Diese Arbeit wurde unterstützt durch die R01AI118694 NIH Grant, Michael R. Betts, worunter Sub Award 566950, Yuri Sykulev. Wir danken der Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging geteilt Ressource für ihre hervorragende Unterstützung.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki. Schriftliche Einwilligung wurde von allen Teilnehmern, und Blut-und Lymphknoten wurden mit Zustimmung des Institutional Review Board an der University of Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056) erworben. Alle Probanden waren Erwachsene. Schnur Blutproben wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von wehen und der Geburt von der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie an der Thomas Jefferson University. Alle Proben wurden anonymisierte.
1. Isolation von CD4+ T-Zellen für eine Bildanalyse
<ol><li>
Tauen Sie eine 1 mL-aliquoten, 107 eingefroren peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder Lymphknoten mononukleären Zellen (LNMCs) aus gesammelten Proben enthalten. Fügen Sie in einem sterilen Haube die aufgetauten Zellen 9 mL RPMI ergänzt mit Penicillin/Streptomycin und Glutamin hinzu.
	<ol>
<li>Entmischen der Zellen für 10 min bei 300 X g bei 4 ° C, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen in 5 mL ergänzt mit 10 % RPMI FBS (komplette Medium). Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in eine CO2 Inkubator bei 37 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am nächsten Tag reinigen CD4+ T-Zellen durch negative Immunomagnetic Sortieren mithilfe eines handelsüblichen Kits nach Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Um die Anzahl der frisch gereinigten CD4 Messen+ T Zellen, mischen Sie 5 µL Zellsuspension mit ein gleiches Volumen einer Trypan blau-Lösung. Laden Sie eine Hemocytometer mit einer Zelle-Trypan blau Mischung und zählen die lebenden Zellen in den 5 Abschnitten der Hemocytometer.</li>
	<li>Nehmen Sie den Durchschnitt der Zellzahl und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in der ursprünglichen Zellsuspension: die Anzahl der Zellen/1 mL = durchschnittliche Anzahl x 2 x 104. Wenn die Gesamtzahl der isolierten Zellen zu klein ist, verwenden Sie die Zellen ohne zu zählen ist.</li>
	<li>Die Zellen bei 300 X g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen in einem testpuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-Glucose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2und 1 % menschliches Serumalbumin) bei 105 < /C13 > Zellen/50 µL oder weniger und halten die Zellen bei 4 ° C (für 1 – 2 h) bis zum Gebrauch in den Experimenten.</li>
	<li>Entsorgen Sie alle biologischen Abfälle gemäß den einschlägigen institutionellen Richtlinien.</li>
	<li>Auf Wunsch als eine Kontrolle Zellpopulation bereiten aktivierte CD8 T-Zellen aus Nabelschnurblut PBMC, 107 platzzellen in 5 mL komplette Medium in einem T25-Kultur-Kolben, bedeckt mit einer Mischung aus Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper bei 10 µg/mL und 1 µg/mL , beziehungsweise.</li>
	<li>Am nächsten Tag die aktivierten Nabelschnurblutzellen aus der Flasche zu entfernen, waschen Sie sie 1 X mit frischem Medium vervollständigen und erweitern die Zellen in Anwesenheit von rekombinanten IL-2 (100 U/mL) für 2 Wochen.</li>
	<li>Reinigen Sie die Nabelschnurblut CD8+ T-Zellen durch negative Immunomagnetic Sortieren mit dem kommerziell erhältlichen Kit nach Anweisungen des Herstellers. Zählen der Zellen und die Medien in den Assay-Puffer austauschen, wie 1,3-1,6 für LN und PB CD8 beschrieben+ T Zellen.</li>
</ol>(2) Komponenten für die Herstellung von planaren Lipid Bilayer
<ol><li>3 Arten von Liposomen, wie an anderer Stelle5beschrieben vorbereiten: (a) 0,4 mM DOPC (1,2-Dioleoyl -sn- Glycero-3-phosphocholin) Liposomen, (b) 0,4 mM DOPC Liposomen mit 33 mol-% Hunde-NTA (1,2-Dioleoyl -sn- Glycero - 3-[(N-(5) Amino-1-Carboxypentyl) Iminodiacetic Acid) Succinyl] (Ammoniumsalz)) Lipide, (c) 0,4 mM DOPC Liposomen mit 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-Dioleoyl -sn- Glycero-3-Phosphoethanolamine - N-(GAP Biotinyl) (Natriumsalz)).</li>
	<li>
5 % Kasein-Lösung als zuvor beschriebenen5vorbereiten.
