Keio-Sammlung-Sorten stammen aus dem nationalen BioResource Projekt (NIG, Japan): E. Coli. Wir danken Dirk Linke (Institut für Biowissenschaften, Universität Oslo) für seine kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den Forschungsrat von Norwegen Young Researcher Grant 249793 (zu Jack C. Leo) finanziert.

(1) Stämme und Plasmide
<ol><li>
Bakterienstämme
	<ol>
<li>Verwenden Sie die E. Coli -Stämme BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7BL21(DE3)20und BL21ΔABCF21. Weitere Informationen finden Sie in der Tabelle der Materialien .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bakteriophagen
	<ol>
<li>Die allgemeine Transduktion Phage P1Vir dient. Das Bakterium als eine Flüssigkeit Lager mit ein paar Tropfen Chloroform zu speichern (siehe Punkt 2.2). Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmide
	<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden Plasmide in diesem Protokoll: pCP2022, pIBA2-YadA23und pEibD1024. Verwenden Sie als Kontrolle Plasmide pASK-IBA2 und pET22b (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Wachstumsbedingungen
	<ol>
<li>Bakterien in einer Lysogeny Brühe (LB) mittlere25 mit kräftig schütteln (180 – 200 u/min) bei 37 ° C oder 30 ° C im Falle von BL21ΔABCF und Stämme mit pCP20 zu verbreiten.</li>
		<li>Führen Sie Plasmid Härtung bei 43 ° C.</li>
		<li>Für ein solides Medium LB mit 1 % Agar (w/V) zu ergänzen.</li>
		<li>Für obere Agar LB mit 0,7 % Agar und 10 mM CaCl2 und Autoklaven das Medium zu ergänzen. Verwenden Sie SOC-Medium für die Erholung nach Electroporation26.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden Konzentrationen für Antibiotika: 100 μg/mL für Amp und 25 μg/mL für Kan</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung einer Phagen Lysate
<ol><li>
Infektion des Spenders Stamm
	<ol>
<li>Wachsen die Spender-Stamm JW4197 in 5 mL LB-Medium ergänzt mit 10 mM CaCl2 und optional mit Kan (25 µg/mL) zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) ~ 1.0. Messen Sie OD600 Wert mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Machen Sie eine Verdünnungsreihe von einer vorhandenen P1 Phage bestand in der LB-Medium: Empfohlene Verdünnungen sind zwischen 10-3 bis 10-7.</li>
		<li>Mix 200 μL der Bakteriensuspension und 100 μl einer bestimmten Phagen-Verdünnung in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen oder ähnlichem. Bereiten Sie so viele Rohre als Phagen Verdünnungen. Inkubieren Sie die Rohre für 20 min bei 37 ° C ohne schütteln.</li>
		<li>Fügen Sie hinzu ~ 3 mL geschmolzene obere Agar (~ 50 ° C) ergänzt mit 10 mM CaCl2 an den Rohren, mischen Sie die Inhalte durch aufschütteln der Rohre kurz und Gießen Sie die Mischungen auf vorgewärmte Teller der LB auch Schichten zu machen.</li>
		<li>Die Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate Vorbereitung
	<ol>
<li>Am nächsten Tag wählen Sie einen Teller mit einem semi-konfluierende Wachstum von Phagen Plaques. Auf einem semi-konfluierende Teller, etwa die Hälfte die Fläche der Platte ist klar (Abbildung 3).</li>
		<li>Kratzen Sie die obere Agar-Schicht aus solch einer Platte mit einem Impfschlinge oder einem ähnlichen Werkzeug und legen Sie die obere Agar in ein Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 – 2 mL LB und einen Tropfen Chloroform und Vortex Rohr energisch für ~ 1 min. hinzufügen das Chloroform in einer Dampfhaube.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr für 15 min bei 4.000 x g oder schneller zu Agar und Bakterienzellen Pellets.</li>
		<li>Bewegen Sie den überstand zu einem frischen Microcentrifuge Schlauch, Vermeidung von jeglichen Schmutz von der Pellet Übertrag. 2 Tropfen Chloroform und speichern Sie die lysate bei 4 – 10 ° C. Chloroform in einer Dampfhaube hinzufügen. Nicht Einfrieren der Phagen lysate da dies zu einer deutlichen Verringerung der Zahl der infektiöse Partikel führt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestimmung der lysate titer
	<ol>
<li>Wachsen Sie BW25113 in LB ergänzt mit 10 mM CaCl2 bei 37 ° C, bis die Kultur eines OD600 ~ 1,0 erreicht.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von den Phagen lysate in LB (z.B. 10-6– 10-9). Hinweis: Seien Sie vorsichtig, pipettieren der Probe vom oberen Rand der lysate zu vermeiden Übertragung von Chloroform auf die Verdünnungen.</li>
		<li>Mix 200 μL der Bakteriensuspension und 100 μl einer bestimmten Phagen-Verdünnung in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen oder ähnlichem. Bereiten Sie so viele Rohre als Phagen Verdünnungen. Inkubieren Sie die Rohre für 20 min bei 37 ° C ohne schütteln.</li>
		<li>Fügen Sie hinzu ~ 3 mL geschmolzene obere Agar (~ 50 ° C) ergänzt mit 10 mM CaCl2 an den Rohren, mischen Sie die Inhalte durch aufschütteln der Rohre kurz und Gießen Sie die Mischung auf vorgewärmte Teller der LB auch Schichten zu machen.</li>
		<li>Die Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Am nächsten Tag die Anzahl der Plaketten (klare Regionen in die bakterienmatte) für jede Platte und der Titer von lysate mithilfe der folgenden Formel berechnen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg"> Beispiel: Auf Tellern mit Verdünnungen 10-710-8und 10-9gibt es 231, 27 und 2 Plaketten, beziehungsweise. Als 100 μL jeder Verdünnung für die Infektion verwendet wurde, und weil der Titer als Plaque-Bildung zum Ausdruck kommt (Pfu) Einheiten / mL, die Beschichtung Faktor ist 10. Diese Zahlen werden in die Formel eingegeben: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg"> Der Titer ist also ca. 2 x 1010 infektiösen Phagen Partikel/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) P1 Transduktion
<ol><li>
Vorbereitung der empfängerzellen
