen. Um dieses Verfahren zu beginnen, lösen Sie das NPD-Cholesterin in reinem Ethanol auf, um eine Stofflösung mit einer Endkonzentration von zwei Mikromolaren zu erhalten.
Verdünnen Sie 25 Mikroliter des NBD-Cholesterinbestands in AR 10 medium, um eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen. Kultur thp-1 Zellen in unserem 10 Medium bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Passen Sie alle drei Tage die Zelldichte auf 300000 Zellen pro Milliliter an.
Dann erhalten Sie eine 96-Well-Platte mit einem flachen klaren Boden. Für eine bessere Homogenisierung 10 Milliliter thp-1-Zellen in einem 15-Milliliter-Rohr vorbereiten und 200 Mikroliter PMA-Bestand hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig und säen Sie 100 Mikroliter der Mischung in die Plattenbrunnen bei 200. 000 Zellen pro Brunnen.
Und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden inkubieren, um die thp-1-Zellen in DM-Thp-1-Zellen zu differenzieren. Zunächst Glycin in 10%PBS mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 200 Mikromolaren bei pH 7,4 verdünnen. Fügen Sie 40 Milliliter verdünntes Glycin zu 10 Gramm Peg 8000 hinzu, um eine 20%peg Lösung vorzubereiten, und mischen Sie kräftig, um zu homogenisieren.
Als nächstes wenden Sie vier Teile von 20% pro 10 Teile der Probe auf jedes Serum oder Plasmaprobe in einem 1,5 ml Tube. Lassen Sie die Mischung für 25 Minuten auf Eis. Zentrifugieren Sie den Peg apolipoprotein B bei 13000 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.
Entsorgen Sie den Niederschlag und übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr. Holen Sie sich die Platte, die die differenzierten thp-1-Zellen enthält. Entfernen und verwerfen Sie das Kulturmedium, und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 1X PBS.
Fügen Sie 100 Mikroliter von 5 Mikromolaren MVD-Cholesterin in AR-10 Medium zu jedem Brunnen. Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Verwerfen Sie am nächsten Tag das Medium.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, und fügen Sie dann 100 Mikroliter ABDS, oder gereinigten Lipid-Akzeptor in rpmi 1630 Medium verdünnt, um die gewünschte Konzentration zu jedem Brunnen. Fügen Sie eine negative Kontrolle, die keine Cholesterin-Akzeptoren enthalten, in eine positive Kontrolle ein, wie im Textprotokoll beschrieben, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für vier bis sechs Stunden. In der Zwischenzeit bereiten Sie einen 200 Milliliter Vorrat an Zelllyselösung eins, wie im Text beschrieben.
Mischen Sie diese Lösung mit Ethanol, in einem 1:1-Volumenverhältnis, um auch eine Lyselösung zu erhalten. Für die Medien- und BD-Cholesterindetektion entfernen Sie das Zellmedium von den Platten, die in einer neuen weißen 96-Well-Platte mit einem undurchsichtigen flachen Boden gesammelt wurden. Fügen Sie 100 Mikroliter reines Ethanol zu 100 Mikrolitern jeder medium Probe hinzu, um ein Eins-zu-Eins-Verhältnis in der neuen Platte zu erhalten.
Messen Sie mit Hilfe eines Beleuchtungsometers die Intensität der Fluoreszenz bei einer Anregung von 463 Nanometern und einer Emission von 536 Nanometern. Für den intrazellulären NBD-Cholesterinnachweis, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie 100 Mikroliter Lyse-Lösung zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei Raumtemperatur, während sie 25 Minuten schütteln.
Danach messen Sie die Intensität des Fluoreszenzes, während Sie den Empfindlichkeitsparameter in der Software auf 50 einstellen. Bestimmen Sie dann die Cholesterin-Effizienz im letzten Maß des Cholesterin-Efflux, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Verdünnung des NBD-Cholesterins in reinem Ethanol erzeugt die höchsten Fluoreszenzintensitätswerte, während ein hoher Gehalt an wässriger Lösung die Intensität senkt.
Dies deutet darauf hin, dass die Fluoreszenzemission dieses Moleküls in hohem Maße vom Medium abhängt, in dem es enthalten ist. Bei verwendung einer Mischung aus Medien und Ethanol im Verhältnis eins zu eins scheint die Intensität des Fluoreszenzes proportional zu zunehmen, mit einer Konzentration des Cholesterinanalogs, was darauf hindeutet, dass sich die Sonde unter diesen Bedingungen angemessen verhält. Um die Zeit zu bestimmen, die benötigt wird, um die geladenen Zellen mit Cholesterin-Akzeptoren zu bebrüten, werden Zellmedien zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet.
Der Cholesterin-Efflux entwickelte sich linear von null auf sechs Stunden, wobei das maximale Signal sechs Stunden nach der Zulage von ABDS zu den Zellen erfasst wurde. Die Sättigungsschwelle und der Dynamikbereich werden durch Messung des Cholesterinausflusses an unterschiedlichen Prozentsätzen von HDL-haltigen Medien getestet. Im Hochdurchsatz-Asset entwickelt sich der Efflux linear von einem bis 7%ABDS und erreicht den Höhepunkt der Cholesterin-Efflux-Kapazität bei 7%Bei Konzentrationen von mehr als 7% nimmt die Intensität des Fluroeszenzinals in einer umgekehrten Beziehung mit dem ABDS-Prozentsatz ab.
Die Leistung der fluoreszenzbasierten Methode wird dann durch Einen Vergleich mit der standardmäßigen radiomarkierten Technik bewertet. Beide Techniken sind stark korreliert, wenn unterschiedliche Konzentrationen von ABDS verwendet werden. Die beschriebene Methode ist empfindlich auf eine Erhöhung der Akzeptanzkonzentrationen innerhalb der Cholesterin-Efflux-Werte zwischen fünf und 15%Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Celluarizer keine Aggregate enthält.
Kritischer Punkt ist die Einfeinerung einer ethanolhaltigen Gesamtumgebung, um die Fluoreszenz in einem homogenen und optimalen Gewicht zu messen. Nach diesem Verfahren kann der Name technisches Cholesterin gemessen werden, und die Wirkung von Medikamenten im Cholesterin-Efflux-Signalweg kann bestimmt werden. Auch die Schule schließlich als Diagnose verwendet werden, um Herz-Kreislauf-Risiko zu asses.
Wir glauben, dass diese Methode viel einfacher und sicherer ist als die radioaktive Standardmethode. Es ist jedoch immer noch zellabhängig. Bitte denken Sie daran, dass Ethanol entzündlich ist und entsprechend gelagert und behandelt werden sollte.