	<ol>
<li>5 g Casein Pulver in 100 mL Reinstwasser auflösen und Hinzufügen von 350 µL 10 M Natronlauge. Rühren Sie alles auf eine regelmäßige Magnetrührer mit langsamer Geschwindigkeit anhand der verfügbaren Skala bei Raumtemperatur für 2 h, und dann über Nacht bei 4 ° C. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 und Ultrazentrifugen Lösung für 2 h bei 100.000 x g bei 4 ° c Filtern Sie den Überstand mit einem sterilen 0,22 µm-Filter und speichern Sie die Lösung in Aliquote bei-80 ° C. Achtung: Natronlauge kann Verätzungen verursachen und kann dauerhafte Erblindung bei Berührung mit den Augen verursachen. Verwenden Sie Gummihandschuhe, Sicherheitskleidung und Augenschutz beim Umgang mit dieser Chemikalie oder seine Lösungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Label Anti-CD3-Antikörper mit Biotin, Mono-Bionylated Antikörper-Moleküle mit einem zuvor beschriebene Vorgehensweise8zu produzieren.
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von Biotin-PEO4-NHS in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) 0,1 mg/ml. 1 mg des Antikörpers in 0,5 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 100 mM Sodium Bicarbonat fügen Sie 3,7 µL der Biotin-PEO4-NHS-Lösung hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei Raumtemperatur. Bereiten Sie eine Lösung von Alexa Fluor-488-NHS Ester bei 10 mg/mL in DMSO. Der Antikörper mit der Bezeichnung Biotin-PEO4-NHS bei einem 10-divisibel molaren Überschuß fügen Sie die Alexa Fluor-488-NHS Ester Lösung hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung für 1 h bei Raumtemperatur unter langsamen rühren auf eine regelmäßige Magnetrührer. Trennen Sie den ungebundenen Farbstoff mit Größe-Ausschluss-Chromatographie.</li>
		<li>Die antikörperkonzentration zu bestimmen, durch Messung der optischen Dichte der Antikörper-Lösung bei 280 nm (ein280). Messung die optische Dichte der beschriftete Antikörper bei 577 nm (ein577).</li>
		<li>Bestimmen Sie die Farbstoff-Antikörper-Verhältnis unter Verwendung der folgenden Gleichung: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58143/58143eq1.jpg"> Hinweis: Weitere Details finden Sie im Protokoll des Herstellers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Drücken Sie ein rekombinantes lösliches ICAM-1-Protein in eine Drosophila -Expressionssystem wie zuvor beschrieben,3,4,9,10.
	<ol>
<li>Klon mit cDNA Kodierung, die ektodomäne von ICAM-1 in Drosophila Ausdruck Vektor pMT/V5-sein mit einem induzierbaren Metallothionein Promoter herstellen ein rekombinantes Protein angehängt mit seiner6 -Tag auf der C-terminalen Ende.</li>
		<li>Co transfizieren Sie S2-Zellen mit der daraus resultierenden ICAM-1 enthaltenden Plasmid und eine G418 Expressionsvektor. Wählen Sie stabile Transfectants mit Schneiders Drosophila Media ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS) und 0,5 mg/mL G418 für 3 Wochen. Erweitern Sie die Zellen im Insekt serumfreien Medium und induzieren Sie eine Protein-Expression mit 0,5 mM CuSO4 für 3-d.</li>
		<li>Konzentrieren sich die Kultur überstand 10 X und Dialyse gegen PBS über einen tangentialen Fluss Konzentrator als zuvor beschriebenen11.</li>