	<ol>
<li>Wachsen die Empfänger Dehnung BL21ΔABCF in LB ergänzt zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) ~ 1.0. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um OD600 Wert zu messen.</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen der lysate Phagen notwendig, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI) Wert von 0,5 zu erreichen. Um das MOI zu berechnen, schätzen Sie die Zahl der Bakterien, die basierend auf der OD600 der Kultur. Davon gehen Sie aus, dass ein OD-600 -Wert von 1,0 bis ~ 109 KBE/mL entspricht. Berechnen Sie das Volumen erforderlich, basierend auf der bekannten Titer von der lysate. Beispiel (basierend auf den Titer im Beispiel nach Schritt 2.3.6 berechnet): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg">
</li>
		<li>Die Empfänger-Stamm-Kultur bis 10 mM CaCl2 hinzufügen und mischen. 1 mL der Kultur für die Transduktion einnehmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchführung von Transduktion
	<ol>
<li>1 mL der Empfänger Kultur (einschließlich CaCl2 bei 10 mM) wie in Schritt 3.1.2 berechnet das entsprechende Volumen der Phagen lysate hinzufügen und vorsichtig mischen. Hinweis: Achten Sie auf die Probe von der Spitze des lysate zu vermeiden Übertragung von Chloroform zur Mischung pipette.</li>
		<li>Statisch inkubieren Sie die Mischung für 20 Minuten bei 37 ° c</li>
		<li>Stoppen Sie die Infektion durch Zugabe von Natriumcitrat, pH-Wert 5,5, bis 100 mM.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Bakterien (5.000 X g für 2 min) und entfernen Sie den überstand zu, dann Aufschwemmen Sie ihnen in 1 mL frisches LB ergänzt mit 100 mM Natrium-Citrat, pH 5,5.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mehr, wie in Schritt 3.2.4 um die Entfernung von freien Phagen und Kalzium zu gewährleisten.</li>
		<li>Aufzuwirbeln Sie die Bakterien in 1 mL frisches LB ergänzt mit 100 mM Natrium-Citrat, pH 5,5. Inkubieren Sie die Bakterien bei 30 ° C für 1 h unter Schütteln (> 100 u/min).</li>
		<li>Sammeln Sie die Bakterien durch Zentrifugieren (5.000 X g für 2 min) und Aufschwemmen sie in ~ 100 μL lb mit 100 mM Natrium-Citrat, pH 5,5.</li>
		<li>Verteilt die Bakterien auf eine LB-Platte mit Kan bei 25 µg/mL und 10 mM Natrium-Citrat, pH-Wert 5,5, ergänzt und wachsen die Bakterien bei 30 ° C bis Kolonien (~ 24 h) angezeigt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl der transductants
	<ol>
<li>Wenn Kolonien auf der Platte Auswahl gewachsen sind, restreak sie auf LB + Kan für einzelne Kolonien und wachsen bei 30 ° C, bis einzelne Kolonien erscheinen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) besteuert die Kan-Kassette
<ol><li>
Die Transformation mit Rekombination plasmid
	<ol>
<li>Die Kan-resistente BL21ΔABCF Stamm Electrocompetent zu machen.<ol>
<li>Wachsen die Belastung aus einer einzigen Kolonie in frisches LB (5 mL) ergänzt mit Kan (25 µg/mL) bei 30 ° C bis die OD600 ~0.5 – 0,7 ist.</li>
			<li>Führen Sie von hier aus die folgenden Schritte bei 4 ° C oder auf Eis. Zentrifugieren Sie die Bakterien (5.000 X g für 10 min) und entfernen Sie den überstand zu.</li>
			<li>Waschen Sie die Zelle Pellet mit eiskaltem destilliertes Wasser zweimal durch die Wiederholung der vorangegangenen Zentrifugationsschritt und schließlich Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 100 µL der eiskalte 10 % Glycerin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 mm Elektroporation Küvetten auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Die Zellsuspension 1 Pg von Plasmid DNA (pCP20) hinzu, mischen Sie die Aussetzung vorsichtig, und übertragen Sie es auf einem gekühlten Elektroporation-Küvette.</li>
		<li>Legen Sie die Electroporator auf 1,8 kV und Electroporate der Zellen.</li>
		<li>Entartete Zellen zu retten, indem hinzufügen 1 mL SOC-Medium und wachsen zu lassen für 1 h bei 30 ° C.</li>
		<li>100 µL der Zellen auf LB-Platte + Amp-Platten und die Zellen bei 30 ° C über Nacht wachsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induktion von der Rekombination
	<ol>
<li>Wählen Sie einzelne Kolonien aus dem LB + Amp Platte und frisches LB weglassen aller Antibiotika zu impfen.</li>
		<li>Wachsen Sie die Zellen bei der non-permissive Temperatur (43 ° C) induzieren die Expression von FLP Rekombinase über Nacht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl recombinants
	<ol>
<li>Verdünnungsreihen und 50 µL einer 105-106 Verdünnung auf nicht-selektiven Platten Teller und wachsen sie über Nacht bei 30 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Überprüfung der Gen-Löschung
<ol><li>
Überprüfung der Plasmid-Verlust und erfolgreiche Rekombination
	<ol>
<li>Ader einzelne Kolonien von den Platten, die in Schritt 4.3.1 auf Kan, LB, LB + Amp vorbereitet und LB-Platten ohne Antibiotika, in dieser Reihenfolge. Um die Streifen zu erleichtern, verwenden Sie ein Kolonie-Raster (siehe ergänzende Datei 1). Wachsen Sie die Platten bei 30 ° C bis Kolonien (~ 24 h) angezeigt werden.</li>
		<li>Wählen Sie 10 – 20 Klone, die auf die nicht-selektiven Platte gewachsen, aber nicht auf selektivmedien zur weiteren Überprüfung zu wachsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zusätzliche Überprüfung von Colony PCR
	<ol>
<li>Führen Sie eine Kolonie PCR mit Primer flankieren das TamA Codierung Sequenz (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Bereiten Sie einen master PCR-Mix. Die Menge der Mischung benötigt hängt von der Anzahl der Kolonien getestet werden (siehe Beispiel in Tabelle 1). Mischen der Reagenzien auf Eis, fügen Sie die Polymerase zuletzt.</li>
