קאיו אוסף זנים התקבלו מפרוייקט BioResource הלאומית (כוש, יפן): e. coli. אנו מודים החיבור דירק (המחלקה של החיים, אוניברסיטת אוסלו) על תמיכתו המתמשכת. עבודה זו מומן על ידי המועצה למחקר של חוקר צעיר נורבגיה גרנט 249793 (כדי ג'ק ג לאו).

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+precise+deletions+and+insertions+in+the+genome+of+wild-type+Escherichia+coli:+application+to+open+reading+frame+characterization.">Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization.</a> Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).</li><li>Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+in+vivo+genetic+engineering+in+E.+coli,+S.+enterica,+and+beyond.">Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond.</a> Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Recombinogenic+engineering--new+options+for+cloning+and+manipulating+DNA.">Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+Keio+collection+of+Escherichia+coli+single-gene+deletion+mutants.">Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants.</a> Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).</li><li>Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+of+systematic+in-frame,+single-gene+knockout+mutant+collection+of+Escherichia+coli+K-12.">The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12.</a> Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).</li><li>Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyamines+are+not+required+for+aerobic+growth+of+Escherichia+coli:+preparation+of+a+strain+with+deletions+in+all+of+the+genes+for+polyamine+biosynthesis.">Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).</li><li>Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+simvastatin+bioconversion+in+Escherichia+coli+by+deletion+of+bioH.">Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH.</a> Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).</li><li>Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+hydrogenase+3+is+a+reversible+enzyme+possessing+hydrogen+uptake+and+synthesis+activities.">Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).</li><li>Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disulfide+bond+formation+pathway+is+essential+for+anaerobic+growth+of+Escherichia+coli.">The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).</li><li>Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+approach+to+identify+the+genes+involved+in+biofilm+formation+in+E.+coli.">A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli.</a> DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).</li><li>Heinz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+features+in+the+structure,+mechanism,+and+biogenesis+of+the+inverse+autotransporter+protein+family.">Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).</li><li>Selkrig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+an+archetypal+protein+transport+system+in+bacterial+outer+membranes.">Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).</li><li>Stubenrauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+assembly+of+fimbriae+in+Escherichia+coli+depends+on+the+translocation+assembly+module+nanomachine.">Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).</li><li>Leo, J. C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc.">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li><li>M&#252;hlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Sch&#252;tz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+adhesin+A+(YadA)+-+Beauty+&amp;+beast.">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty &amp; beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins.">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li><li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport.">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li><li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins.">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+&#946;-barrel+proteins.">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane &#946;-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).</li><li>Mikula, K. M., Leo, J. C., &#321;yskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation.">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li><li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+genome+manipulation+by+P1+transduction.">E. coli genome manipulation by P1 transduction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).</li><li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+gal+U+gene+of+E.+coli+blocks+phage+P1+infection.">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21(DE3).">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization.">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li><li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments.">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