		<li>Wenden Sie die geballte Kultur überstand auf eine Spalte mit Sepharose mit einem kovalent immobilisierte Anti-ICAM-1 monoklonale Antikörper und eluieren Sie gebundene ICAM-1 mit einem 50 mM Glycin Puffer, pH-Wert 3,0. Sofort neutralisieren der eluierten ICAM-1-Proteins mit einem 2 M Tris-Puffer, pH 8.0.</li>
		<li>Dialyse eluierten Material gegen PBS, pH 8.0 und eine Spalte mit Ni-NTA Agarose dialysierten Material hinzufügen. Eluieren Sie lösliche ICAM-1 mit 200 mM Imidazol, pH 8.0. Dialyse eluierten Material gegen eine PBS-Puffer, pH 8.0.</li>
		<li>Beschriften Sie die gereinigten ICAM-1 mit Cy5 NHS Ester nach Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Das beste Finale Farbstoff-Protein-Verhältnis ist 1:1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fab erzeugen Fragmente aus einem Anti-CD107a-Antikörper durch Papain Verdauung und reinigen die Fab Fragmente durch Ionenaustausch-Chromatographie wie zuvor beschrieben3. Bezeichnung die Fab mit Alexa Fluor 568 NHS Ester nach Anweisungen des Herstellers Fragmente.</li>
</ol>3. Zustandekommen des Glas-gestützte Planar Lipid Bilayer
<ol><li>Bereiten Sie eine frische saure Piranha-Lösung durch das Mischen von 140 mL konzentrierte Schwefelsäure und 60 mL 30 % Wasserstoffperoxid. Waschen Sie die Glasdeckgläser für die Fluss-Folien durch Einweichen in die Säure Piranha-Lösung für 30 min. halten das Glas Deckglas mit Polypropylen Scissor-Art Zange. Achtung: Piranha Lösung ist ein extrem starkes Oxidationsmittel. Denken Sie daran, Sicherheitsbrille oder Schutzbrille oder einen Integralhelm Schild zusammen mit dicken Gummihandschuhe jederzeit während der Behandlung der Lösung. Arbeiten Sie nur mit Piranha-Lösung unter einer Abzugshaube. Heizung, Transport oder schütteln es jederzeit während des Gebrauchs zu vermeiden, da sie explodieren kann. Sammeln Sie die Piranha-Abfälle in eine Glasflasche mit einem bleihaltigen Loch. Wenden Sie sich an die institutionellen Safety Committee über ordnungsgemäßen Abfallverwertung.</li>
	<li>
Spülen Sie die gewaschenen Deckgläsern 7 X mit Reinstwasser indem Sie diese nacheinander in Becher mit frischem Wasser zu übertragen. Stellen Sie den sauberen, trockenen Glases hinterlässt die nassen Deckgläsern beiseite zu lassen, das restliche Wasser abperlen.
	<ol>
<li>Alternativ verwenden Sie eine PIPETTENSPITZE an eine Vakuumpumpe angeschlossen, um entfernen Sie vorsichtig die restlichen Wassertropfen von den Deckgläsern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie in der sterilen Haube Verdünnungen von verschiedenen Lipiden, die Liposomen-Mischung zur Herstellung von Bilayer zu produzieren. Zunächst verbinden Sie 37 µL DOPC Liposomen und 3 µL Biotinyl-Cap-PE Liposome. Zweitens: Mischen Sie 14 µL DOPC Liposomen und 15 µL von Hunde-NTA Liposomen. Drittens: Fügen Sie 1 µL des ersten Mix 29 µL des zweiten Mix, die endgültige Liposomen-Mischung zu fabrizieren hinzu.</li>
	<li>
In der sterilen Haube richten Sie einen Arbeitsbereich mit trockenen Deckgläsern in der Nähe. Aliquoten 2 µL der endgültigen Liposomen-Mischung (siehe Punkt 3.3) genau in der Mitte eines Kanals selbstklebende Folie. Richten Sie sofort und sehr präzise eine saubere und trockene Deckglas mit der Folie aus und senken Sie das Deckglas auf der Klebeseite der Folie vorsichtig ab.