		<li>Die PCR-master-Mix gründlich mischen, dann 20 µL in Röhren von einem PCR-Streifen zu verzichten. Wählen Sie eine kleine Menge von jeder Kolonie untersucht werden, mit einer sterilen Pipettenspitze und fügen Sie es zu einem Schlauch. Denken Sie daran, die ursprünglichen Empfänger Stamm zum Vergleich. Optional auch die Spender-Belastung.</li>
		<li>Ausführen eine PCR-Reaktion (siehe Tabelle 2 für das Programm verwendet).</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1 % Agarosegel.<ol>
<li>Messen Sie für eine 50 mL Gel 0,5 g Agarose zu und 50 mL TAE Puffer (40 mM Tris, Essigsäure 20 mM und 1 mM EDTA, pH 8,0). Erhitzen Sie die Mischung in einem Mikrowellenherd, bis alle Agarose gelöst hat.</li>
			<li>Sobald die Agarose gelöst hat, Abkühlen der Lösung auf etwa 50 ° C, und fügen Sie 5 μl DNA-Farbstoff Färbung. Mischen Sie die Lösung gut und Gießen Sie sie in ein Gel-Tablett in einer Casting-Kammer. Fügen Sie eine oder mehrere Zeilen von gut Kämmen, sodass gibt es genügende Brunnen für alle Proben sowie molekulare Größe Marker. Lassen Sie das Gel für 30 min eingestellt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sobald der PCR-Lauf abgeschlossen ist, fügen Sie 4 µL 6 x DNA Loading Dye zu jeder Probe. Legen Sie das Gel in der Elektrophorese-Kammer und fügen Sie TAE Puffer hinzu, bis der Brunnen abgedeckt sind.</li>
		<li>10 – 15 µL jeder PCR-Reaktion zu einem Brunnen im Gel anwenden. Auch 5 µL einer Molekülgröße Markierung hinzufügen. Führen Sie dann das Gel für 30 min bei 75 V.</li>
		<li>Sobald das abgeschlossen ist, Bild, das Gel mit einem Blaulicht-Imager.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. sonstige Techniken
<ol><li>
Protein-expression Hinweis: Die Expression von Proteinen Test (YadA und EibD) wurde23,24an anderer Stelle ausführlich beschrieben. Dies ist eine kurze Zusammenfassung der wichtigsten Schritte.<ol>
<li>Verwandeln Sie BL21ΔABCF ΔTamA wIth die erforderlichen Plasmide (pIBA2-YadA und pEibD10 und die entsprechende Kontrolle Plasmide) zu, und wählen Sie für transformanten auf LB + Amp.</li>
		<li>Für die Proteinexpression 100 mL LB-Medium + Amp mit 1 mL einer Übernacht-Kultur transformierte Bakterien zu impfen und diese bei 30 ° C bis Mitte Log-Phase, zu welchem Zeitpunkt wachsen, induzieren die Proteinproduktion mit entweder Anhydrotetracycline (bei 100 ng/mL) oder Isopropyl Thiogalactoside (bei 0,5 mM).</li>
		<li>Nach 2 h der Induktion bei 30 ° C, Messung die Trübung der Kulturen und sammeln Sie eine Anzahl von Zellen entspricht 50 mL bei OD600 = 1.0 durch die Kulturen für 15 min bei 4.000 X gZentrifugieren. Waschen Sie die Tablette 1 X mit 10 mM HEPES, pH 7,4 und dann entweder speichern sie bei-20 ° C oder Verfahren sie weiter wie in Schritt 6.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Äußere Membran Extraktion Hinweis: Äußere Membran Extraktion erfolgt wie im Detail durch Leo Et Al. beschrieben 27. die wichtigsten Schritte sind im folgenden zusammengefasst.<ol>
<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL 10 mm HEPES, pH 7,4, ergänzt mit 10 mM MgCl2 , MnCl2, Lysozym (0,1 mg/mL) und einer Prise DNase ich.</li>
		<li>Lyse der Zellen (z.B.mit einem Wulst-Schläger).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen kurz (2 min bei 15.600 X g) um zellenrückstand zu entfernen und den überstand in ein frisches Tubus verschieben.</li>
		<li>Die Zellen für 30 min bei 16.000 X g, nach dem Zentrifugieren, das Pellet in 400 μl 1 % N-Lauroyl Sarkosin in 10 mM HEPES, pH 7.4 aufzuwirbeln.</li>
		<li>Inkubation der Zellen mit Agitation für 30 min bei Raumtemperatur, woraufhin, für 30 min wie oben beschrieben Zentrifugieren.</li>
		<li>Waschen der transluzenten pellet-1 X mit 200 μl 10 mm HEPES, pH 7,4, und dann in 30 μl 10 mm HEPES aufschwemmen und 10 μL von 4 x Probenpuffer SDS-PAGE hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aktivität-assays Hinweis: Führen Sie SDS-PAGE und Aktivität-Assays für YadA und EibD beschrieben28. Die wichtigsten Schritte sind im folgenden zusammengefasst.</li>
	<li>
SDS-PAGE
	<ol>
<li>Erhitzen Sie die Proben bei 50 ° C für 5 min vor dem Laden sie auf ein Polyacrylamid-Gel, um zu vermeiden, Denaturierung der Proteine.</li>
		<li>Übertragen Sie nach der Trennung im SDS-PAGE die Proteine auf einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran.</li>
		<li>Blockieren Sie nach der Übertragung die Membran mit 2 % Magermilchpulver in PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
YadA-Kollagen weit Western blot
	<ol>
<li>Fügen Sie nach der Sperrung bovinen Kollagen Typ hinzu, den ich verdünnt in blocking-Puffer zu einer Konzentration von 10 μg/mL und inkubieren Sie die Membran für 1 h.</li>
		<li>Waschen Sie die Membran 2 X mit PBS + 0,05 % Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>Fügen Sie den primären Antikörper (monoklonalen Anti-Kollagen COL-1) an die Membran, verdünnte 1:2,000 in blocking-Puffer.</li>
		<li>Waschen Sie nach Bebrütung der Membran für 1 h 2 X, wie in Schritt 6.3.2.2 erwähnt und fügen Sie dann den Sekundärantikörper [Ziege Anti-Maus IgG-Meerrettich Peroxidase (HRP) Konjugat], verdünnt 1: 10.000 in blocking-Puffer.</li>
		<li>Die Membran für 1 h inkubieren, dann waschen Sie es 2 X mit PBS-T. Die Membran entsprechend den Anweisungen des Herstellers eine verstärkte Chemilumineszenz Substrat hinzu und erkennen Sie die Band mit einer CCD-Kamera zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD-IgG Bindung Assay
	<ol>
<li>Fügen Sie nach der Sperrung ein sekundären Antikörper (Ziege Anti-Kaninchen HRP), 1:2,000 in blocking-Puffer verdünnt hinzu.</li>
		<li>Die Membran für 1 h inkubieren, dann waschen Sie es 2 X mit PBS. Führen Sie Chemolumineszenz Nachweis, wie im Schritt 6.3.2.5 erwähnt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

