Der Autor möchte allen meinen Bachelor Independent Research Studenten und alle meine Microbial Physiology Studenten, die während der 2010-2014 Frühjahr Semester meines Transposon-Mutagenese Ideen getestet danken. Diese Arbeit wurde durch das Department of Biological Sciences an Youngstown State University finanziert.

1. Elektroporation von Competent Cells 5,11 <ol><li> Eine verdünnte O / N-Kultur von LB Enterobacter sp. Ysu 1/20 in 50 ml frischem LB-Medium und wachsen zu einer OD (600 nm) von 0,4 bis 0,6 unter Schütteln bei 120 rpm und 30 ° C. Optional wachsen andere Bakterienstämme auf ihre optimale Wachstumstemperatur. </li><li> Kühlen der Zellen auf Eis für 5 Minuten und Zentrifugation bei 4 ° C und 7.000 × g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen, Resuspendieren der Zellen in 50 ml sterilem eiskaltem Wasser und Zentrifuge bei 4 ° C und 7.000 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Überstand verwerfen und die Zellen werden in einem Volumen von eiskaltem Wasser gleich dem Zellpelletvolumen. Für die Langzeitlagerung, Waschen der Zellen mit 10 ml eiskalter 10% (v / v) Glycerin, resuspendieren in einem gleichen Pelletvolumen eiskaltem 10% (v / v) Glycerin, bei -80 ° C und Auftauen auf Eis vor der Elektroporation. </li><li> Mit 0,5 ul der transposome 40 ulZellen. Das im Handel erhältliche transposome Lösung wird bei einer DNA-Konzentration von 0,33 ug / ul geliefert. Obwohl 0,33 ug empfohlen wird, ist 0,165 &amp; mgr; g DNA ausreichend. </li><li> Legen Sie die Zelle / transposome Mischung in einer eiskalten, 0,2 mm, Elektroporationsküvette und tippen Sie die Mischung auf dem Boden der Küvetten. Schock die Zellen in 25 &amp; mgr; F, 200 Ω und 2,5 kV. Um sicherzustellen, dass die Zellen bleiben gekühlt, vor dem Gebrauch die Elektroporationsküvetten in einem -20 ° C Gefrierschrank lagern. </li><li> Unmittelbar, fügen 960 ul Filter sterilisiert SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren und übertragen Sie die Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die Zellen beginnen, nach dem Schock sterben, aber das Salz in der SOC-Medium können sie sich zu erholen. Um zu sparen, ist es nicht notwendig, transposome hinzuzufügen oder um die negativen Kontrollzellen zu schocken. Fügen Sie einfach 960 ul sterilem SOC-Medium zu. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 30 ° C foder 45-60 min mit 120 rpm schütteln. Dies bietet Zeit für die transposome mit dem Wirtsgenom und die Zellen rekombinieren Kanamycinresistenz exprimieren. </li><li> Verbreiten Sie 100 ul von Zellen auf einer LB-kan-Agar-Platte und Inkubation der Platte O / N bei 30 ° C. Bewahren Sie die restlichen Transformationsmischung im Kühlschrank bei 4 ° C. Verbreiten Sie zusätzliche Beträge zu einem späteren Zeitpunkt bis zu 2 Wochen nach der ersten Elektroporation, falls erforderlich. </li></ol> 2. Gridding von Transformanten <ol><li> Band ein Gitter auf den Deckel eines leeren 100 x 15 mm Petrischale. Kopieren Sie ein Raster von &quot;A Short Course in Bacterial Genetics&quot; 12. </li><li> Zeichnen Sie eine Linie auf dem Boden eines LB-kan-Agar-Platte. Mit einem kleinen Stück Klebeband, um es in die gerasterten Deckel zu verankern, so dass das Netz durch den Agar sichtbar ist. Sicherzustellen, daß die Linie, auf der Unterseite der Platte ist mit dem oberen, in der Mitte des Gitters ausgerichtet. Die Verankerung der Platte mit Klebeband hält sie rutscht, was eine noch Gridding. Die Linie erleichtert Kolonie Identifikation nach Replikaplattierung. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Transformante mit einem sterilen Zahnstocher und Spot es in der Mitte eines Platzes in der Startaufstellung. Berühren Sie einfach die Kolonie und die Stelle. Graben Sie nicht die Zahnstocher in den Agar. Um eine Verunreinigung der Platte zu vermeiden, behandeln den Zahnstocher nur an einem Ende. </li><li> Finde einen anderen Transformante in ein angrenzendes Feld, wie in Schritt 2.3. Wenn die Platte voll ist, bebrüten es O / N bei 30 ° C. Dies ist der Masterplatte. </li></ol> 3. Replikaplattierung die Auxotrophie Phänotyp 12 Bestimmen <ol><li> Für jede Platte, die gerasterten wurde, stellen Sie einen Stapel von drei frischen Agarplatten nummeriert eins bis drei: eine für LB-kan, zwei für M-9-kan und drei für LB-kan. Trocknen der Platten auf den Kopf, O / N bei 37 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Zeichnen Sie eine Linie auf der Oberseite jeder Platte wie in Schritt 2.2. </li><li> Wischen Sie die Replica-Plating-Tool mit 70% Ethanol, legen Sie eine sterile velveteen Quadrat auf der Oberseite des Replika-Plattierung aufol und klemmen Sie die velveteen Quadrat nach unten. Hände sind mit Mikroben wimmelt sogar nach dem Waschen sie. Verhindern, dass der Einführung von verunreinigenden Mikroben durch den Umgang mit den Samt Quadrat am Rand an. </li><li> Richten Sie die Linie auf der Masterplatte mit einer Linie auf der Klemme gezogen und legen Sie die Platte auf der Oberseite des velveteen Quadrat. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien von der Platte auf den Samt Quadrat übertragen. Achten Sie darauf, um die Bakterien zu verschmieren. Entfernen Sie die Masterplatte aus der Samt Platz. </li><li> Richten Sie die Zeile auf Platte Nummer eins gezogen mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien aus der Samt Quadrat auf die Platte übertragen. Entfernen Platte Nummer eins. </li><li> Entsorgen Sie die velveteen Quadrat in ein Becherglas mit Wasser und legen Sie eine saubere, sterile velveteen Quadrat auf der Replikaplattierung Werkzeug wie in Schritt 3.3. Dieser Schritt verhindert Überimpfung, die bahnbrechende Wachstum und falsch positiven Ergebnissen führt. </li><li> Richten Sie dieLinie auf Platte Nummer eins mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der neuen Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien von der Platte Nummer eins auf den Samt Quadrat übertragen. Entfernen Platte Nummer eins. </li><li> Richten Sie die Zeile auf Platte Nummer zwei gezogen mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien aus der Samt Quadrat Platte Nummer zwei zu übertragen. Entfernen Platte Nummer zwei. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.8 für Platte Nummer drei. Die dritte Platte ist eine Steuerung für eine vollständige Übertragung von der Master-Platte zu den beiden anderen Platten. Entsorgen Sie die velveteen Quadrat in einen Becher Wasser. Um die velveteen Quadrate wiederverwenden, Autoklavieren den Becher mit dem kontaminierten velveteen Quadrate, waschen Sie sie, trocknen sie, wickeln Sie sie in Alufolie und neu autoklavieren. </li><li> Die Inkubation bei 30 ° CO / N. Kolonien, die auf beiden LB-kan-Agar-Platten wachsen, aber keine Einigung über M-9-kan Platten wachsen werden als Auxotrophen (sein <strong&gt; Abbildung 2). </li><li> Streak aus Auxotrophen von Platte Nummer eins auf eine frische LB-kan-Agar-Platte, und Inkubation der Platte bei 30 ° CO / N. </li><li> Streak für Trennung 3 Kolonien von der Ausstrichplatte in Schritt 3.11 auf eine frische LB-kan Platte. Die Platte bei 30 ° CO / N. Dies stellt sicher, dass die Mutante ist gut isoliert. Teilen Sie die Platte in Drittel und streifen aus jeder Kolonie in einem Abschnitt. </li><li> Spot-Kolonien aus den ausgestrichen Kolonien von Schritt 3.12 auf eine frische LB-kan Platte abgeleitet, um ein Gitter, wie in den Schritten 2.1-2.4 bilden. Jede Mutante ist in dreifacher Ausfertigung erneut getestet. </li><li> Replizieren Platte wieder wie in den Schritten von 3,1 bis 3,10, um den Auxotroph Phänotyp zu bestätigen. </li></ol> 4. Gene Rettungs <ol><li> Wachsen Sie ein 3 ml O / N-Kultur eines isolierten Mutante Kolonie aus Schritt 3.13 in flüssigem LB-kan-Medium bei 30 ° C. Reinige genomischer DNA aus 1 ml der Kultur unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen genomischen DNA-Reinigungskits. </li><li> Richten Sie eine Mischung aus 0.025 UBFU CI-Restriktionsendonuclease und 14 &amp; mgr; l von 1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l genomische DNA in einer 20 ul Reaktion auf Eis. Da BFU CI schneidet das Transposon an zwölf verschiedenen Stellen, kann es effizienter sein, Restriktionsendonuclease, Bfa I oder Hae III, welches das Transposon an zwei und drei verschiedenen Stellen schneidet, jeweils verwenden. </li><li> Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C für 25 min und dann bei 80 ° C für 20 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren. Analyse 3 ul des teilweise verdaute DNA auf einem 0,8% Agarosegel (Abbildung 3). Eine erfolgreiche partiellen Verdau ergibt einen Ausstrich von über 10 kb bis zum Boden des Gels. </li><li> Ligieren 15 ul teilweise verdauten genomischen DNA mit 800 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem 500 &amp; mgr; l Reaktion. Inkubieren Sie die Reaktions O / N bei 4 ° C. Die großen Reaktionsvolumen maximiert die Ligation von einzelnen Fragmenten, sich selbst und minimiert die Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr DNA-Fragmente. </li><li> Niederschlagste der ligierten DNA durch Zugabe von 50 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,5, und 1 ml 95% Ethanol und Inkubation bei -20 ° C für 20 min. </li><li> Mikrozentrifugen die DNA bei 4 ° C und 13.500 g für 10 min, waschen Sie die Pellet mit 70% Ethanol, trocknen in einer Kreisel Vakuum-Konzentrator und resuspendieren es in 10 ul Nuklease freiem Wasser. Alternativ kann die DNA der Luft bei RT für 15 min getrocknet werden. </li><li> Verwenden Sie 4 ul resuspendiert DNA von E. Transformation coli-Stamm ECD100D pir oder ECD100D pir116 durch Elektroporation, wie in Abschnitt 1. Die R6K γ Replikationsursprung erfordert ein Bakterienstamm mit einem pir-Gen zu replizieren 6. Der PIR-Stamm führt zu geringer Kopien Plasmide und die pir116 Stamm enthält ein pir mutierten Gens, die in hoher Kopien Plasmide führt. Jede Transformante enthält ein neues Plasmid mit dem Transposon und einem Bereich der unterbrochenen Chromosom (1E). </li><li> Inoculaß 5 ml LB-Kan-Medium mit einer Einzelkolonie wachsen sie O / N bei 120 UpM und 37 ° C schütteln und zu reinigen Plasmid-DNA aus der gesamten O / N-Kultur unter Verwendung eines kommerziellen Kits. </li><li> Digest 14 ul der Plasmid mit der Restriktionsendonuklease Xho I. Sicherstellen, dass das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 &amp; mgr; l. Dieses Enzym erkennt eine Stelle in der Mitte des Transposons in das 5&#39;-Ende des Kanamycin-Resistenz-Gen. Analyse 10 ul der unverdauten und verdauten Plasmid auf einem 0,8% Agarosegel (Abbildung 3). Das Plasmid besteht aus dem 2 kb Transposon zzgl flankierenden Wirts-DNA. </li></ol> 5. DNA-Sequenzierung <ol><li> Sequenz, die das Plasmid unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Sequenzierungs-Kits, Primer, die homolog zu jedem Ende des Transposons sind, und eine Kapillare Sequenzierungsanalyse-System. Alternativ kann das Plasmid an einer Außen Einrichtung zur Sequenzierung versendet. </li><li> Verwenden Sie den Molekulargewichtsstandard (1 kb Leiter) indas Gel, um die Größe des Plasmids zu schätzen. Dann schätzen die Zahl der Nanogramm (ng) Plasmid, das für 50 fmol erforderlich ist. </li><li> Messung der Konzentration der Plasmid-DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers bei Wellenlängen von 260 nm (A 260) und 280 nm (A 280). Sicherstellen, dass die Länge des Lichtweges durch die Küvette beträgt 1 cm. Bestimmung der Konzentration durch Multiplikation der Absorption bei 260 nm von 50 ng / &amp; mgr; l. Hochwertige Plasmid-DNA wird einen A 260 / A 280 Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0. </li><li> Das Volumen der für jede Sequenzierungsreaktion erforderlichen DNA ist die Anzahl der NG 50 fmol dividiert durch die Konzentration des Plasmids erforderlich. Mischen das notwendige Volumen des Plasmids mit Wasser, um das Gesamtvolumen auf 10 ul zu bringen. </li><li> Erhitzen der Plasmid-DNA / Wasser-Gemisch bei 96 ° C für 1 min und dann auf RT kühlen. </li><li> Hinzufügen 8 ul Mastermix aus der Sequenzierungs-Kit und 2 &amp; mgr; l von 1,6 &amp; mgr; M einer der Sequenzierungsprimer. </li><li> FolNieder das Protokoll aus der Sequenzierungs-Kit für den Thermocycler-Programm und Reaktions Bereinigung. </li><li> Analysieren Sie jede Probe unter Verwendung einer Kapillare DNA-Analyse-System. </li><li> Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Software-Paket, um die DNA-Sequenz zu sehen. Die Suche nach der Sequenz &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;&quot;, die die letzten 7 bp des Transposons (Figur 4) ist. Die Sequenz vor dem 5&#39;-Ende dieser 7 bp-Segment ist in dem Transposon. Die Sequenz nach dem 3&#39;-Ende dieser 7 bp-Segment ist in dem unterbrochenen Gens. </li><li> Ermitteln Sie die mögliche Funktion des unterbrochenen Gens unter Verwendung der Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Verwenden Sie die folgende link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Fügen die Sequenz der Unterbrechungsed-Gen in das Suchfeld, wählen Sie &quot;Andere&quot; unter der Datenbank und klicken Sie auf &quot;BLAST&quot; am unteren Rand der Seite. Wenn das Ergebnis angezeigt wird, scrollen Sie die Seite, um die Alignment-Ergebnisse (Abbildung 5) zu sehen. </li></ol>

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Der Autor hat nichts zu offenbaren.

Transposon-Mutagenese unter Verwendung eines transposome ist ein effizientes Werkzeug zur Erzeugung Auxotrophen in Enterobacter sp. Ysu und andere Arten von Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien 3,4. Das Verfahren wurde durch Einführung der Tn5 abgeleitetes transposome in den Wirt durch Elektroporation eingeleitet. Kolonien mit Inserts zu identifizieren, hatten die nicht-transformierten Target-Stamm empfindlich sein gegenüber Kanamycin, um die Resistenzmarker von dem Transposon auszuwählen. Einige Hosts erzeugen Restriktionsendonukleasen, die die Transposon-DNA abzubauen, bevor es mit dem Wirtsgenom rekombinieren können. Die Zugabe einer Restriktionsendonuklease-Hemmstoff, um die Elektroporation Mix ist ein Qualitätsverlust zu minimieren und die Transformationsausbeute 3. Während der Vorbereitung der Elektroporation kompetente Bakterien, war es wichtig, so viel Salz zu entfernen wie möglich, um einen elektrischen Lichtbogen oder Funken, der die Bakterien durch die Anwesenheit von Salz verursacht tötet verhindern. Selbst in Abwesenheit vonein Lichtbogen, begannen die Zellen zu schnell nach schockierend ihnen sterben. Hinzufügen des Salzes, das SOC Wachstumsmedium sofort wiederhergestellt das osmotische Gleichgewicht, minimiert Zelltod und erhöhten Transformationseffizienz 5. Kanamycin-resistente Trans wurden dann auf eine frische LB-kan Platte und Replik auf M-9 Minimalmedium-Agar ausgemacht. Zur Überimpfung, die falsch positive Ergebnisse, die mögliche auxotrophen verpassen führen können, zu verhindern, wurden velveteen Quadrate im Schritt 3.6, bevor der Rest der Platten inokuliert geschaltet. Dann wird während Replikaplattierung wurde gerade genug Druck ausgeübt, um die Kolonien ohne Verschmieren oder