התמרה חושית P1 הוא שיטה מהירה, חזקה ואמינה ליצירת ג'ין מחיקות ב e. coli. זה מומחש פה transducing מוטציה מחיקה תמ א של זן התורם קאיו לנמען נגזר BL21. השלבים העיקריים בתהליך התמרה חושית הן את הייצור של transducing lysate, את התמרה חושית עצמה, הכריתה של קלטת ההתנגדות קאן, ואימות של עקום החוצה על ידי ה-PCR. בסך הכל, התהליך לוקח בערך שבוע 1 ודורש אין שיטות בביולוגיה מולקולרית כדי לשמש, מלבד ה-PCR הסופי עבור האימות. לפיכך, התמרה חושית P1 יכול להתחרות המתכלים במאמץ ובזמן עם λ רקומבינציה אדום, הוא מהיר יותר מסורתי סמן exchange מוטגנזה מכוונת.
פרוטוקול הציג היא חזקה מאוד ומאפשר שינויים רבים מהשלבים. עם זאת, ישנם מספר פרמטרים קריטיים. זיהומים P1, זה הכרחי להוסיף יונים של סידן המדיום. סידן יש צורך של ספיחה של phage של חיידקים, כשל כדי להוסיף סידן מספקת המדיום תפחית באופן משמעותי את היעילות של הזיהום. בקטריאלי כמה זנים כמו BL21ΔABCF נוטים לצבור בנוכחות2CaCl21. במקרים כאלה, ניתן לגדל את החיידקים ללא CaCl2, אשר ניתן להוסיף את המתלים זמן קצר לפני הזיהום. עם זאת, עבור קונבנציונליים יותר זנים, 10 מ מ CaCl2 ניתן לכלול במצע הגידול מההתחלה.
לעומת זאת, חשוב להסיר את הסידן חינם של המדיום לאחר התמרה חושית. ציטראט הוא chelator של יוני סידן, ומונע כי אלה יש צורך ספיחה של P1 לתאים המארח, הסרת את הסידן חינם של המדיום נוסף זיהומים. אם לא יוסר הסידן, phages יזהם נוספת לתאים בכל התרבות, לכל היותר להפחית את היעילות של התמרה חושית, במקרה הגרוע lysing את כל התרבות, כולל את transductants.
עוד צעד קריטי הוא culturing חיידקים נושאת את pCP20 פלסמיד. pCP20 הוא פלסמיד מותנית שכפול זה לא לשכפל בטמפרטורה של 37 ° C ומעלה; לכן, כדי ליצור את פלסמיד בתאים, incubations עם פלסמיד הזה חייב להיות שבוצעו ב 30 ° C (או נמוכים יותר), טמפרטורה מתירניות עבור השכפול של pCP20. לריפוי pCP20, משמש חום גבוה (43 ° C). זנים מסוימים לא גדלים טוב בטמפרטורה זו; במקרים כאלה, מהטנק 37 ° C, למרות פלסמיד לריפוי יהיה פחות יעיל בטמפרטורה זו.
כאשר ציפוי חיידקים לבדוק רגישות לאנטיביוטיקה, הסדר של צלחת ומבטא הוא חשוב. הפרוטוקול מצריך שיבוטים להיות רץ בעירום קודם על המכיל אנטיביוטיקה צלחות, ולבסוף באמצעי לא בררניים. בדרך זו, החוקר יכול להיות בטוח כי כל חוסר צמיחה באמצעי התקשורת סלקטיבי יהיה בשל רגישות לאנטיביוטיקה, יותר מאשר על חוסר חומר פוטנציאליים מועברים על הלוחות. בעקבות הפרוטוקול, אין התפתחות על ק ג + קן צלחת מאמת הכריתה של קלטת ההתנגדות קאן; אין צמיחה על ק ג + מגבר צלחת מאמת את אובדן רקומבינציה פלסמיד pCP20; זנים הגדלים על הצלחת ליברות (אשר לא צמח בניסוי streaking אותו על לוחות בחירה) יכיל את ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים חיובי.
רוב הצעדים אחרים מאפשרים מרחב תמרון ניכר. בפרוטוקול כפי שהוצג, BL21ΔABCF הוא תרבותי ב 30 מעלות צלזיוס, כמו זה זן לא גדל טוב ב 37 º C. עם זאת, ייתכן תרבותי זני החיידק ללא פגמים הצמיחה ב 37 מעלות צלזיוס (למעט כאשר הפך עם pCP20).