P1 Transduktion ist eine schnelle, robuste und zuverlässige Methode zur Erzeugung von Gen-Deletionen in E. Coli. Davon zeugt hier transducing einen TamA Löschung Mutant aus einem Keio-Spender-Stamm an einen Empfänger BL21 abgeleitet. Die wichtigsten Schritte bei der Transduktion sind die Herstellung von den transducing lysate, die Transduktion selbst, die Exzision der Kan-Widerstand-Kassette und die Überprüfung der Knock-out-mittels PCR. Insgesamt der Prozess dauert ca. 1 Woche und erfordert keine molekularbiologischen Methoden verwendet werden, abgesehen von der letzten PCR zum Nachweis. So P1 Transduktion rote Rekombination im aufgewendeten Mühe und Zeit mit λ konkurrieren kann und ist wesentlich schneller als herkömmliche Marker Austausch Mutagenese.
Die vorgestellte Protokoll ist sehr robust und für Änderungen an viele der Schritte ermöglicht. Es gibt jedoch ein paar kritische Parameter. Für P1-Infektionen ist es notwendig, Calcium-Ionen auf das Medium hinzuzufügen. Kalzium ist notwendig für die Adsorption von Phagen, die Bakterien, und Fehler beim Hinzufügen von ausreichend Kalzium, das Medium wird deutlich verringern die Effizienz der Infektion. Einige bakterielle Stämme wie BL21ΔABCF sind in der Regel in Anwesenheit von CaCl221Aggregat. In solchen Fällen können die Bakterien ohne CaCl2, angebaut werden, die zur Aussetzung kurz vor der Infektion hinzugefügt werden können. Jedoch kann für eher konventionellen Sorten 10 mM CaCl2 in das Wachstumsmedium von Anfang an enthalten.
Andererseits ist es wichtig, das freie Kalzium aus dem Medium nach der Transduktion zu entfernen. Citrat ist ein Chelator von Calcium-Ionen, und da diese für die Adsorption von P1 auf Wirtszellen benötigt werden, entfernen das freie Kalzium aus dem Medium verhindert weitere Infektionen. Wenn das Kalzium nicht entfernt wird, werden die Phagen weitere Zellen in der Kultur, bestenfalls reduziert die Effizienz der Transduktion und im schlimmsten Fall die ganze Kultur, einschließlich der Transductants Lyse infizieren.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist Bakterien tragen das Plasmid pCP20 züchten. pCP20 ist ein bedingt replizierende Plasmid, das bei Temperaturen von 37 ° C oder höher nicht replizieren. um das Plasmid in den Zellen zu etablieren, Inkubationen mit diesem Plasmid müssen also bei 30 ° C durchgeführt (oder niedriger), eine Temperatur, die freizügig für die Replikation von pCP20. Für die Heilung von pCP20, ist eine hohe Temperatur (43 ° C) verwendet. Einige Stämme wachsen nicht gut bei dieser Temperatur; in solchen Fällen sollte 37 ° C ausreichen, obwohl die Plasmid Aushärtung bei dieser Temperatur etwas weniger effizient sein.
Wenn Bakterien für die Antibiotika-Empfindlichkeit testen Plattieren, ist die Reihenfolge der Platte Streifen wichtig. Das Protokoll fordert Klone, zuerst auf Antibiotika-haltigen gestreift werden Platten und schließlich auf nicht-selektiven Medium. Auf diese Weise die Ermittler kann sicher sein, dass jeder Mangel an Wachstum auf dem selektiven Medium durch Antibiotika-Empfindlichkeit wird und anstatt zu einem möglichen Mangel an Material auf die Platten übertragen. Nach dem Protokoll, kein Wachstum auf der LB + Kan Platte überprüft die Exzision der Kan-Widerstand-Kassette; kein Wachstum auf der LB + Amp Platte bestätigt den Verlust der Rekombination Plasmid pCP20; Stämme wachsen auf der LB-Platte (die nicht wachsen im gleichen Schlieren Experiment auf den Auswahl-Platten) werden die positiven Recombinants enthalten.
Die meisten anderen Schritte ermöglichen erhebliche Spielräume. Im Protokoll ist wie dargestellt, BL21ΔABCF bei 30 ° C kultiviert wie diese Sorte wächst nicht gut bei 37 ° C. Jedoch können E. Coli -Stämme ohne Wachstumsstörungen bei 37 ° C (außer wenn verwandelt mit pCP20) kultiviert werden.
Die Anzahl der Bakterien verwendet für Infektionen kann zu einem gewissen Grad variiert werden. Die Beziehung zwischen OD600 und eine tragfähige Count ist etwa linear zwischen einem OD-600 -Wert von 0,1 und 1,0, wo entspricht der ehemaligen ca. 108 KBE/mL und letztere bis ~ 109 KBE/mL. Dieses Verhältnis kann jedoch zu einem gewissen Grad abhängig von der Belastung in Frage, das Wachstumsmedium und anderen Faktoren variieren. Es wird empfohlen, dass die Beziehung zwischen OD600 und die Anzahl der lebensfähigen für jedes Labor und Belastung, insbesondere für die Berechnung der MOI Werte geschaffen werden sollte. Die Anzahl der Bakterien im Infektions-Experimente nicht besonders kritisch, und 109 KBE/mL entspricht der frühen stationären Phase, die einen vernünftigen Kompromiss zwischen Zelldichte und der Anteil der lebensfähigen Zellen in der Kultur ist. Wenn eine geringere Anzahl an lebensfähigen Bakterien für die Transduktion verwendet werden, muss die Zahl der Phagen einfach entsprechend angepasst werden. Das MOI selbst kann auch zu einem gewissen Grad variiert werden. Das Protokoll fordert einen MOI-Wert von 0,5, obwohl nichts zwischen 0,1 und 0,5 ein guter Wirkungsgrad führen sollte. Bei einer MOI von 0,5 ist das Verhältnis von Phagen Bakterien 1:2 (d.h. die Hälfte der Phagen im Vergleich zu der Anzahl der Bakterien). Im Beispiel in das Protokoll die OD600 der Kultur ist 1.0, und 1 mL der Kultur dient für die Transduktion; So ist die Zahl der Phagen benötigt 5 x 108. Ein MOI-Wert von 0,5 bietet ein hohes Maß an Infektion aber reduziert die Anzahl der Bakterien, die doppelt infiziert sind, die die Effizienz der Transduktion verringern würde, als der Wildtyp (infektiösen) Phagen weit die 3D-Steuerung Phagen überwiegen. Eine doppelte Infektion mit 3D-Steuerung Phagen und eine infektiöse Phagen würde um zu Zell-Lyse, wodurch diese Transductant aus dem Pool der Überlebenden führen. Daher sollte eine MOI von 0,5 nicht überschritten werden.