Kontamination zwischen benachbarten Kolonien übertragen. Die mutierten Gene in den Auxotrophen wurden durch Gen- Rettungs identifiziert. Genomische DNA aus jedem Auxotroph wurde mit einem teilweise Verdauung mit dem häufigen Basisschneider BFU C I. Teilaufschlüsse mit Bfa I oder Hae III, die die tr geschnitten geschertansposon seltener kann Transposon Transformationseffizienz zu verbessern. Es ist auch möglich, eine vollständige Verdauung mit anderen Restriktionsendonukleasen, 6-Basen-und 8-Basen-Schneider, die Stellen innerhalb des Transposons fehlt verwenden. Die verdaute DNA wurde dann ligiert und in E. transformierten coli-Stamm ECD100D pir oder ECD100D pir116 6. Obwohl der E. coli pir116 Stamm wurde durch Elektroporation in Schritt 4.8 umgesetzt, ist es auch möglich, chemisch kompetente Zellen zu verwenden. In diesem Fall sollte die gesamte Transformation verteilt werden, um eine große Auswahl an geretteten Plasmide zu erhalten. Der PIR-Gen ermöglicht die zirkularisierten Transposon als geringer Kopienzahl Plasmid replizieren, und die pir116 mutierten Gens erlaubt es, als Hoch copy Plasmid replizieren. Niedrige Transformationsausbeuten mit der pir116 Stamm kann aufgrund der Expression toxischer Genprodukte aus dem ursprünglichen Wirt sein. Toxizität kann durch Verwendung der niedrigen Kopien reduziert werden <em&gt; Pir Belastung. Allerdings können niedrige Plasmid Ausbeute aus dem pir Stamm machen Sequenzierung anspruchsvoller. Direkte Sequenzierung 10 und PCR-Sequenzierung 14 sind alternative Methoden zur Gen Rettung. Die genomische Sequenzierungsmethode Sequenzen der flankierenden chromosomalen Regionen direkt von gereinigte genomische DNA. Diese Strategie ist nützlich, wenn das Genom des Zielorganismus wurde bereits sequenziert. Sobald die mutierte Region wurde durch genomische Sequenzierung und BLAST identifiziert wurde, kann der gesamte Bereich durch PCR amplifiziert und zur weiteren Analyse kloniert werden. Das PCR-Verfahren verwendet zwei PCR-Reaktionen und vier unterschiedliche Primer. Die erste Reaktionspaare ein Transposon homolog Primer (Primer 1) mit einem degenerierten Primer, die eine kurze DNA-Linker-Sequenz (Primer 2) enthält. Die zweite PCR-Reaktion ist eine verschachtelte PCR-Reaktion, homologen Paarung anderes Transposon-Primer (Primer 3) mit einer homologen Linker-Sequenz-Primer (Primer 4). Die Primingstelle für Primer 3auf der 3&#39;-Seite der Primingstelle für Primer 1. Dann befindet, wird die amplicand vom zweiten PCR-Reaktion gereinigt und sequenziert. Dieser automatisierte Sequenzierungsverfahren verstärkt DNA direkt von den Mutantenzellen, wodurch die Notwendigkeit sowohl für genomische DNA und Plasmid-Reinigung Rettung. Anstelle der Identifizierung von Genen in Auxotrophie beteiligt sind, können Transposon-Mutagenese verwendet, um andere leicht getestet Phänotypen. Enterobacter sp untersuchen. Ysu ist ein Multimetall resistenten Bakterienstamm, der auch resistenter 100 ug / ml Ampicillin (unveröffentlichte Daten). Seine minimale inhibitorische Konzentration (MIC) für HgCl 2 beträgt 70 &amp; mgr; M ZnCl 2 800 um, AgNO 3 beträgt 80 &amp; mgr; M und NaAsO 2 ist 14 mm 9. Nach dem Einbringen der transposome in diesen Stamm und Gridding Anten auf LB-kan-Platten können die gerasterten Kolonien Replik auf das Medium, die Metalle plattiert werden bei Konzentrationen unterhalb der MIC dieser bacteRial Belastung. Rettung und Sequenzierung eines unterbrochenen Gens aus einer Mutante mit abgesenktem MIC kann ein Gen, das Resistenz gegen eines dieser Metalle zeigen. Neben der Erzeugung von Mutanten kann die transposome als Vektor in vitro oder in vivo verwendet werden, um die Verstärkung der Funktion Genen, wie antibiotische Resistenz oder Metall identifizieren. Für die in vitro-Strategie, genomischer DNA von Enterobacter sp. Ysu wird mit einer Restriktionsendonuclease, die Seiten außerhalb des Transposons erkennt verdaut. Die DNA wird ligiert und mit dem transposome in einem Puffer, der Mg 2+ gemischt. Nach Rekombination zwischen dem Transposon und zufällige Genomfragmente, E. coli-Stamm ECD100D pir mit der DNA transformiert und auf Ampicillin-Platten oder ein Metallsalz enthält, verteilt. Kolonien, die wachsen wird ein neues Plasmid, das Transposon zu Resistenzgen des Hosts befindet sich neben enthält besitzen. Für die in vivo strategy, Enterobacter sp. Ysu mit dem transposome umgewandelt. Dann wird der gesamte Transformationsansatz in LB-Flüssigmedium gezüchtet kan für eine große Population mit zufälligen Transposon Einsätze auszuwählen. Genomische DNA mit einer Restriktionsendonuklease, die außerhalb der Standorte transposome erkennt verdaut, ligiert und in E. transformierten coli-Stamm ECD100D pir. Wie in der in vitro-Verfahren werden Transformanten auf Ampicillin oder Metallplatten verteilt. Wiederum wird das resultierende Plasmid des Transposons zu einem Resistenzgen eingesetzt nächsten bestehen. Diese beiden Strategien nur dann erfolgreich sein, wenn das Ziel-Gen exprimiert werden kann und in den E. aktive