	<ol>
<li>Wenn mehr als eine Folie vorbereiten, arbeiten Sie auf einer Folie zu einem Zeitpunkt, da die Liposomen-Mischung schnell verdunstet. Umdrehen Sie die Folie und verwenden Sie den äußeren Ring des Polypropylen Scissor-Art Zange, um üben Sie sanften Druck auf den peripheren Kontakt das Deckglas mit der Folie, um sicherzustellen, dass der Schlupf der Folie verhindert Leckage fest zugeordnet ist. Hinweis: Drücken Sie nicht gegen die Kanäle der Folie zu vermeiden, brechen oder reißen das Deckglas.</li>
		<li>Drehen Sie die Folie wieder und markieren Sie die Position der gebildeten Bilayer, die aussieht wie ein Tropfen zwischen dem Deckglas und der Kanal-Folie durch Zeichnung 4 Punkte mit einem wasserfesten Filzstift um die Bilayer auf die äußere Folie Seite des Querschnitts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bezeichnen Sie vor der ersten Injektion einer Flüssigkeit in den Kanal ein Port des Kanals als der Anschluss und die andere als die Ausgangsöffnung, und pflegen Sie diese Bezeichnung in das Experiment.</li>
	<li>Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, stecken Sie das Ende der pipettieren Spitze direkt in den Anschluss des Kanals. Füllen Sie langsam die Kanäle der Folie mit 50 µL Warm (mindestens Raumtemperatur) testpuffer (siehe Schritt 1.5 für die Puffer-Zusammensetzung).</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,5 M Nickel(II)-oxid-chlorid-Lösung. Tauen Sie eine 2 mL-aliquoten Kasein-Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min auf und ergänzen Sie es mit einem Nickel-chlorid-Lösung auf eine Endkonzentration von 200 µM.</li>
	<li>Waschen Sie die Bilayer durch Injektion von zunächst 100 µL der Kasein-Lösung in den Anschluss des Kanals und dann sofort entfernen 100 µL aus der Ausfahrt Hafen auf der Folie durch pipettieren. Blockieren der Bilayer mit der gleichen Lösung durch Injektion von 100 µL der Kasein-Lösung in den Anschluss jedes Kanals und Inkubation der Folie für 45 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Tauen Sie Aliquote Cy5-ICAM-1-HSI6 und Streptavidin Proteine. Kombinieren Sie die Proteine in testpuffer auf die letztendliche Konzentration von 2 µg/mL. Zentrifugieren Sie die Lösung für 30 min bei 20.000 x g und 4 ° C, Aggregate zu entfernen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Rest der blockierenden Lösung aus die Ausgangsöffnung des Dia-Kanals durch pipettieren. 100 µL der Lösung mit ICAM-1 und Streptavidin in den Eintrag Port zu injizieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Folie für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie überschüssiges Öl von der Proteinlösung aus der Ausgangsöffnung. Waschen Sie die Bilayer 2 X durch Injektion von zunächst 100 µL für den Assay-Puffer in den Anschluss des Kanals und dann sofort entfernen 100 µL aus der Ausgangsöffnung.</li>
	<li>Verdünnen Sie einen Alexa-Fluor-488-gekennzeichnete Anti-CD3-Antikörper mit der Assay-Puffer, eine Endkonzentration von 2 µg/mL. 100 µL der Antikörper-Lösung in den Eintrag Port der Folie zu injizieren und 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie überschüssiges Öl von der Proteinlösung aus der Ausgangsöffnung. Waschen Sie die Bilayer 2 X mit 100 µL testpuffer wie in Schritt 3.11.</li>
</ol>4. Bildgebung der T Zellen Interaktion mit planaren Bilayer
<ol><li>
Heizen Sie die Bühne und das Ziel einer konfokalen oder vollständige interne Reflexion Fluoreszenzmikroskop (TIRF vor), bis die Temperatur bei 37 ° c equilibriert ist Richten Sie die Folie mit der Bilayer(s) auf der beheizten Bühne. Verschieben Sie die Phase an einer geeigneten Stelle nach der Tinte Marken und konzentrieren Sie sich auf die Bilayer Fluoreszenz Cy gekennzeichnet ICAM-1 Moleküle beschäftigt.
	<ol>
<li>Verwenden Sie eine 61 X Objektiv für das konfokale Mikroskop oder ein 100 X Objektiv für TIRF-Mikroskop, mit entsprechenden Filtereinstellungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Für Granulat release Bildgebung durch TIRF-Mikroskopie, fügen Sie Alexa-Fluor-568-markierten Anti-CD107a Antikörper Fab-Fragmente, die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 4 µg/mL vor der Injektion der Zellen in der Anschlüsse.