מספר החיידקים המשמשים עבור זיהומים יכולים להיות מגוונים במידה מסוימת. הקשר בין OD600 ספירה מעשית הוא בערך ליניארי בין ערך600 OD של 0.1 1.0, איפה שהראשון מתאים כ 108 cfu/mL, והשני אל ~ 109 cfu/mL.... עם זאת, קשר גומלין זה עשוי להשתנות במידה מסוימת בהתאם המתח המדוברת, מדיום הגידול וגורמים אחרים. מומלץ כי יש להקים את היחסים בין OD600 הרוזן קיימא לכל מעבדה או להתאמץ, במיוחד עבור חישוב ערכים MOI. מספר החיידקים המשמשים בניסויים זיהום זה לא קריטי במיוחד, 109 cfu/mL מייצג שלב נייח מוקדם, אשר היא פשרה סבירה בין צפיפות התאים את הפרופורציה של התאים קיימא בתרבות. אם מספר נמוך יותר של חיידקים קיימא משמשים עבור התמרה חושית, המספר של phages פשוט צריך להיות מותאם בהתאם. גם יכולים להיות מגוונים למשרד הפנים עצמו במידה מסוימת. הפרוטוקול קוראת ערך MOI של 0.5, למרות משהו בין 0.1-0.5 יביא יעילות טובה. בבית עבדכם של 0.5 היחס של phages חיידקים הוא 1:2 (כלומר, חצי מספר phages לעומת מספר חיידקים). בדוגמה בפרוטוקול, ה OD600 של התרבות הוא 1.0, 1 מ"ל של התרבות משמש התמרה חושית; לכן, מספר phages הנדרש הוא 5 x 108. ערך MOI של 0.5 מעניקה רמה גבוהה של זיהום אך מפחית את מספר החיידקים שהודבקו כפליים, אשר יפחית את היעילות של התמרה חושית כפי phages (מדבקות) פראי-סוג רחוק עולים במספרם על phages transducing. זיהום כפול עם phage transducing של, של phage זיהומיות יוביל תא פירוק, וכך למנוע הזה transductant מהמאגר של ניצולים. לכן, MOI של 0.5 צריך לא להיות חריגה.
הפרוטוקול מאפשר גם כמה קיצורי דרך. במקום מכינים lysates של צלחות, יש מחברים עו ד הכנת phage lysates נוזלי בינוני29. זה יכול לחסוך זמן כפי שלב הדגירה לילה לא נחוצה. באופן דומה, titrating את phage lysate ייתכן שלא יהיה צורך. כפי שצוין לעיל, למשרד הפנים הוא לא מאוד קריטי, יעילות סבירה יכולה להיות מושגת על ידי פשוט בהנחה של כייל של 1010 pfu/mL עבור תקן lysate.
למרות הקלות של הטכניקה, התמרה חושית P1 אינה ישימה אוניברסלית, חייבים להתקיים מספר תנאים כדי שזה יהיה שימושי. ראשית, המתח תורם עם אלל הנוק-אאוט לבחירה חייבת להיות זמינה. זו מושגת בדרך כלל על-ידי שימוש מחיקה איפה קלטת עמידות לאנטיביוטיקה החליף את הגן עניין. האוסף קאיו שימושי במיוחד בהקשר זה, כפי שהוא מציע ספרייה מוכן לשימוש של ג'ין מבוססי קלטת לאנטיביוטיקה טוק-outs מכסה כמעט את כל הגנים שאינם חיוניים ב e. coli K12. אוסף זה שימושי במיוחד ששילמת את הגנים שנשמרת נמצאו רוב זני החיידק (קרי, המרכיבים של הגנום core e. coli ). עבור גנים פחות נפוצים, כגון הגורמים התקפה אלימה של פתוגניים החיידק זנים או הגנים נדירה מסלול מטבולי, המוטציה ייתכן שיהיה צורך ליצור דה נובו. במקרים כאלה, P1 התמרה חושית לא ייתכן שיטת הבחירה. בנוסף גנים חיוניים, גנים הדרושים עבור זיהום P1, המשמעותי, מוטציות אשר להוביל P1 ההתנגדות30, הם מטרות המסכן עבור מחיקה על-ידי התמרה חושית P1. הערה נוספת בעת שימוש האוסף קאיו, באופן ספציפי, הוא כי כמה זנים לבצע שכפול של הגן יישוב, שבו רק עותק אחד הופרעו על ידי קן ההתנגדות קלטת8. במקרים כאלה, הגן עניין עשוי להיות חיוני; החוקרים מומלץ לבדוק ביאורים מעודכנים עבור גנים כאלה8. עם זאת, בהתחשב הרסנים האלו, התמרה חושית P1 מאפשרת את המחיקה של גנים רוב זני החיידק מעבדה. לדוגמה, ההבדלים בין BW25113 לבין BL21(DE3) קטנים ומשפיעים רק קומץ של חלבונים הגנים31.