Das Protokoll ermöglicht auch einige Abkürzungen. Als Vorbereitung Lysates von Platten, befürworten einige Autoren Vorbereitung Phagen Lysates im flüssigen Medium29. Dies kann Zeit sparen, da eine Übernachtung inkubationsschritt nicht benötigt wird. In ähnlicher Weise kann titrieren lysate Phagen nicht erforderlich sein. Wie oben erwähnt, die MOI ist nicht sehr kritisch, und angemessene Effizienz durch einfach vorausgesetzt, einen Titer von 1010 Pfu/mL für eine Standard lysate erreicht werden kann.
Trotz der einfachen Technik P1 Transduktion ist nicht universell einsetzbar, und mehrere Bedingungen müssen erfüllt sein, damit es nützlich sein. Erstens muss eine Spender-Sorte mit einer wählbaren Knock-out-Allel verfügbar sein. Dies geschieht in der Regel mithilfe einer Löschung eine Antibiotika-Resistenz-Kassette ersetzt wo das Gen des Interesses. Die Keio-Kollektion ist besonders nützlich in diesem Zusammenhang eine Ready-to-Use-Bibliothek von Antibiotika Kassetten-basierte gen Durchbrüche für fast alle nicht-essentiellen Gene in E. Coli K12 bietet. Diese Sammlung eignet sich besonders für konservierte Gene gefunden in den meisten E. Coli -Stämme (d.h. Bestandteile der E. Coli -Kern-Genom) ausschlagen. Für weniger häufig Gene, wie Virulenzfaktoren von pathogenen E. Coli Stämme oder seltene Stoffwechselweg Gene, kann die Mutation de Novoerstellt werden müssen. In solchen Fällen möglicherweise P1 Transduktion auch nicht die Methode der Wahl. Neben wesentlichen Gene sind Gene, die erforderlich für P1-Infektion, wie z. B. GalU, sind Mutationen von denen zu P1 Widerstand30führen, schlechte Ziele für eine Löschung von P1 Transduktion. Ein weiterer Hinweis insbesondere Verwendung der Keio-Sammlung ist, dass ein paar Stämme tragen eine Verdoppelung des gezielten Gens, wo nur eine Kopie der Kan Widerstand Kassette8gestört wurde. In solchen Fällen kann das Gen des Interesses notwendig sein; die Ermittler sind empfohlen, aktualisierte Beschriftungen für solche Gene8überprüfen. Jedoch ermöglicht da diese Fesseln, P1 Transduktion das Löschen von die meisten Gene im Labor E. Coli -Stämme. Zum Beispiel die Unterschiede zwischen BW25113 und BL21(DE3) sind klein und nur eine Handvoll von Protein-kodierenden Gene31beeinflussen.
Zweitens ist es wichtig zu betonen, dass die Empfänger Belastung eine homologe Rekombination für die Transduktion zu arbeiten imstande sein muss. Eine Sorte fehlen die Rekombinase RecA können daher werden nicht von dieser Methode geändert. Dies schließt alle standard Klonen Stämme, wie DH5α, HB101, TOP10 und blau XL-1. RecA kann vermitteln Rekombinationen zwischen identischen Strecken so kurz wie 8 bp; jedoch wird eine längere Region der hohen Ähnlichkeit erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Rekombination deutlich32,33. Ein weiteres Problem, vor allem mit klinischen E. Coli -Stämme, ist, dass lange O-Antigen Ketten den Rezeptor für P1, verdecken können, liegt in der Core-Oligosaccharid Lipopolysaccharid34. Zusätzlich zu diesen Anforderungen für die Empfänger Belastung sollte die P1-Belastung für die Transduktion verwendet eine Mutante Vir ; Diese Mutation ist erforderlich für eine volle lytische Infektion35.
Eine dritte Einschränkung von P1 Transduktion besteht darin, dass das Gen geschlagen werden in einer Region mit hoher Ähnlichkeit in den flankierenden Regionen zwischen Spender und Empfänger Stämme befinden soll. Wenn es ein Mangel trägt zwischen den Stämmen, fehlschlagen die Ersetzung des Zielgens Codierung Sequenz mit der Kan-Kassette gut, aufgrund von Unterschieden in den Inhalt der flankierenden Regionen. Daher sollte vor dem Einschiffen auf P1-vermittelten gen löschen, Ermittler überprüfen die Sequenzen der Spender und Empfänger Stämme um sicherzustellen, dass die flankierenden Sequenzen Homolog sind. Natürlich ist dies nur möglich, wenn die Stämme sequenziert worden. Bei Stämmen mit einer unbekannten Sequenz P1 Transduktion entweder scheitern oder andere Probleme, wie z. B. eine gen-Konvertierung in den flankierenden Regionen verursachen. P1 können ca. 90 Kilobase Paare DNA transduzieren; gibt es Unterschiede in der Gen-Inhalt in den Regionen um das Zielgen (z.B., kleine Deletionen oder Insertionen), ist es wahrscheinlich, dass diese auf die Spender-Sequenz zurückgesetzt werden. Dies könnte haben unbeabsichtigte Konsequenzen auf den Phänotyp des Empfängers Stamm. Daher, wenn möglich, sollte die Sequenzen von Spender und Empfänger um das Gen des Interesses immer vor P1 Transduktion verglichen werden.
Zusammenfassend ist P1 Transduktion eine schnelle Art und Weise einen bestimmtes Gen Knock-out auf eine Reihe von Stämmen zu übertragen, nachdem die erste k.o.-Mutation generiert wurde. Obwohl die Technik ihre Grenzen hat, machen die Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Umsetzung es eine attraktive Alternative zu anderen Methoden der Gen-Löschung. P1 infiziert nur E. Coli, die normalerweise die Verwendung dieser Spezies beschränkt. Jedoch einige Varianten von P1 entwickelt worden, die haben ein breiteres Wirtsspektrum und infizieren können, andere Arten innerhalb der Familie Enterobacteriaceaeund sogar einige andere γ-Proteobacterial, wenn auch reduziert Effizienz36, 37. sogar die Signalweiterleitung geklonte DNA aus E. Coli Myxococcus Xanthus, ein δ-proteobakterium, wurde gemeldeten38. In weiteren Untersuchungen konnte diese Varianten mit der Vir -Mutation, die Palette der Empfänger Stämme verwendet Antibiotika Kassetten-basierte gen Löschung durch allgemeine Transduktion erweitern erweitert werden.