	<ol>
<li>Aufschwemmen der vorbereiteten CD4+ T Zellen isoliert von LN oder PB oder Schnur Blut und 50 µL Zellsuspension in den Anschluss des Dia-Kanals mit dem Bilayer injizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie die gewünschte Anzahl der Felder und Aufnahmen der einzelnen Felder 1 x alle 2 min für 30 min nach der Injektion.</li>
	<li>Hellfeld, reflektierte Licht und fluoreszierende Kanäle (Alexa 488 und Cy5) des konfokalen Mikroskops zu erwerben, die Bilder zu nutzen. Verwenden Sie TIRF Modus für Alexa-Fluor-488 und Alexa-Fluor-568 Fluoreszenz und Weitfeld Cy5 Fluoreszenz sowie Hellfeld Bildgebung am TIRF Mikroskop.</li>
</ol>(5) Bildanalyse
<ol><li>Die erworbenen Bilder mittels geeigneter Software zu analysieren. Zellmorphologie im übertragenen Lichtbilder und ausschließen geclustert und sichtbar beschädigt oder Apoptotic Zellen aus der Analyse zu beobachten. Gehören Sie in die Analyse nur jene Zellen, die mit der Bilayer Oberfläche (d.h. Zellen ansammeln Alexa-Fluor-488 Fluoreszenz (Anti-CD3-Antikörper) an der Schnittstelle) produktiv zusammenzuarbeiten.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Größe des Bereichs Zelle Adhäsion bei 20 min nach der Einleitung der Zelle-Bilayer Interaktion. Hinweis: Die Adhäsion Gegend ist der dunkle Bereich an der Zelle-Bilayer-Schnittstelle auf der interferenzbilder Reflexion Mikroskopie (IRM) entwickelt.</li>
	<li>Jede Ansammlung von Cy5-ICAM-1 Fluoreszenz und eine Formation von der Ring-Kreuzung durch getrennte Cy-ICAM-1 Moleküle an der Zelle-Bilayer Schnittstelle zu beobachten. Wenn kumulierte ICAM-1 Moleküle eine Adhäsion Ring Kreuzung auf mindestens zwei aufeinander folgende Bilder gebildet, als Zellen entwickeln eine periphere supramolekularen aktivierende Cluster (pSMAC)12festlegen Sie solcher Zellen.</li>
	<li>Bewerten Sie das Granulat-Release durch Messung der Alexa-Fluor-568 Fluoreszenzintensität an der T-Zell-Bilayer-Schnittstelle über die Hintergrundfluoreszenz außerhalb der Kontaktfläche in unmittelbarer Nähe der Zelle. Festlegen Sie Zellen mit einem Verhältnis von Alexa-Fluor-568 Signal-Hintergrund von mindestens 1,3 als degranulating Zellen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die neuartige Technik, die hier beschriebenen nutzt ähnliche Reagenzien erforderlich, um planare Bilayer in den herkömmlichen Flow Zelle5 bauen und kann erfolgreich eingesetzt werden, um die Darstellung der primären menschlichen T-Zell-Bilayer Schnittstellen3,4 durchführen ,15. Die Technik bietet eine deutliche Reduzierung der fluoreszierende Moleküle Nutzung und erfordert 10 – 20 x weniger T-Zellen im Vergleich zu einem Fluss Zelle System5, erstellen die Möglichkeit zur primären menschlichen T-Zellen aus Blut und anderen Geweben zu analysieren.
Die Anzahl der in dieser Studie verwendeten injizierten Zellen konnten wir etwa 50 Zellen pro imaging-Bereich mit einem 60 X Ziel Bild. Eine größere Konzentration führte zu Zelle Aggregation, Verringerung der Zahl der Zellen für die Analyse. Wir könnten weiter reduzieren der Anzahl der injizierten Zellen 10-50 X, aber die untere Grenze der Anzahl von Zellen hängt von Zelle Heterogenität, auf die Anzahl der bildgebenden Felder und über die experimentelle Gesamtplanung. Einige Forscher haben früher Bilayer eingebaut in eine offene Kammer mit einem Glasboden, die eine ähnliche Anzahl von Zellen für die Analyse16erforderlich. Allerdings ermöglicht das geschlossene System, die hier beschrieben wird, mit einer Kanalhöhe von 0,1 - 0,4 mm, für schnelle Zelle Sedimentation, Zellhaftung und Analyse der T-Zell-Antwort ohne das Risiko von flüssigen Verdampfung zu synchronisieren. Das klebrige Folie System ermöglicht die Bildung von bis zu drei Bilayer pro Kanal. So könnte die gleiche Zelle Probe für die Analyse der Zelle Verhalten auf unterschiedlichen Bilayer mit eine andere Zusammensetzung der stimulierende, Haftung und costimulatory Moleküle verwendet werden.
Bei der Montage der klebrige Folien und Deckgläsern für eine erfolgreiche Bilayer Bildung sollten einige Vorkehrungen getroffen werden. Insbesondere die Deckgläsern sollte vollständig trocken sein, wie auch eine kleine Menge Flüssigkeit auf die Glasoberfläche kann dazu führen, Leckage während der Bilayer Waschverfahren. Wichtig ist, gilt es, sogar die angehängte Deckglas an den Rändern des Kontakts mit dem äußeren Ring der Polypropylen Scissor-Art Zange um Leckagen zu vermeiden (wie in Schritt 3.4.1 beschrieben). Es ist auch wichtig, zu vermeiden, Blasenbildung in der Anschlüsse der Kanäle. Wenn alle Bläschen einen Channel zu betreten, sind sie fast unmöglich zu entfernen und die Bilayer im Kanal zu ruinieren. Ebenso ist es wichtig, zu vermeiden, schnellen pipettieren, da der turbulenten Strömung der Flüssigkeit kann Luftblasen in den Kanal einführen und der Bilayer Schäden.
Eine Freigabe der Zytolyse Granulat wird durch das Auftreten von CD107a an der T-Zell-Bilayer Schnittstelle erkannt. Fab Regionen von Anti-CD107a Alexa-Fluor-568-markierten Antikörpern werden CD8 T-Zellen vor der Verladung auf das Bilayer hinzugefügt. TIRF-Mikroskopie nutzt eine evaneszenten Welle zur Beleuchtung der Gegend etwa 100 nm über die Bilayer des Volumens als vergänglich Volumen, so dass um die vertikale Auflösung der Bildgebung zu erhöhen. Beschriftete Antikörper Fab, die sehr schnell in dem evaneszenten Volumen bei 37 ° C diffus, erzeugen keine nachweisbaren Fluoreszenzsignal. Während die Membranfusion von spezialisierten Lysosomen mit lytischen Moleküle mit der Zellmembran CD107a Membranprotein erscheint auf der T Kontaktfläche Zellen an unterschiedlichen Standorten. Die Fabs bekommen damals an das CD107s-Protein gebunden. Angeschlossen an das CD107a-Protein, bilden fluoreszierend-markierten Fab(s) unbeweglich Cluster, die eine helle Fluoreszenz nachweisbar durch TIRF-Mikroskopie, bezeichnend für T-Zelle Degranulation generieren.

Wissenschaftlicher Erkenntnisse über die strukturellen Merkmale des T-Zell-immun-Synapsen und ihre Verknüpfung, die funktionelle Aktivität der T-Zellen erzeugt worden ist, in erster Linie aus der Studie von Zelllinien und Klone von PB abgeleitet. Inwieweit diese Ergebnisse beziehen sich auf primäre T-Zellen entnommen Blut oder lymphatischen Gewebe bleibt unklar, wie die synaptischen Schnittstellen von T-Zellen, die ihren Wohnsitz in den lymphatischen und anderen Geweben bisher nicht analysiert wurden. Wichtig ist, neue Daten deuten darauf hin, dass Gewebe-Resident und lymphatischen Organ abgeleitet T-Zellen möglicherweise erhebliche Unterschiede in ihren Phänotyp und funktionelle Aktivität im Vergleich zu denen in PB6,7. Dies hat die Notwendigkeit, besser zu verstehen, die Funktionen der T-Zell-synaptischen Schnittstelle in primären menschlichen T-Zellen weiter verfestigt.
Zu diesem Zweck entwickelten wir eine neuartige Mini-Ansatzes Ausnutzung Lipid Bilayer eingebaut Multichannel-Fluss Folien ermöglichen die Darstellung der T-Zelle/Bilayer Schnittstellen mit weniger als 105 primäre T-Zellen aus menschlichen PB und LN isoliert ausführen Diese neuartige Technik ermöglicht die Studie die biophysikalischen Eigenschaften des primären menschlichen T-Zellen synaptischen Schnittstellen um besser zu modellieren und in Vivo Zell-Zell-Interaktionen zu verstehen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD4 T cell isolation kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 T cells Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOGS NTA</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790528C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl Cap PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870273C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Octapharma USA</td>
			<td>NDC 68982-643-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips for sticky-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioptech FCS2 Chamber</td>
			<td>Bioptech</td>
			<td>060319-2-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-0037-81</td>
			<td>OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- CD28 antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX14664</td>
			<td>9.3 clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEO4-NHS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Cy5 NHS Ester</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>PA15101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V412020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>37409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free Drosophial media Insect-XPRESS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-730Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma YN1/1.7.4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1878</td>
			<td>The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9142</td>
			<td>Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex tangential flow concentrator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77601-60 7592-40</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Lab Tangential Flow Systems</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>FS002K10 OS010T12 FS005K10</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>131384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human antibody against CD107a</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td>555798</td>
			<td>Clone H4A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ansell Natural Blue Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-014-539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6320-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>ProZyme</td>
			<td>SA10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Premier Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the synaptic interface of primary human t cells from peripheral blood and lymphoid tissue

Das gegenwärtige Verständnis der Dynamik und strukturellen Merkmale der T-Zellen synaptischen Schnittstellen wurde weitgehend bestimmt durch den Einsatz von Glas-gestützte planar Bilayer und in-Vitro-abgeleiteten T-Zell-Klone oder Linien1,2 ,3,4. Wie diese Erkenntnisse für die primären menschlichen T-Zellen aus Blut isoliert oder lymphatischen gelten Gewebe ist nicht bekannt, teilweise erhebliche Schwierigkeiten, eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Analyse5. Hier begegnen wir dies durch die Entwicklung einer Technik, die Nutzung von Folien, Multichannel-Fluss um planare Lipid Bilayer mit Aktivierung und Adhäsion Moleküle bauen. Die geringe Höhe der Fluss Folien fördert schnelle Zelle Sedimentation, um Zelle: Bilayer Anlage, wodurch Forscher studieren die Dynamik der synaptischen Schnittstelle Bildung und die Kinetik der Granulat-Version synchronisieren. Wir wenden diesen Ansatz zur Analyse der synaptischen Schnittstelle von so wenig wie 104 bis 105 primäre kryokonservierten T-Zellen isoliert von Lymphknoten (LN) und peripherem Blut (PB). Die Ergebnisse zeigen, dass die neuartige planar Lipid Bilayer Technik die Studie die biophysikalischen Eigenschaften des primären menschlichen T-Zellen aus Blut und Gewebe im Zusammenhang mit Gesundheit und Krankheit abgeleitet ermöglicht.