שנית, חשוב להדגיש כי המתח. הנמען חייב להיות מסוגל רקומבינציה הומולוגית עבור התמרה חושית לעבודה. זן חסר את recombinase שרקה יכול, לפיכך, לא ניתן לשנות בשיטה זו. לא כולל את כל זני שיבוט רגיל, כגון DH5α, HB101, TOP10 כחול XL-1. רקה יכולים לתווך recombinations בין קצר ככל 8 זהים מותח bp; עם זאת, אזור זמן של דמיון גבוה יהיה להגדיל את ההסתברות של רקומבינציה באופן משמעותי32,33. בעיה נוספת, במיוחד עם קליניים e. coli זנים, הוא זמן O אנטיגן שרשראות עשוי להסוות את הקולטן עבור P1, אשר טמון של פחמימה # מיון הליבה הפחמימות ליפופוליסכריד34. בנוסף לדרישות אלו לזן של הנמען, המתח P1 שימוש עבור התמרה חושית צריך להיות מוטציה vir ; מוטציה זו נדרשת עבור זיהום lytic מלא35.
אזהרה שלישית של התמרה חושית נמצא כי הגן לנוק אאוט צריך שוכנים באזור עם דמיון גבוהה באזורי איגוף בין התורמים לבין זנים נמען P1. אם יש חוסר synteny בין הזנים, ההחלפה של הגן היעד קידוד רצף בקלטת קאן עשויה היטב להיכשל, בגלל ההבדלים בתוכן של האזורים איגוף. לכן, לפני היציאה בתיווך P1 גן מחיקה, החוקרים לבדוק הרצפים של זנים התורם ואת נמען כדי לוודא רצפי איגוף הומולוגיים. כמובן, הדבר אפשרי רק אם יש כבר וסודרו הזנים. במקרה של זנים עם רצף לא ידוע, התמרה חושית P1 עלול להיכשל או לגרום לבעיות אחרות, כגון המרה גנים באזורים איגוף. P1 יכול מגלי כ 90 kilobase זוגות של DNA; אם קיימים הבדלים בתוכן גנים באזורים סביב הגן המטרה (למשל, מחיקות קטן או הוספות), סביר להניח כי אלה להגדרתו רצף התורם. אולי יש לזה השלכות בלתי מכוונות על פנוטיפ של המתח. הנמען. לכן, במידת האפשר, הרצפים של התורם, נמען ברחבי הגן עניין תמיד יש להשוות לפני התמרה חושית P1.
לסיכום, התמרה חושית P1 הוא דרך מהירה של העברת גנים ספציפיים את מדהימה של מספר זנים, ברגע המוטציה מעלף הראשונית נוצרה. על פי השיטה יש מגבלות משלו, קלות ומהירות של יישומה להגיע חלופה אטרקטיבית בשיטות אחרות של ג'ין מחיקה P1 משפיע רק על e. coli, אשר בדרך כלל מגביל את השימוש בו מין זה. עם זאת, מספר וריאציות של P1 פותחו כי יש טווח רחב יותר של המחשב המארח, יכול להדביק מינים אחרים בתוך המשפחה Enterobacteriaceae, ואפילו כמה מינים וγ-proteobacterial אחרים, גם אם במחיר מופחת יעילות36, 37. אפילו התמרה חושית של דנ א המשוכפל של e. coli Myxococcus xanthus, אלפא-proteobacterium, כבר דווח על38. בניסויים בעתיד, גרסאות אלה יכול להיות מרובדת עם המוטציה vir כדי להרחיב את מגוון זנים הנמען בשימוש ג'ין מבוססי קלטת לאנטיביוטיקה מחיקה על-ידי כללי התמרה חושית.