Eine gemeinsame erste Annäherung an die Funktion eines Gens zu untersuchen ist, Knock-out-Mutagenese durchzuführen und die daraus resultierenden Phänotyp zu beobachten. Dies wird auch reverse Genetik bezeichnet. Das Bakterium E. Coli wurde das "Arbeitspferd" der molekularen Biologie für den letzten 70 Jahren oder so, wegen der Leichtigkeit seiner Kultivierung und seine Bereitschaft zur Genmanipulation1. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um gen Streichungen in E. Coli, einschließlich Marker Austausch Mutagenese2,3 und in jüngerer Zeit, Restriktionsenzymen mit dem λ rot oder Rac ET Systeme4,5 produzieren , 6.
In einem weit verbreiteten System werden kodierende Sequenzen einzelner Gene durch eine Antibiotika-Resistenz-Kassette ersetzt, die später von Chromosom5,7herausgeschnitten werden können. Die kodierenden Sequenzen werden, zum Beispiel durch eine Kanamycin (Kan) Widerstand Kassette ersetzt, die von Flippase (FLP) Anerkennung (FRT) Zielseiten auf beiden Seiten flankiert wird. Die FRT-Websites werden durch die Rekombinase FLP, erkannt die ortsspezifische Rekombination zwischen den FRT Standorten führt zur Löschung des Kan-Kassette vermittelt. Auf diese Weise kann eine vollständige Löschung der eines bestimmten Gens kodierende Sequenz erreicht werden, hinterlässt nur eine minimale Narbe Sequenz von etwa 100 Basenpaaren (bp) (Abbildung 1).
Etwas mehr als einem Jahrzehnt war die so genannte Keio-Kollektion entwickelt. Dies ist eine bakterielle Bibliothek basierend auf einem standardlabor E. Coli K12 Stamm, wo fast alle nicht-essentiellen Gene von λ rote Rekombination7,8einzeln gelöscht wurden. Die Klone in dieser Auflistung jedes haben eine kodierende Sequenz mit einer verbrauchsteuerpflichtigen Kan Widerstand Kassette ersetzt. Die Keio-Kollektion hat sich als ein nützliches Werkzeug für viele Anwendungen-9. Eine solche Anwendung ist die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Die Kan-Kassette aus einem gegebenen Löschung-Klon kann von in der Regel transducing Bakteriophagen, wie P110,11,12,13,14mobilisiert werden. Ein Phagen bestand aus ein solcher Stamm vorbereitet kann dann verwendet werden, einen Empfänger E. Coli -Stamm von Interesse, zu infizieren wo kann bei einer niedrigen, aber zuverlässige Frequenz der Kan Kassette-haltigen Region des Empfängers Genoms durch homologe Rekombination integriert werden (Abbildung 2). Transductants kann für das Wachstum auf dem Kan-haltigen Medium ausgewählt werden. Im Anschluss daran ggf. Entfernung der Antibiotika-Resistenz-Kassette die FLP-Rekombinase auf die Transductant Belastung in Trans lieferbar. Nach dem Aushärten der FLP-haltigen Plasmid, das welches eine Ampicillin (Amp) Widerstand Markierung trägt, Kan und Amp-sensitiven Klone sind geschirmt für, und die richtige Exzision der Wildtyp kodierende Sequenz und der Kan-Kassette werden durch Kolonie-PCR überprüft.
Hier ist ein detailliertes Protokoll präsentiert, die einzelnen Schritte bei der Herstellung eines Knock-out- E.-Coli -Stamm auf Basis der oben beschriebenen Strategie beschreiben. Als Beispiel wird eine Deletion des Gens TamA demonstriert. TamA kodiert eine äußere Membran β-Fass-Protein, die ist ein Teil von Transport und Montage-Modul (TAM), die in der Biogenese bestimmter Autotransporter Proteine und Pili15,16,17beteiligt ist. Verwendet wurde diese Knock-out-Stamm dann zu prüfen, die Wirkung der TamA -Löschung auf der Biogenese von zwei Trimere Autotransporter Adhesins (TAAs), Yersinia adhäsin YadA und E. Coli -Immunglobulin (Ig)-TAA EibD verbindlich 18,19.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Wild-type strain of Keio collection</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>Expression strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>Derived from BL21(DE3)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; deletion mutant</td></tr><tr><td>P1 &lt;em&gt;vir&lt;/em&gt;</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>Generally transducing bacteriophage</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>conditionally replicating plasmid with FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of EibD; plasmid available on request</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of YadA; plasmid available on request</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>anti-collagen type I antibody COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>Bovine collagen type I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium hydrogen phosphate</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>DNA dye</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA molecular size marker</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP substrate</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl thiogalactoside</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-lauroyl sarcosine</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; forward primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-GAAAAAAGG&lt;br /&gt;ATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-TCATAATT&lt;br /&gt;CTGGCCCCAGACC-3&#039;</td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis chamber</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>Bead beater</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation unit</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>Incubating shaker</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Microwave oven</td><td>Samsung</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>PCR strips</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>Wet transfer unit</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