coli-Stamm. Transposon-Mutagenese kann verwendet werden, um die minimale Anzahl von Genen ein Bakterienstamm benötigt für Wachstum 15,16 identifizieren. Zwei transposomes enthält loxP und unterschiedliche Antibiotikaresistenzmarker sind für diese Strategie erforderlich ina Bakterienstamm mit einer bekannten Genomsequenz. Nachdem die beiden Transposons zu integrieren, ausgedrückt cre-Rekombinase katalysiert die Rekombination eine Reaktion zwischen den beiden loxP-Stellen, wodurch chromosomalen Bereiche zwischen den Transposon-Insertionen. Kenntnis der Genomsequenz macht es möglich, zu ermitteln, welche Gene eliminiert. Die Wachstumsfähigkeit zeigt, dass die Gene eliminiert sind für das Wachstum notwendig. Dieses Verfahren ist arbeitsintensiv, und eine Minimalgenoms Wachstums mit dieser Strategie noch nicht abgeschlossen worden. Ein automatisiertes Transposon-Mutagenese-Studie von Pseudomonas aeruginosa unter Verwendung von PCR-Sequenzierung geschätzte jedoch 300-400 Gene für das Wachstum dieses Bakteriums in einem reichen Medium 14 erforderlich. Diese Studie habe nicht mit dem loxP / Cre-Rekombinase-System. Mikroben mit minimalen Genomen sind nützlich für die synthetische Biologie 17. Ein Bakterienstamm mit minimalem eines Genoms ist especially nützlich, um die Produktion von unerwünschten Nebenprodukten. So wird beispielsweise Clostridium acetobutylicum (C. acetobutylicum) verwendet, um die Biokraftstoff Butanol 18 zu produzieren. Während des Wachstums, produziert dieser Stamm Butanol am Ende ihrer exponentiellen Wachstumsphase kurz vor der stationären Phase eintritt. An diesem Punkt wird es empfindlich auf Butanol und andere Fermentationsprodukte und bildet ruhenden Endosporen, die Waffenruhe Produkt zu synthetisieren. Da transposomes wurden zur Clostridium perfringens 3 zu untersuchen, kann es möglich sein, eine ähnliche transposome / loxP / cre-Rekombinase-System verwendet, um einen Stamm von C. acetobutylicum, die die Gene für unerwünschte Fermentationsprodukte und Sporulation fehlt konstruieren, aber enthält Gene für größere Butanol Toleranz. Dieser Stamm würde die Produktausbeute bei minimalen Verunreinigungen erhöhen. Zusammenfassend stellt das Video Fachartikel eine komplette step für Schritt Beschreibung der zur Auxotrophen durch Transposon-Mutagenese erstellen Verfahren. Es umfasst das Einbringen durch Elektroporation transposome Screening auf Mutationen durch Replika-Plattierung, Rettung mutierten Gene durch Klonierungstechniken und Identifizierung von unterbrochenen Gene durch DNA-Sequenzierung. Diese Technik kann für die Identifizierung der Funktion unbekannter Gene oder für gegebenen Konstruieren einer Bakterienstamm, der in einem industriellen Verfahren verwendet werden kann, verwendet werden.

Prototrophe Bakterien wachsen in M-9-Minimalsalzmedium, das Glucose (M-9-Medium) enthält, Glukose durch Umwandeln zentralen Kohlenstoffwechselwege für die Vor-, wie Aminosäuren, Nucleinsäuren und Vitamine zu erzeugen, für die Biosynthese 1. M-9-Medium enthält Ammoniumchlorid als Stickstoffquelle, Natrium- und Kaliumphosphat als Puffer und Phosphorquelle, Magnesiumsulfat als Schwefelquelle und Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle. Luria-Bertani (LB) Medium reich an Aminosäuren aus Trypton und Vitamine und Wachstumsfaktoren aus Hefeextrakt. Es unterstützt das Wachstum von auxotrophen Mutanten, die Aminosäuren, Vitamine und andere Wachstumsfaktoren für das Wachstum auf M-9 Medium benötigt nicht synthetisieren kann. So wird Prototrophe in LB und M-9 Medium wachsen, während Auxotrophen wird in LB-Medium, aber nicht in M-9 Medium wachsen. Durch Einführen von Mutationen in einen prototrophen Population von Bakterien und Identifizierung mutierter Gene, die auxotrophen Phänotyp verursachen, ist es possible um ein besseres Verständnis des Stoffwechsels in einem Bakterienstamm zu erhalten. Transposon-Mutagenese kann verwendet werden, um viele der für das Wachstum auf Glucose in M-9-Medium erforderlichen Gene zu identifizieren. Transposons fügen sich zufällig in das Wirtsgenom 2. Durch Tüpfeln Transposon Transformanten auf LB-Agar-Platten und Replika Plattierung sie auf M-9 Medium-Agar-Platten, ist es möglich, für Auxotrophe screenen. Unterbrochen Gene durch Gen-Rettungs identifiziert. In dieser Studie wird ein handelsüblicher Tn5 abgeleitetes transposome die als Lösung eines linearen DNA-Segments mit Transposon-Transposase-Protein gemischt geliefert wird. Das DNA-Segment fehlt ein Transposase-Gen, enthält jedoch ein Gen für Kanamycinresistenz, einen γ R6K-Replikationsursprung und zwei Mosaik Motive, die DNA-Sequenzen für Transposase Bindung an jedem Ende des Segments 3,4 sind. Da das Transposase-Protein direkt an die DNA, die DNA-Segment alleine hinzugefügtals Transposon definiert, und die DNA / Protein-Komplex Transposase als transposome definiert. Die transposome durch Elektroporation 5 in eine Kanamycin empfindlich Host (1A) transformiert. Kolonien, die auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (LB-kan) wachsen Transposon Einsätze (1B) und replikaplattiert Anten, die auf M-9 Medium-Agar-Platten mit Kanamycin (M-9-kan) sind auxotrophen nicht wachsen (Figire 1C). Genomischer DNA aus einer Mutante gereinigt und teilweise mit dem 4-Basisschneidende Restriktionsendonuklease, BFU CI (1D) verdaut. Die ligierte DNA wird in einem Stamm von Escherichia coli (E. coli) transformiert, dass das pir-Gen (1E) enthält. Dieses Gen ermöglicht das neue Plasmid, das Transposon und flankierenden chromosomalen Wirts-Region in E. replizieren 6 coli. Das Kanamycin-Resistenz-Gen dient als alselectable Marker für das neue Plasmid. Schließlich Sequenzierung unter Verwendung von Primern, die komplementär zu jedem Ende des Transposons und Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Analyse der erhaltenen 7,8-Sequenz verwendet werden, um die Identität des unterbrochenen Gene zu bestimmen. Diese transposome Mutagenesestrategie bietet drei Vorteile 3. Erstens, da die Transposase-Protein direkt mit dem Transposon gebunden, Insertion nicht auf die Expression der Transposase-Gens im Wirt ab. Sobald das Transposon integriert sich in das Wirtsgenom wird die Transposase verschlechtert, verhindert weitere Bewegung des Transposons. Allerdings können zusätzliche Bewegung nicht verhindert werden, wenn der Host besitzt eine endogene Tn 5 Transpositionselement. Zweitens Einführung des transposome durch Elektroporation macht es möglich, sie in einer Vielzahl von Wirten verwendet werden. Es entfällt auch die Notwendigkeit, das Transposon durch bakterielle Konjugation oder durch Einführung viral-Infektion. Beide Verfahren erfordern eine Wirtsempfindlichkeit. Drittens Aufnahme des Kanamycin-Resistenz-Gen und den Replikationsursprung R6K γ im transposome macht es einfacher, das unterbrochene Gen zu identifizieren. Transposon-unterbrochenen Bereiche gespeichert und sequenziert, wie Plasmide, wodurch die Notwendigkeit, die inverse Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Identifizierung von Genen verwendet werden. Die in diesem Video vorgestellt Protokoll beschreibt jeden Schritt zur Transposon-Mutagenese von Enterobacter sp. Ysu 9 mit einem transposome von seiner Einführung in den Bakterienzellen zur Identifikation der putativen Gens er unterbrochen. Zusätzlich zum zuvor veröffentlichten Protokollen 3,4,10 werden detaillierte Verfahren zur Verwendung Replika-Plattierung für Auxotrophe Bildschirm dargestellt. Dieses Mutagenese-Technik kann zur Untersuchung von anderen Phänotypen, wie Antibiotika-Resistenzen und Metall verwendet werden, in verschiedenen Arten von Bakterien, identifying die minimale Anzahl von Genen für Wachstums unter definierten Kulturbedingungen in der synthetischen Biologie Studium erforderlich ist oder für den Unterricht ein Labor Bestandteil einer Genetik oder mikrobielle Physiologie natürlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Prototrophe Bakterien wachsen auf M-9 Minimalsalzmedium mit Glucose (M-9-Medium) ergänzt, die als Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet wird. Auxotrophe können mit einem transposome erzeugt werden. Die im Handel erhältlichen, Tn 5 stamm transposome in diesem Protokoll verwendet wird, besteht aus einem linearen DNA-Segment, das ein Replikationsursprung R6K γ, der ein Gen für Kanamycinresistenz und zwei Mosaiksequenz endet, die als Transposase-Bindungsstellen dienen. Die transposome, als DNA / Transposase Proteinkomplex vorgesehen ist, wird durch Elektroporation in die prototrophen Stamm, Enterobacter sp eingeführt. Ysu und schließt sich zufällig in diesWirtsGenom. Transformanten werden auf Luria-Replika-Bertani-Agarplatten ausplattiert, die Kanamycin (LB-kan) und auf M-9 Medium-Agar-Platten mit Kanamycin (M-9-kan). Die Transformanten, die auf LB-kan Platten auf M-9-kan Platten wachsen, aber nicht gelten als Auxotrophen sein. Gereinigter genomischerDNA aus einer auxotroph ist teilweise verdaut, ligiert und in einen pir + Escherichia coli (E. coli) Stamm transformiert. Die R6Kγ Replikationsursprung ermöglicht das Plasmid in pir + E. replizieren coli-Stämme und die Kanamycin-Resistenzmarker-Plasmid ermöglicht die Auswahl. Jede Transformante besitzt ein neues Plasmid, das das Transposon durch die unterbrochene chromosomale Region flankiert. Sanger-Sequenzierung und die Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) deuten auf eine vermeintliche Identität des unterbrochenen Gens. Es gibt drei Vorteile bei der Verwendung dieses transposome Mutagenese-Strategie. Erstens ist es nicht auf die Expression einer Transposase-Gen von der Wirts verlassen. Zweitens wird die transposome in den Ziel-Host durch Elektroporation, anstatt durch Konjugation oder Transduktion eingeführt und ist daher effizienter. Drittens macht die R6Kγ Replikationsursprung es leicht zu identifizieren, die die mutierte gene, die in einem rekombinanten Plasmid teilweise zurückgewonnen wird. Diese Technik kann verwendet werden, um die in anderen Eigenschaften von Enterobacter sp beteiligten Gene zu untersuchen. Ysu oder einer größeren Vielzahl von Bakterienstämmen.