גישה ראשונה משותפת ללמוד את הפונקציה של הגן הוא ביצוע מעלף מוטגנזה מכוונת ולבחון את פנוטיפ וכתוצאה מכך. זה נקרא גם גנטיקה הפוכה. חיידק e. coli כבר סוס עבודה של ביולוגיה מולקולרית במשך 70 השנים האחרונות, או אז, בגלל הקלות של culturing שלה, שלה amenability מניפולציה גנטית1. פותחו מספר שיטות כדי לייצר ג'ין מחיקות ב e. coli, כולל סמן exchange מוטגנזה מכוונת2,3 , לאחרונה, recombineering באמצעות λ אדום או Rac ET מערכות4,5 , 6.
במערכת בשימוש נרחב, קידוד רצף של גנים יחידניים מוחלפים קלטת עמידות לאנטיביוטיקה זה אפשר להוציא אחר כך5,של כרומוזום7. רצפי קידוד מוחלפים, למשל קלטת ההתנגדות kanamycin (קאן), אשר מוקף flippase (FLP) זיהוי אתרי היעד (והשפלתם) משני הצדדים. האתרים והשפלתם מזוהים על-ידי recombinase FLP, אשר שמתווכת בייעודי לאתר רקומבינציה בין האתרים והשפלתם שמוביל המחיקה של קלטת קאן. בדרך זו, פעולת מחיקה מלאה של רצף קידוד של גן מסוים יכולה להיות מושגת, משאיר מאחור רק צלקת מינימלית רצף של בסיסי כ-100 זוגות (bp) (איור 1).
רק לפני כעשור, פותחה האוסף קאיו כביכול. זוהי ספרייה חיידקי בהתבסס על מעבדה סטנדרטיים זן K12 e. coli , שבו כמעט כל הגנים שאינם חיוניים נמחקו בנפרד על ידי λ רקומבינציה אדום7,8. בתוך אוסף זה כל שלשיבוטים רצף קידוד אחד הוחלפו קלטת התנגדות ניתן לניתוח קאן. האוסף קאיו הוכיחה להיות כלי שימושי עבור יישומים רבים9. יישום אחד כזה הוא הייצור של מחיקה מוטציות בזנים אחרים e. coli . יכול להיות גייסה בקלטת קאן שיבוט נתון מחיקה מאת בדרך כלל transducing bacteriophages, כגון P110,11,12,13,14. מניה phage שהוכנו בכזה מתח יכול לשמש לאחר מכן להדביק את הנמען e. coli זן של עניין, איפה בתדר נמוך אבל אמין קן אזור המכילים קלטת ניתן לשלב לתוך הגנום הנמען מאת רקומבינציה הומולוגית (איור 2). Transductants ניתן לבחור את הצמיחה על המדיום המכיל קאן. בעקבות זאת, אם הסרת הקלטת עמידות לאנטיביוטיקה היא הרצויה, recombinase FLP יכולות להיות מסופקות המתח transductant טרנס. לאחר ריפוי של פלסמיד המכיל FLP, אשר נושאת סמן ההתנגדות אמפיצילין (אמפר), שיבוטים קאן לבין מגבר רגיש מוקרנים במשך ולאחר הכריתה הנכון של הרצף פראי-סוג קידוד ובקלטת קאן אומתו המושבה PCR.
. הנה, פרוטוקול מפורט מוצג, המתארת את כל השלבים בהפקת זן e. coli בהתבסס על האסטרטגיה שפורטו לעיל את מדהימה. כדוגמה, הוא הפגין מחיקה של הגן בתמ א . תמ א מקודד חלבון β-חבית של הממברנה החיצונית היא חלק של הובלה, הרכבה מודול (TAM), אשר עוסקת להן autotransporter חלבונים מסוימים, pili15,16,17. זן זה מעלף שימש אז כדי לבחון את ההשפעה של המחיקה תמ א על להן של trimeric autotransporter שתי adhesins (תעש), adhesin Yersinia את ידה של אימונוגלובולין e. coli (Ig)-מחייב TAA EibD 18,19.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Wild-type strain of Keio collection</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>Expression strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>Derived from BL21(DE3)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; deletion mutant</td></tr><tr><td>P1 &lt;em&gt;vir&lt;/em&gt;</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>Generally transducing bacteriophage</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>conditionally replicating plasmid with FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of EibD; plasmid available on request</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of YadA; plasmid available on request</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>anti-collagen type I antibody COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>Bovine collagen type I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium hydrogen phosphate</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>DNA dye</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA molecular size marker</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP substrate</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl thiogalactoside</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-lauroyl sarcosine</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; forward primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-GAAAAAAGG&lt;br /&gt;ATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-TCATAATT&lt;br /&gt;CTGGCCCCAGACC-3&#039;</td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis chamber</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>Bead beater</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation unit</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>Incubating shaker</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Microwave oven</td><td>Samsung</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>PCR strips</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>Wet transfer unit</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