Zunächst verglichen wir die Struktur der synaptischen Schnittstelle gebildet von aktivierten CD8 Schnur Blut abgeleitet+ T Zellen, Lipid Bilayer entweder in traditionellen großen Fluss gebaut Zellsysteme (siehe die Tabelle der Materialien für Details)1 ,2,3,4 oder im Multi-Channel-Flow-Folien. Die Bilayer enthalten Leuchtstoff-markierten Anti-CD3 und ICAM-1 bei 50 Moleküle/µm2 und 300 Moleküle/µm2. CD8+ T Zellen aus menschlichen Nabelschnurblut wurden durch eine Stimulation mit Platte gebundene Anti-CD3 und Anti-CD28 Antikörper13,14aktiviert. Es gab keinen Unterschied zwischen CD8+ T-Zellen, dass gebildete klassische immunologische Synapsen auf die Lipid-Bilayer gebaut in der Messzelle oder der Multi-Channel-Flow-Folie (Abbildung 1). Alle anderen Experimente wurden durchgeführt mit Lipid Bilayer in den Multi-Channel-Flow-Folien hergestellt.
Als nächstes haben wir untersucht die Fähigkeit der menschlichen CD4 PB und LN abgeleitet+ T-Zellen zu bilden synaptische Schnittstellen mit planaren Lipid Bilayer und Granulat. Wir ausgenutzt TIRF-Mikroskopie zur Maximierung der der vertikalen Auflösung an der T-Zell-Bilayer Schnittstelle visualisiert degranulating Zellen und die Kinetik der Granulat-Freisetzung zu bewerten. Wir 4 Gruppen von Zellen für beide der LN und PBMC abgeleitet CD4 beobachtet+ T Zellen: einige T-Zellen hergestellt Reife immun Synapsen, aber entweder haben oder nicht frei Granulat, andere T-Zellen veröffentlicht das Granulat ohne eine Bildung von Reifen Synapsen und noch andere T-Zellen gebildet Synapsen weder veröffentlicht das Granulat (Abbildung 2)7. Der Unterschied zwischen LN und PBMC abgeleitet CD4+ T Zellen wurde offensichtlich, wenn die Kinetik der Modul-Version ausgewertet wurde. PBMC abgeleitet CD4+ T Zellen konnten Freigabe Granulat fast doppelt so schnell wie LN abgeleitet CD4+ Zellen (Abbildung 3)7. Alles in allem, die Daten zeigen, dass trotz einer Heterogenität von LN und PBMC abgeleitet CD4+ T-Zellen, letztere enthalten ein Bruchteil der T-Zellen in der Lage, rasche Degranulation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig1.jpg"> Abbildung 1: Vergleich der Flow-Dia-System und konventionellen Strömungsraum. (A) dieses Panel zeigt der Mehrkanal-Fluss schieben erlaubt eine Montage von 6 Glas unterstützt planar Lipid Bilayer. Jede Bilayer ist mit der Lieferung und die Ausfahrt Ports verbunden. Weniger als 1 x 105 Zellen sind ausreichend für die Analyse. (B) dieses Panel zeigt die konventionellen Strom-Kammer-System ermöglicht eine Montage von 1 Glas unterstützt planar Lipid Bilayer. 2 x 106 Zellen sind für die Analyse erforderlich. Die anderen Platten zeigen (C und D) repräsentative TIRF-Mikroskopie (E und F) konfokale mit Einmischung Reflexion Mikroskopie (IRM) Bilder der von entwickelte Schnittstelle aktiviert Schnur-Blut-derived CD8 T-Zellen. Die Zellen wurden in einer konventionellen ausgesetzt ein Lipid Bilayer mit ICAM-1 (300 Moleküle/µm2) und Anti-CD3-Antikörper (50 Moleküle/µm2) erworben (C und E) im Fluss Folien oder (D und F) Flow-System unter ähnlichen Bedingungen. Die TIRF-Mikroskopie und konfokale mit IRM Aufnahmen mit 100 X 60 X Vergrößerung Ziele, beziehungsweise. Der Anteil der T-Zellen, die ausgereifte Form auf die Bilayer Synapsen erbaute entweder Fluss-Folie oder konventionelle Strömungsraum war sehr ähnlich aber variiert zwischen Experimente von 75 % bis 90 %. In allen Bildern werden Cy-5-gekennzeichnete ICAM-1 Moleküle blau dargestellt; Alexa-Fluor-488-markierten Anti-CD3-Antikörper sind in grün dargestellt; Alexa-Fluor-568-markierten Anti-CD107a Antikörper an CD107a gebunden werden in rot angezeigt; IRM-Bilder werden in Cyan angezeigt; und die Maßstabsleisten sind 10 µm in der Länge. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig2.jpg"> Abbildung 2: Struktur eines T-Zell-Bilayer-Interface und das Muster der Degranulation von Lymphknoten und peripheren Blut mononukleären CD4+ T Zellen. LNMC oder PBMC gewonnenen Zellen wurden sortiert, um CD4 zu trennen+ T-Zellen, die die Bilayer mit 50 Moleküle/µm2 Anti-CD3-Antikörper und 300 Moleküle/µm2 ICAM-1-Proteins ausgesetzt waren. Die Schnittstelle zwischen den Zellen und der Bilayer war TIRF-Mikroskopie abgebildet. Der Maßstabsbalken sind 5 µm. (A) diese repräsentative Bilder einer T-Zelle - Bilayer Schnittstelle zeigen die Struktur des T-Zell-Bilayer Schnittstellen und Degranulation Muster. (B) diese Diagramme zeigen eine Darstellung der LNMC und PBMC abgeleitet CD4+ T-Zellen mit eine andere Struktur der synaptischen Schnittstellen und Muster der Modul-Version. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig3.jpg"> Abbildung 3: Dynamische Änderungen der Struktur einer T-Zell-Bilayer-Schnittstelle und die Kinetik der Degranulation der Lymphknoten und peripheren Blut mononukleären CD4+ T Zellen. (A) dieses Panel zeigt zeitabhängige Änderungen eine T-Zell-Bilayer-Schnittstelle und das Aussehen der veröffentlichten Granulat. Der Maßstabsbalken sind 5 µm. (B) dieses Panel zeigt eine Quantifizierung der Kinetik einer Granulat-Version von LN-abgeleitete CD4+ T Zellen (geschlossene Kreise) und CD4 PBMC abgeleitet+ T Zellen (offene Kreise). Jeden einzelnen Kreis zeigt die Zeit des ersten Auftretens eines nachweisbaren Granulat-Release von einzelnen Zellen. Der Median und IQR (interquartilbereich) sind für alle Streudiagrammen gezeigt. Mann-Whitney-Tests wurden durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den genannten Gruppen von T-Zellen zu vergleichen. P < 0,05, ** P < 0,01. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

Das Protokoll beschreibt eine Technik, um die Fähigkeit der primären polyklonale menschlichen T-Zellen synaptische Schnittstellen mit planaren Lipid Bilayer bilden zu studieren. Wir verwenden diese Technik, um die differenzielle Synapse Bildung Fähigkeit der menschlichen primäre T Zellen aus Lymphknoten und peripheren Blut zu zeigen.

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

assessment-synaptic-interface-primary-human-t-cells-from-peripheral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.4K Aufrufe.  Thomas Jefferson University. Das Protokoll beschreibt eine Technik, um die Fähigkeit der primären polyklonale menschlichen T-Zellen synaptische Schnittstellen mit planaren Lipid Bilayer bilden zu studieren. Wir verwenden diese Technik, um die differenzielle Synapse Bildung Fähigkeit der menschlichen primäre T Zellen aus Lymphknoten und peripheren Blut zu zeigen.

Serie: Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...