Eine erste Annäherung an die Funktion eines unbekannten Gens in Bakterien zu untersuchen ist die Schaffung einen Knock-out-dieses Gens. Hier beschreiben wir eine robuste und schnelle Protokoll für die Übertragung von Genmutationen Löschung aus einem Escherichia-coli -Stamm zum anderen mithilfe von generalisierten Transduktion mit Bakteriophagen P1. Diese Methode erfordert, dass die Mutation wählbar (z. B. basierend auf Gen Störungen mit Antibiotika Kassette Insertionen). Solche Antibiotika Kassetten können aus einem Spender Stamm mobilisiert werden und führte zu einem Empfänger Stamm von Interesse schnell und einfach erzeugen eine gen-Löschung-Mutante. Die antibiotische Kassette kann soll Flippase Anerkennung Aufstellungsorte schließen, mit denen die Exzision der Kassette durch eine ortsspezifische Rekombinase einen sauberen Knock-out-mit nur einer ~ 100-Base-paar-lange Narbe-Sequenz des Genoms zu produzieren. Wir demonstrieren das Protokoll durch das TamA -gen Kodierung einen Montage-Faktor beteiligt Autotransporter Biogenese ausschlagen und testen Sie die Wirkung von diesem Knock-out auf der Biogenese und Funktion der beiden Trimere Autotransporter Adhesins. Obwohl gen Löschung durch P1 Transduktion seine Grenzen hat, machen die Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Umsetzung es eine attraktive Alternative zu anderen Methoden der Gen-Löschung.