בגישה הראשונה ללמוד את תפקוד ג'ין לא ידוע של חיידקים היא ליצור את מדהימה של הגן הזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול חזקה ומהירה להעברת מחיקה מוטציות מהמאמץ Escherichia coli אחד למשנהו באמצעות bacteriophage P1 שימוש התמרה חושית מוכללת. שיטה זו דורשת כי המוטציה להיות ניתן לבחירה (למשל, בהתבסס על הפרעות גנטי באמצעות קלטת לאנטיביוטיקה הוספות). קלטות לאנטיביוטיקה כזה יכול להיות גייסה מכל זן התורם מוחדרים זן הנמען עניין במהירות, בקלות ליצור מוטציה מחיקה ג'ין. ניתן לעצב בקלטת לאנטיביוטיקה כדי לכלול flippase זיהוי אתרים המאפשרים הכריתה של הקלטת על ידי recombinase בייעודי לאתר כדי לייצר את מדהימה נקי עם רק צלקת ~ 100-בסיס-זוג-ארוך רצף הגנום. אנו מדגימים את הפרוטוקול על ידי לדפוק את הגן של טאמה קידוד גורם הרכבה מעורב autotransporter להן, לבחון את השפעת הזה מעלף על להן והתפקוד של שני trimeric autotransporter adhesins. למרות המחיקה הגן על ידי התמרה חושית P1 יש מגבלות משלו, קלות ומהירות של יישומה להגיע חלופה אטרקטיבית בשיטות אחרות של ג'ין מחיקה