Transformation von Enterobacter sp. Ysu durch Elektroporation mit dem transposome eingeleitet Zufalls Genom Insertion in das Wirtsgenom (1A, B). Eine erfolgreiche Elektroporation ergab mehrere tausend Transformanten, auf LB-kan Platten wuchs. Um 300-400 zu erhalten, gut verteilte Kolonien pro Platte, wurde die Menge der Transformationsmischung Spread an jedem LB-kan-Agar-Platte optimiert. Jeder Trans enthalten mindestens ein Transposon-Einsatz, aber es war nicht klar, ob ein wichtiges Gen für das Wachstum auf M-9-Medium wurde ohne Screening durch Replika-Plattierung unterbrochen. Transformanten wurden auf frische LB-kan Platten in Rastern von 88 und Replika auf M-9-Medium überführt. Hinweis, um sicherzustellen, dass das Transposon in den Trans gepflegt, das Protokolle Schnitt empfiehlt Zugabe Kanamycin zu den M-9 Mediumplatten. Das M-9-Medium wurde mit Kanamycin in diesem Fall ergänzt, aber es war immer noch möglich, ohne sie auxotrophen erhalten. In <strong&gt; Abbildung 2 zeigen die schwarzen Quadrate zwei Kolonien, die auf der LB-kan Platte (2A) wuchs aber nicht auf der M-9 Minimalmedium Platte (2B). Diese auxotrophen enthielten wahrscheinlich Unterbrechungen in Genen für die Synthese einer Aminosäure, einer Nukleinsäure oder einem Vitamin beteiligt, die in LB-Medium in M-9-Minimalmedium (1C) zu finden sind, jedoch nicht. Die anderen 86 Kolonien hatte keine Unterbrechung in einem Gen, das für das Wachstum auf M-9-Minimalmedium erforderlich ist. Einige Kolonien können mit benachbarten Kolonien während Replikaplattierung kontaminiert worden. Um eine Mutante als Reinkultur zu isolieren, wurde es von der LB-kan Platte Nummer eins in Schritt 3.1 auf eine frische LB-kan-Agar-Platte ausgestrichen und aufgewachsen O / N bei 30 ° C. Drei Kolonien, die wuchsen, wurden heraus auf einen zweiten frischen LB-kan-Platte ausgestrichen und aufgewachsen O / N bei 30 ° C. Dann wurde eine Kolonie, die von jedem der drei Kolonien entstanden auf einen dritten frischen LB-kan-Platte aufgetragen. Replikaplattierung wieder auf einem M-9 minimal mediähm Platte dreifach überprüft die auxotrophen Phänotyp, die in Abbildung 2 zu beobachten war. Von den 1.760 Transposon Transformanten in einem 2013 Microbial Physiology natürlich abgeschirmt, 23 waren Auxotrophen. Der unterbrochene Gen aus einem Auxotroph wurde dann unter Verwendung Gen Rettungs identifiziert. Eine auxotrophe Kolonie von der zweiten Streifenplatte über (Schritt 3.13) gezüchtet O / N in LB-Kan-Medium, und genomische DNA wurde aus der Kultur unter Verwendung einer genomischen DNA Purification Kit gereinigt. Agarose-Gelelektrophorese zeigte, dass die gereinigte DNA größer als 10 kb (Abbildung 3, Spur 2). Um die genomische DNA in kleinere Fragmente, die das Transposon enthält und der flankierenden Regionen unterbrochen Host (1D) zu brechen, wurde teilweise mit 0.025 Einheiten der BFU CI für 25 min bei 37 ° C verdaut. Diese Restriktionsendonuklease Schnitte an 5&#39;-GATC-3 &#39;Seiten, die etwa alle 200 bis 500 Basenpaare auf. ObwohlZwölf 5&#39;-GATC-3 &#39;Stellen innerhalb des Transposons, wird eine große Anzahl von Fragmenten, die das intakte Transposon flankierenden Wirtsgenom und noch in der teilweise verdaute DNA vorhanden sein. Spur 3 von Figur 3 zeigt genomische DNA teilweise verdaut mit einem Ausstrich der DNA beginnen oberhalb von 10 kb, den ganzen Weg zum Boden des Gels auf weniger als 0,5 kb. Wenn die DNA-Abstrich beginnt unterhalb 2 kb, die Größe des Transposons, dann die DNA wurde zu viel verdaut. Es wird notwendig sein, die Menge des zugegebenen Enzyms, die 37 ° C Inkubationszeit oder beides zu verringern. Wenn kein Abstrich und die Spur mit der verdauten DNA wird die gleiche Größe wie die DNA mit der unverdauten DNA, dann wird keine Verdauung stattgefunden hat. Es wird notwendig sein, die Menge des zugegebenen Enzyms zu erhöhen, die 37 ° C Inkubationszeit oder beides. Anstelle der Verwendung von BFU CI kann es möglich sein, die Verwendung der Restriktionsendonukleasen Bfa I oder Hae III, welches das Transposon an zwei und drei verschiedenen Stellen geschnitten,jeweils. Verwendung eines dieser Enzyme kann der E. erhöhen coli pir + Transformation Ausbeute bei Gen Rettung. Das teilweise verdaute DNA wurde in einer 500 ul-Reaktion ligiert. Dieses erhöhte Volumen minimiert Wechselwirkungen zwischen anderen DNA-Fragmenten und maximiert die Wahrscheinlichkeit, dass jedes Fragment mit sich selbst ligiert, eine zirkuläre Molekül zu bilden. Die ligierte DNA wird gefällt und durch Elektroporation in E. transformierten coli-Stamm ECD100D pir116. Der Transformationsansatz wurde auf LB-kan Platten verteilen. Kolonien, die wuchsen, enthielten ein neues Plasmid, das aus dem Transposon und einem Bereich der unterbrochenen Host-Gens (Figur 1E). Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten im Bereich von 0 bis 2000 pro ml Transformationsmischung. Wenn der flankierenden chromosomalen Region kodiert ein Protein, das toxisch für die E. war coli-Wirt, die Transformationseffizienz gering war oder nur ein kleines Segment des chromoeinige mit dem neuen Plasmid verbunden. Plasmid-DNA wurde aus einer Kultur, die mit einer einzigen Transimpft und mit der Restriktionsendonuklease Xho I, die eine einzelne Stelle in der Mitte des Transposons in der Nähe des 5&#39;-Endes des Kanamycin-Resistenz-Gen erkannt verdaut wurde gereinigt. Bahn 4 in 3 enthielt die unverdauten Plasmid und Spur 5 enthielt das verdaute Plasmid. Da gereinigte Plasmid-DNA neigt supercoiled werden, migriert es mit einer schnelleren Rate als den gleichen Strang des linearen DNA verdaut. Die richtige Größe Dieses Plasmid wurde 3 kb. Es enthielt 2 kb des Transposons, plus etwa 1 kb des unterbrochenen Wirtsgen. Wenn die flankierende DNA-Host eine oder mehrere Xho I-Erkennungsstellen zwei oder mehrere Bänder Plasmid wird in der Spur mit XhoI verdauten DNA beobachtet werden. Figur 4 zeigt ein Ergebnis für eine Sequenzierung Plasmid, das von einer auxotroph isoliert wurde. Nach dem Entfernen der short Transposon Sequenz fett wurde die Wirts-DNA-Sequenz für Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Analyse 7,8 vorgelegt. Einer der BLAST Ergebnisse zeigten, dass die unterbrochene Sequenz ähnelt einem Enterobacter cloacae subsp. cloacae NCTC 9394 (emb | FP929040.1 |) Gen, das für Chorismatmutase, die an der Biosynthese von L-Tyrosin und L-Phenylalanin (5) 13 beteiligt ist. Sich während der Ligation der teilweise verdauten genomischen DNA, ligiert der lineare Transposon an eine oder mehrere andere BFU CI-Fragmente. Dies kann die BLAST-Ergebnisse verwirrend, weil die Identität eines Gens ändert sich schlagartig. Beispielsweise können die ersten 41 Basenpaare der anderen auxotroph abgestimmt auf ein Gen für die Glutamat-5-Semialdehyd-Dehydrogenase, die Prolin-Biosynthese 1 beteiligt ist. Dann werden die nächsten 219 Basenpaaren mit einem Gen für ein Ribonukleosid-Diphosphat-Reduktase-Untereinheit, gefolgt von einer 62-Basenpaar-Segment für die Lipid-A-DISACC abgestimmt<html> haride Kinase. Die letzte 295-Basenpaar-Segment zu Glutamat-5-Semialdehyddehydrogenase abgestimmt erneut. Die Anwesenheit von 5&#39;-GATC-3 &#39;Stellen für BFU CI vorgeschlagen, dass zwei kleinere DNA-Fragmente in die geretteten Plasmid ligiert. Somit Verdünnung von teilweise verdauten DNA für Ligationsreaktionen nicht vollständig beseitigen Hintergrund, der durch die Ligation von kleineren Fragmenten entstehen. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die transposome einge sich in das Gen für die Glutamat-5-Semialdehyd-Dehydrogenase, weil die Sequenz für dieses Gen war unmittelbar neben dem Transposon. Anderen Auxotrophen enthalten Unterbrechungen in dem Gen für beta-Lyase Cystathion in Methionin-Biosynthese beteiligt ist; für Histidinoldehydrogenase in Histidin-Biosynthese beteiligt; für Phosphoserin-Phosphatase in Serin, Glycin und Cystein-Biosynthese beteiligt ist; und Ketol-Säure-Reduktoisomerase in Leucin, Isoleucin und Valin Biosynthese 1 beteiligt. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51934/51934fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Transposon-Mutagenese. (A) Bakterielle Zellen ein Gen, das für das Wachstum auf M-9-Minimalsalzmedium, das Glucose enthält, erforderlich ist, enthält. Die boxed M-9 für einen auxotrophen Gens. (B) Die transposome wird in den Bakterienstamm durch Elektroporation eingebracht und die Transposaseprotein jedem Mosaik Ende gebunden (Pfeile) nach dem Zufallsprinzip fügt das Transposon in das Wirtschromosom 3,4. Nur Transposon enthaltenden Transformanten auf LB-Kan-Medium-Platten zu wachsen. (C) Die Trans sind Replik auf M-9 Medium Glucose und auf LB-kan-Medium. Die Transformanten, die scheitern, auf M-9 Medium wachsen (durchgestrichene) Glucose sind Auxotrophen. (D) wird genomische DNA aus den Auxotrophen gereinigt und teilweise mit dem 4-Basis cutt verdautER, BFU CI, der die DNA-Region erkennt, 5&#39;-GATC-3 &#39;. (E) Die teilweise verdaute DNA wird mit T4-DNA-Ligase behandelt und durch Elektroporation in E. transformierten coli-Stamm ECD100D pir, um ein neues Plasmid, das das Transposon und die unterbrochene chromosomalen Gens, das für das Wachstum auf M-9 Medium erforderlich ist, enthält, zu bilden. Der PIR-Gen ermöglicht die ringförmige DNA-Fragmente, die die R6K γ Replikationsursprung in der Transposon als Replikationsursprung in der neuen Plasmid 6 dienen. Das Kanamycin-Resistenz-Gen dient als ein selektierbarer Marker für das neue Plasmid. Das Plasmid wird gereinigt und ein ~ 500 bp-Sequenz des unterbrochenen Gens unter Verwendung von Primern (Pfeile), die homolog zu jedem Ende des Transposons bestimmt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51934/51934fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2. Replica Plating. (A) Grid von Transformanten, die zu einer LB-kan-Agar-Platte transferiert. (B) Gitter der gleichen Trans, die zu einer M-9-Medium-Platte transferiert. Auxotrophe wuchsen auf den LB-Platten kan aber nicht auf den M-9 Medium-Platten. Diese werden durch die schwarzen Quadrate gekennzeichnet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51934/51934fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51934/51934fig3highres.jpg" width="250" /> Abbildung 3 0,8% Agarose-Gel-Weg. 1: 1 kb Leiter. Spur 2: Unverdaute genomischer DNA. Spur 3: BFU C I teilweise genomische DNA verdaut. Bahn 4: Unverdaute gerettet Plasmaid. Spur 5: Xho I verdaute Plasmid befreit. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51934/51934fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. partielle DNA-Sequenz eines Plasmid. Die Sequenz fett ist Teil des Transposons und wurde nicht für BLAST-Analyse unterzogen. Der Rest der Sequenz ist ein Segment der geretteten Gene vom Host. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51934/51934fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. BLAST-Analyse 7,8. Ausgehend von der ersten Basis (Query), wird das unterbrochene Gen ein Enterobacter cloacae Chorismatmutase, der Phenylalanin und Tyrosin-Biosynthese beteiligt ist, zu codieren.

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Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

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Nanyang Technological University

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Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K Aufrufe.  Youngstown State University.  Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert. 

Serie: Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...