Generation ein TamA Knock Out des BL21ΔABCF:
Die oben dargelegte Strategie hat früher zu produzieren einen abgeleiteten Stamm von BL21(DE3), ein standard laborstamm verwendet für Protein-Produktion, die für die äußere Membran-Protein-Produktion optimiert und BL21ΔABCF21genannt. Diese Sorte fehlt vier Genen, die für reichlich äußere Membranproteine kodieren und deshalb in der Lage, mehr heterologously ausgedrückt äußere Membranproteine als der Wildtyp Stamm zu produzieren. Um zu testen ob die TAM TAA Biogenese beteiligt ist, wurde das TamA -gen in diesem Hintergrund gelöscht.
Ein P1 lysate bereitete aus dem Keio-Sammlung-Stamm JW4179, wo das TamA -gen (zuvor genannte YftM) Codierung Sequenz durch eine Kan Widerstand Kassette ersetzt wird. Dann wurde eine Transduktion Experiment mit BL21ΔABCF als Empfänger Belastung durchgeführt. Mehrere Kan-resistente Kolonien wurden erhalten, nach denen wurden zwei für die Exzision der Kan-Kassette gewählt. Das Plasmid pCP20, Kodierung der FLP-Rekombinase war in dieser Klone eingeführt und anschließend durch den Anbau von 43 ° c in der Abwesenheit einer antibiotischen Auswahl geheilt. Eine Reihe von Klonen liefen für Sensibilität für Amp (das ist ein Marker für pCP20) und Kan, und mehrere Klone empfindlich auf beide stammen. Diese Klone wurden durch Kolonie-PCR überprüft mit Primer flankieren das TamA Codierung Sequenz und festgestellt, dass das TamA -gen erfolgreich gelöscht wurde (Abbildung 4).
Tamas Rolle bei TAA Biogenese:
TamA hat sich gezeigt, in der Biogenese von einigen klassischen Autotransporters16 und die inverse Autotransporter Intimin15einbezogen werden. Um zu testen ob TamA wichtig für die Biogenese von TAAs ist, verwandelte sich BL21ΔABCF ΔTamA mit zwei Test-Proteine, Yersinia adhäsin YadA und E. Coli Ig-bindendes Protein EibD Kodierung Plasmide. Diese Proteine sind dafür bekannt, auch in E. Coli Ausdrücken und dienten als Modelle für TAA Biogenese in früheren Studien23,28.
Nach induzierende Protein-Produktion, waren die äußere Membran Brüche der Ausdruck Kulturen isoliert und von SDS-PAGE analysiert. Die Proben wurden nicht gekocht, um trimerisierungskatalysatoren der Proteine zu demonstrieren. Das Trimere laufen bei Größen über 100 kDa, während die Monomere Größen von 45 kDa (YadA) und 51 kDa (EibD) erwartet haben. Keine großen Unterschiede zwischen den Ausdruck in BL21ΔABCF und BL21ΔABCF beobachtet wurden ΔTamA, obwohl YadA scheint auf einem etwas niedrigeren Niveau in der Δ-TamA -Belastung (Abb. 5A) produziert werden. Allerdings scheint das Gegenteil der Fall für EibD.
Um zu prüfen ob das Fehlen von TamA die korrekte Faltung oder Transport der Proteine beeinflussen könnten, war ihre Fähigkeit, an Liganden binden getestet. Für YadA wurde dies durch eine Kollagen weit Western Blot (Abb. 5 b) erreicht. YadA, gebunden in beiden Stämmen Kollagen auf einem ähnlichen Niveau belegen, dass das Protein korrekt gefaltet und funktionsfähig ist. In ähnlicher Weise korreliert IgG-Bindung Aktivitäten der EibD in beiden Stämme mit dem Ausdruck (Abbildung 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Streichung der TamA erhebliche Auswirkungen auf die TAA Biogenese, zumindest nicht für diese beiden Modell TAAs keinen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig1.jpg"> Abbildung 1: Generation der Durchbrüche mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotika Kassetten. Für die Herstellung der Gen-Knock-Outs, wird ein Gen des Interesses (Gene B in diesem Beispiel) ersetzt durch eine Kan Widerstand Kassette flankiert von FRT Websites. Die FRT-Kan-Kassette wiederum ist flankiert von kurz (~ 50 bp) erstreckt sich der Sequenz Homolog zu den vor- und nachgelagerten Regionen der Gene B. Die kodierende Sequenz von Gene B ist für die FRT-Kan-Kassette durch λ ausgetauscht rote Rekombination. Sobald dies erreicht ist, kann die Kan-Kassette selbst entfernt werden, durch die Einführung der FLP-Rekombinase, die eine ortsspezifische Rekombination zwischen den Standorten FRT vermitteln wird. Dies beschneidet die Kan-Kassette, so dass eine minimale (~ 100 bp) Narbe Sequenz in der B-Lokus. Weitere Einzelheiten siehe Baba Et al. 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig2.jpg"> Abbildung 2: Gen Löschung durch P1 Transduktion. Der Geber belasten (Beige) trägt eine Kan-Kassette, die das Gen des Interesses auf dem Chromosom (blau) (gelb) ersetzt hat. Der Spender ist mit P1 Bakteriophagen infiziert. Das Bakterium vermehrt sich in den Spender Sorte, eine große Anzahl von handgefertigtem. Am meisten sind Wildtyp (rote Genom), sondern einen Bruchteil sind transducing Phagen, die einen Teil der Spender Sorte Chromosom statt Phage DNA (blaue Genom) eingeflossen. Ein Teil davon wird die Kan-Kassette (gelbe Genom) enthalten. Schließlich die infizierten Wirtszelle lysen und löst die Phagen in das Medium. Diese werden verwendet, um ein lysate vorzubereiten. Im Experiment Transduktion ist die Empfänger Belastung (hellblau) mit lysate vorbereitet aus dem Spender-Stamm infiziert. In einer Minderheit der Fälle infiziert ist der Empfänger durch eine 3D-Steuerung Phagen tragen die Kan-Kassette (hier dargestellt). Wenn die Regionen neben der Kan-Kassette homologe Rekombination durchmachen, ist die Kan-Kassette integriert die Empfänger Chromosom ersetzt das endogene Allel, was Kan-resistente Klone, die für die ausgewählt werden können. Die Zugabe von FLP Rekombinase auf ein heilbar Plasmid beschneidet die Kan-Kassette, so dass nur eine kurze Narbe Sequenz (hier gelb dargestellt), die den Klon der Kan-Sensitive-Phänotyp wird zurückgesetzt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig3.jpg"> Abbildung 3: Beispiele für Platten nach einer Infektion P1. (A) dieses Panel zeigt einen Teller mit einzelnen Plaques. (B) dieses Panel zeigt eine semi-konfluierende Platte. (C) dieses Panel zeigt eine stark infizierte Platte, wo fast alle Bakterien durch Phagen lysiert worden sind. Die obere Agar-Schicht haben einige resistenten Kolonien entwachsen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig4.jpg"> Abbildung 4: Löschen von TamA Codierung Sequenz. TamA::kan Löschung Allel wurde in den Stamm BL21ΔABCF von P1 Transduktion eingeführt. Nach der Exzision der Kan-Kassette, eine Narbe-Sequenz (~ 100 bp) ist alles, was an den TamA -Locus. Dies wurde bestätigt durch PCR Zündkapseln flankieren die Löschung-Website verwenden. In BL21ΔABCF und seine Elternstamm, BL21(DE3), gibt die PCR ein Produkt die Länge des TamA Codierung Sequenz (die erwartete Größe beträgt 1,7 Kilobase Paare). In BL21ΔABCF, wo die Kan-Kassette herausgeschnitten worden ist, das Produkt entspricht den erwarteten Narbe-Sequenz (145 bp). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig5.jpg"> Abbildung 5: Ausdruck der TAAs durch einen TamA Löschung Stamm. (A) dieses Panel zeigt die SDS-PAGE von äußeren Membranen von Zellen mit dem Ausdruck TAAs (YadA oder EibD) und Vektor-Steuerelemente (pIBA2 und pET22) vorbereitet. Die Stämme sind BL21ΔABCF und seine Derivate Stamm fehlt TamA (ΔtamA). (B) dieses Panel zeigt Kollagen weit Western Blot YadA Proben. YadA Proben und pIBA2 Kontrollen von zentrale A auf einer PVDF-Membran übertragen wurden und mit Kollagen Typ ich inkubiert. Sie wurden dann mit einem Anti-Kollagen-Antikörper untersucht und von ECL erkannt. (C) dieses Panel zeigt einen Antikörper-Bindung-Assay für EibD Proben. Die EibD Proben und pET22 Kontrollen von Panel A wurden auf einer PVDF-Membran übertragen und mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert und dann vom ECL erkannt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>1 X mix</td>
			<td>7 X mix</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR-Klasse Wasser</td>
			<td>17 ΜL</td>
			<td>119 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x Polymerase-Puffer</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>14 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM Deoxyribonucleotide Mischung</td>
			<td>0.4 ΜL</td>
			<td>2,8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Forward Primer 100 µM</td>
			<td>0,2 ΜL</td>
			<td>1,4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rückwärts-Primer 100 µM</td>
			<td>0,2 ΜL</td>
			<td>1,4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq-DNA-polymerase</td>
			<td>0,2 ΜL</td>
			<td>1,4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Insgesamt</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>140 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Kolonie PCR master Mix. Die Menge der Mischung hängt von der Anzahl der Kolonien untersucht werden. Darüber hinaus bereiten Sie eine Kontrollreaktion (ursprünglichen Empfänger Stamm). Beispielsweise werden wenn fünf Klone screening, sechs Reaktionen benötigt, einschließlich der Kontrolle. Es lohnt sich eine zusätzliche Reaktion, um sicherzustellen, dass es gibt genug PCR Mischung für alle Proben (wiederholte pipettieren kleiner pipettieren Fehler verstärkt) vorbereiten. Bereiten Sie in diesem Beispiel eine Mischung von 7 X (5 Kolonien, 1 Steuerung und 1 zusätzliche Reaktion).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Notizen</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2.</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3.</td>
			<td>50 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4.</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1 min/kb, verstärkt werden, runden</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Rückkehr nach Schritt 2 24 mal</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5.</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>6.</td>
			<td>12 ° C</td>
			<td>Für immer</td>
			<td>endgültige halten</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Kolonie PCR Programm.
Ergänzende Datei 1: ein Beispiel der Kolonie Raster. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/Supplementary_file_1.pdf">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

producing-gene-deletions-escherichia-coli-p1-transduction-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

17.0K Aufrufe.  University of Oslo. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

Serie: Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Forschung

Biotechnik

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genetik

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

Quantifizierung der Plasmid-vermittelten Antibiotikaresistenz in einem experimentellen Evolutionsansatz

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Immunologie und Infektion

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Biologie

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

Markerless Gene Deletion von Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Erzeugung<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Quantifizierung der Plasmid-vermittelten Antibiotikaresistenz in einem experimentellen Evolutionsansatz

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in

Genomweiten Gen-Deletionen in

Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion

Markerless Gene Deletion von Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Erzeugung

Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in