מהדור תמ א הנוק-אאוט של BL21ΔABCF:
האסטרטגיה שפורטו לעיל בעבר שימש כדי לייצר זן נגזרות של BL21(DE3), זן מעבדה סטנדרטי המשמש לייצור חלבון, אשר אופטימיזציה עבור ייצור החלבון הממברנה החיצונית, שנקרא BL21ΔABCF21. זן זה חסר ארבעה גנים קידוד חלבונים בשפע הממברנה החיצונית, כתוצאה מכך, הוא מסוגל לייצר חלבונים הממברנה החיצונית ביטוי יותר heterologously מאשר המתח פראי-סוג. כדי לבדוק אם TAM מעורב TAA להן, הגן של טאמה נמחק ברקע הזה.
P1 lysate הוכן בגלל הלחץ אוסף קאיו JW4179, איפה הגן בתמ א (בעבר נקרא yftM) קידוד רצף מוחלף על ידי קלטת ההתנגדות קאן. לאחר מכן, ניסוי התמרה חושית בוצעה עם BL21ΔABCF כמו המתח. הנמען. מספר מושבות עמידים קאן התקבלו, אחרי אשר שניים נבחרו הכריתה של קלטת קאן. PCP20 פלסמיד, קידוד recombinase FLP, הציגו לתוך שיבוטים אלה, לאחר מכן, נרפא על ידי הגדלה ב 43 ° C, בהעדר למבחר לאנטיביוטיקה. מספר שיבוטים הוקרנו על רגישות המגבר (אשר מהווה סמן של pCP20) והן קאן, רגיש לשני מספר שיבוטים התקבלו. שיבוטים אלה אומתו על ידי המושבה PCR באמצעות תחל איגוף תמ א קידוד רצף ומצא כי הגן תמ א בהצלחה נמחקה (איור 4).
התפקיד של תמ א TAA להן:
תמ א הוכח להיות מעורב להן של כמה autotransporters קלאסית16 וה-intimin הפוך autotransporter15. כדי לבדוק אם תמ א חשוב להן של תעש, Δ BL21ΔABCFתמ א הפך עם פלסמידים קידוד חלבונים מבחן שני, את adhesin Yersinia בלה ו- e. coli Ig מחייב חלבון EibD. חלבונים אלה ידועים express גם ב e. coli ו שימשו כמודלים TAA להן מחקרים קודמת23,28.
לאחר גרימת ייצור החלבון, שברים הממברנה החיצונית של התרבויות ביטוי היו מבודדים, נותחו על ידי עמודים מרחביות. הדגימות היו מבושלים לא להפגין trimerization של החלבונים. Trimers להפעיל בגדלים מעל 100 kDa, ואילו מונומרים לצפות בגדלים 45 kDa (בלה) ו- kDa 51 (EibD). אין הבדלים משמעותיים נצפו בין רמות הביטוי של BL21ΔABCF BL21ΔABCF Δתמ א, למרות בלה נראה להיות מיוצר ברמות נמוכות במקצת בנימהשל טאמה Δ (איור 5A). עם זאת, ההיפך נראה אם זה EibD.
כדי לבחון אם חוסר של תמ א עלולה להשפיע את הנכון מתקפלות או הובלה של החלבונים, נבחנה יכולתם כדי לאגד ליגנדים. על ידה, זה בוצעה על ידי אבן חשופה רחוק-מערבי של קולגן (איור 5B). בלה, שני זנים, מסבת קולגן ברמה דומה, הוכחת כי החלבון הוא כראוי מקופל ופונקציונליים. בדומה לכך, פעילויות IgG-איגוד של EibD שני זנים בקורלציה עם רמת ביטוי (איור 4C). תוצאות אלו מדגימים כי המחיקה של תמ א אין השפעה משמעותית על TAA להן, לפחות לא עבור אלה תעש דגם שני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig1.jpg"> איור 1: דור של טוק-outs עם קלטות אנטיביוטי ניתן לניתוח. להפקת ג'ין טוק-ודוק, גן עניין (B. ג'ין בדוגמה זו) מוחלף על ידי קלטת ההתנגדות קאן ולצדו והשפלתם אתרים. בקלטת והשפלתם-קאן, בתורו, מוקף קצר (~ 50 bp) משתרע רצף הומולוגי לאזורים ויוצאת לכמה גנים רצף קידוד של הגן B היא להחליף את הקלטת והשפלתם-קאן מאת λ רקומבינציה אדום. ברגע מטרה זו מושגת, ניתן להסיר את הקלטת קאן עצמה על ידי החדרת את recombinase FLP, אשר לתווך של רקומבינציה בייעודי לאתר בין האתרים והשפלתם. זה excises את הקלטת קאן, עוזב מינימלית (~ 100 bp) צלקת רצף לוקוס B. לקבלת פרטים מלאים, ראה בבא. et al. 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig2.jpg"> איור 2: ג'ין מחיקה על-ידי התמרה חושית P1. התורם זן נושאת (בז) קלטת קאן זה החליף את הגן עניין (צהוב) בכרומוזום (כחול). התורם נגוע P1 bacteriophage. Phage הכפלת בנימה התורם, לייצר מספר גדול של progenies. ביותר הם פראי-סוג (הגנום אדום), אך חלק קטן הם transducing phages אשר שילבו חלק תורם למתח כרומוזום במקום phage הדנ א (הגנום כחול). שיעור של אלה יכיל את הקלטת קאן (הגנום צהוב). בסופו של דבר, התא הנגוע מארח הנה קטעי. העיתונים ומשחרר את phages לתוך האמצעי. אלה משמשים כדי להכין את lysate. התמרה חושית לניסוי, המתח. הנמען (תכלת) נגוע lysate שהוכנו המתח התורם. במיעוט מהמקרים, הנמען הוא נגוע phage transducing נושאת את הקלטת קאן (המוצג כאן). אם האזורים הסמוכים בקלטת קאן לעבור רקומבינציה הומולוגית, בקלטת קאן הוא שולב את כרומוזום הנמען. אלל אנדוגני, וכתוצאה מכך שיבוטים קאן עמידים שניתן לבחור עבור החלפת. התוספת של FLP recombinase על פלסמיד לריפוי excises את הקלטת קאן, עוזב רק צלקת קצרה רצף (המוצג כאן בצהוב), אשר חוזרת השיבוט כדי פנוטיפ קאן-רגיש. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig3.jpg"> איור 3: דוגמאות צלחות לאחר זיהום P1. (א) לוח זה מראה לצלחת עם לוחות בודדים. (B) לוח זה מציג צלחת confluent למחצה. (ג) לוח זה מציג צלחת יתר נגוע, שבו כמעט כל החיידקים יש כבר lysed על ידי phage. כמה מושבות עמיד גדלו מחוץ לשכבה העליונה אגר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig4.jpg"> איור 4: מחיקת תמ א קידוד רצף. אלל מחיקה tamA::kan הוכנס המתח BL21ΔABCF על ידי התמרה חושית P1. לאחר הכריתה של קלטת קאן, רצף צלקת (~ 100 bp) הוא כל שנותר על מיקומה של טאמה . זה אומתה על ידי ה-PCR, באמצעות תחל איגוף האתר מחיקה. BL21ΔABCF, זן האב שלו, BL21(DE3), ה-PCR נותן מוצר האורך של תמ א קידוד רצף (הגודל הצפוי הוא 1.7 kilobase זוגות). BL21ΔABCF, איפה יש כבר חתכתם את הקלטת קאן, המוצר מתאים רצף הצלקת הצפוי (145 bp). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58267/58267fig5.jpg"> איור 5: ביטוי של תעש על ידי זן מחיקה בתמ א . (א) לוח זה מראה מרחביות-הדף של ממברנות החיצוני מוכן מתאי לבטא תעש (בלה או EibD) ופקדים וקטור (pIBA2 ו- pET22). הזנים הם BL21ΔABCF שלה זן נגזרות חסר בתמ א (ΔtamA). (B) לוח זה מראה אבן חשופה רחוק-מערב קולגן בלה דגימות. בלה ודוגמאות של פאנל A פקדים pIBA2 הועברו קרום PVDF, מודגרות עם סוג הקולגן. הם היו לאחר מכן נחקר עם נוגדן אנטי-קולגן, זוהה על ידי ECL. (ג) לוח זה מראה של וזמינותו מחייבת נוגדנים עבור דגימות EibD. דוגמאות EibD ופקדים pET22 פאנל A היו הועבר קרום PVDF מודגרות עם נוגדן משני מצומדת HRP, אז זוהה על ידי ECL. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/58267fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>1 x מיקס</td>
			<td>7 x מיקס</td>
		</tr>
<tr>
<td>כיתה ה-PCR מים</td>
			<td>17 ΜL</td>
			<td>119 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x פולימראז מאגר</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>14 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיקס deoxyribonucleotide 10 מ מ</td>
			<td>0.4 ΜL</td>
			<td>2.8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר לפנים 100 מיקרומטר</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
			<td>1.4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר הפוכה 100 מיקרומטר</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
			<td>1.4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq DNA פולימראז</td>
			<td>0.2 ΜL</td>
			<td>1.4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>140 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: המושבה PCR מאסטר מיקס. מכמות תערובת תלויה במספר מושבות שיוקרנו. בנוסף, להכין תגובה שליטה (זן הנמען המקורי). למשל, אם הקרנה שיבוטים חמש, שש תגובות נדרשים, כולל את הפקד. זה שווה הכנה לתגובה נוספת כדי לוודא שאין מספיק לערבב PCR עבור כל הדגימות (חזר pipetting מגביר את שגיאות pipetting קטנות). בדוגמה זו, להכין תערובת 7 x (5 מושבות, שליטה 1 ו 1 תגובה נוספת).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שלב</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
			<td>הערות</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>3 דקות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2.</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3.</td>
			<td>50 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4.</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>2 דקות</td>
			<td>1 דקות/kb, הגברה לכנס</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">לחזור שלב 2 24 פעמים</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5.</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>6.</td>
			<td>12 ° C</td>
			<td>לנצח</td>
			<td>להחזיק הסופי</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: המושבה PCR התוכנית.
1 הקבצים המשלימים: דוגמה של המושבה רשת. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58267/Supplementary_file_1.pdf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes at JoVE.com

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

producing-gene-deletions-escherichia-coli-p1-transduction-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

16.9K Views.  University of Oslo. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

Video: Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Bioengineering

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Immunology and Infection

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Biology

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

דור של<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

משלוח בתיווך הפאג של ממוקדת Srna בונה להפיל Gene Expression ב<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב

מחיקות Gene הגנום ב

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

דור של

משלוח בתיווך הפאג של ממוקדת Srna בונה להפיל Gene Expression ב

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים