עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01AI118694 NIH מייקל ר'. בטס, כולל פרס תת 566950 יורי Sykulev. אנו מודים סידני קימל סרטן מרכז Bioimaging משותפים המשאב עבור תמיכה מצוינת שלהם.

מחקר זה נערך בהתאם הצהרת הלסינקי. ממנו כל המשתתפים הושג בכתב הסכמה מדעת, דגימות דם, לימפה נרכשו עם האישור של ועדת הבדיקה מוסדיים ב אוניברסיטת פנסילבניה (IRB #809316, IRB # 815056). כל הנבדקים האדם היו מבוגרים. דגימות דם טבורי נמסרו באדיבות על ידי העבודה ואספקה במחלקת יולדות & גינקולוגיה באוניברסיטת תומאס ג'פרסון. כל הדגימות היו de-מזוהה.
1. בידוד של CD4+ T תאים עבור ניתוח תמונה
<ol><li>
להפשיר aliquot 1 מ"ל המכילה 107 קפוא היקפיים תאי תאי דם (PBMCs) או תאים תאי לימפה (LNMCs) מן הדוגמאות שנאספו. בשכונה סטרילי, להוסיף את התאים המופשרים 9 מ של RPMI בתוספת פניצילין/סטרפטומיצין, גלוטמין.
	<ol>
<li>Centrifugate התאים 10 דקות ב x 300 גרם ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים ב 5 מ של RPMI שהושלם המכיל 10% FBS (בינוני מלא). דגירה בין לילה בתאים חממה2 CO ב 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחרת, לטהר CD4+ T תאים על-ידי immunomagnetic שלילי מיון באמצעות ערכת זמינים מסחרית על פי הוראות היצרן.</li>
	<li>כדי למדוד את מספר CD4 טרי מטוהרים+ T תאים, לערבב µL 5 של התליה תא עם אמצעי אחסון שווה של פתרון trypan blue. לטעון hemocytometer עם תא-trypan כחול תערובת ולספור את התאים הפועלים בתוך הסעיפים 5 של hemocytometer.</li>
	<li>לקחת את הממוצע של מספר תאים וקבע את מספר התאים ההשעיה תא המקורית: מספר תאים/1 מ"ל = הרוזן ממוצע x 2 x 104. אם המספר הכולל של תאים בודדים הוא קטן מדי, השתמש התאים כמו מבלי לספור.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 10 דקות, resuspend אותם בתוך מאגר assay (20 מ מ HEPES, pH 7.4, 137 מ מ NaCl, 2 מ מ נה2HPO4, 5 מ מ D-גלוקוז, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2, 2 מ מ CaCl2ו- 1% אנושי אלבומין) ב-105 < /c13 > תאים/50 µL או פחות לשמור את התאים 4 ° C (עבור 1 – 2 h) עד מוכן להשתמש בניסויים.</li>
	<li>השלך כל פסולת ביולוגית על פי הנחיות מוסדיים הרלוונטיים.</li>
	<li>במידת הצורך כאוכלוסייה תא בקרה, להכין הופעל CD8 T תאים מדם טבורי PBMC, במקום 107 תאים ב 5 מ של בינוני מלא בבקבוקון תרבות T25 מכוסה בתערובת של נוגדנים אנטי CD3 ו- anti-CD28 µg/מ"ל, 1 µg/mL , בהתאמה.</li>
	<li>למחרת, להסיר תאים דם טבורי מופעל הבקבוק, ותוא וקינ 1 x טריים להשלים בינוני ולהרחיב את התאים בנוכחות il-2 רקומביננטי (100 U/mL) למשך שבועיים.</li>
	<li>לטהר את הדם הטבורי CD8+ T תאים על-ידי immunomagnetic שלילי מיון באמצעות ערכת זמינים מסחרית על פי הוראות היצרן. לספור את התאים ולהחליף את המדיה אל המאגר assay כמתואר בצעדים 1.3-1.6 LN ו PB CD8+ T תאים.</li>
</ol>2. מרכיבי הכנת השומנים מישורי Bilayers
<ol><li>להכין 3 מין ליפוזומים כמתואר5: (א) 0.4 מ מ DOPC (1, 2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine) ליפוזומים, ליפוזומים DOPC (ב) 0.4 מ מ המכיל mol 33% כלבים-נ (1, 2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- אמינו-1-carboxypentyl) חומצה iminodiacetic) succinyl] (אמוניום מלח)) שומנים, ליפוזומים (ג) 0.4 מ"מ DOPC המכיל mol 4% Biotinyl-קאפ-PE (1, 2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(cap biotinyl) (נתרן מלח)).</li>
	<li>
להכין 5% קזאין הפתרון כפי שתואר לעיל5.
	<ol>
<li>להמיס 5 גר' קזאין אבקה ב- 100 מ של מים הנדסה גנטית, להוסיף 350 µL של 10 מ' נתרן הידרוקסידי. מערבבים הכל על פגים קבוע במהירות איטית לקנה זמין, בטמפרטורת החדר במשך שעתיים, ואני אז לילה ב 4 º C. להתאים את ה-pH 7.3, ultracentrifuge הפתרון עבור 2 h ב g x 100,000 ב 4 º C. לסנן את תגובת שיקוע עם מסנן סטרילי מיקרומטר 0.22 ואחסן את הפתרון aliquots ב-80 מעלות צלזיוס. התראה: נתרן הידרוקסידי פתרון יכול לגרום כוויות כימיות, עשוי לגרום עיוורון תמידי על מגע עם העיניים. השתמש בכפפות גומי, ביגוד בטיחות והגנה העין בעת הטיפול הכימי או פתרונות שלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
נוגדן אנטי-CD3 תווית עם ביוטין לייצר מולקולות הנוגדן מונו-bionylated עם גישה שתואר לעיל8.
	<ol>
<li>להכין פתרון של ביוטין-PEO4-NHS ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-0.1 מ"ג/מ"ל. להוסיף µL 3.7 של הפתרון ביוטין-PEO4-NHS 1 מ ג של נוגדנים ב- 0.5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) המכיל 100 מ מ סודיום ביקרבונט.</li>
		<li>דגירה התערובת כבר שעתיים בטמפרטורת החדר. להכין פתרון של אסתר אלקסה עבור חיל הים 488 NHS-10 מ"ג/מ"ל ב דימתיל סולפוקסיד. להוסיף את הפתרון אסתר אלקסה עבור חיל הים 488 NHS הנוגדן המתויגים באמצעות ביוטין-PEO4-NHS-עודף שן טוחנת 10-fold.</li>
		<li>דגירה התערובת לשעה בטמפרטורת החדר עם ערבוב איטי על פגים רגיל. הפרד את הצבע לא מאוגד באמצעות כרומטוגרפיה גודל-הדרה.</li>
		<li>לקבוע ריכוז נוגדן על ידי מדידת צפיפות אופטית של הפתרון נוגדן-280 ננומטר (280). למדוד את הצפיפות האופטית של נוגדנים שכותרתו-577 nm (577).</li>
		<li>לקבוע את היחס לצבוע-כדי-נוגדן באמצעות המשוואה הבאה: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58143/58143eq1.jpg"> הערה: למצוא פרטים נוספים בהפרוטוקול של היצרן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבטאים חלבון רקומביננטי ICAM-1 מסיסים במערכת הביטוי דרוזופילה כפי שתואר לעיל3,4,9,10.
	<ol>
<li>שיבוט, עם cDNA קידוד, ectodomain של ICAM-1 לידי ביטוי דרוזופילה וקטור pMT/V5-שלו עם יזם inducible metallothionein לייצר חלבון רקומביננטי לשמות שלו6 תג בקצה C-מסוף.</li>
		<li>שיתוף transfect S2 תאים עם פלסמיד המכיל וכתוצאה מכך את ICAM-1 ווקטור ביטוי G418. בחר transfectants יציבה באמצעות מדיה דרוזופילה של שניידר בתוספת 10% עגל עוברית סרום (FCS) ו- 0.5 מ"ג/מ"ל של G418 למשך 3 שבועות. הרחב את התאים ללא סרום חרקים בינוני ' זירוז ביטוי חלבון עם 0.5 מ מ CuSO4 עבור בתלת-ממד.</li>
		<li>להתרכז תרבות x 10 supernatant, dialyze נגד PBS באמצעות רכז זרימה וצורניים כפי שתואר לעיל11.</li>
		<li>להחיל את התרבות מרוכז supernatant עמודה המכילה Sepharose עם נוגדן חד שבטי קיבוע covalently anti-ICAM-1, elute ICAM-1 מאוגד עם מאגר גליצין 50 מ מ, pH 3.0. מיד לנטרל את החלבון ICAM-1 eluted באמצעות בופר טריס 2 מ', pH 8.0.</li>
		<li>Dialyze את החומר eluted נגד PBS, pH 8.0 ולהוסיף את החומר dialyzed עמודה המכילה agarose Ni-נ. ת. Elute מסיס ICAM-1 עם 200 מ"מ imidazole, pH 8.0. Dialyze את החומר eluted נגד מאגר PBS, pH 8.0.</li>
		<li>תווית מטוהרים ICAM-1 עם אסתר Cy5 NHS לפי הוראות היצרן. הערה: היחס הטוב ביותר צבען-כדי-חלבון הסופי הוא 1:1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לייצר Fab שברים נוגדן anti-CD107a על ידי עיכול פפאין ולטהר את Fab קטעים על ידי יונים כרומטוגרפיה כפי שתואר לעיל3. תווית Fab קטעים עם אלקסה עבור חיל הים 568 NHS אסתר לפי הוראות היצרן.</li>
</ol>3. היווצרות ליפיד מישורי הנתמכות על-ידי זכוכית Bilayers
<ol><li>להכין פתרון פיראניה חומצי טריים על ידי ערבוב 140 מ של חומצה גופרתית מרוכזת ו- 60 מיליליטר 30% מימן על-חמצני. לשטוף את coverslips זכוכית דקה של השקופיות זרימה בהשריה בפתרון פיראניה חומצה במשך 30 דקות להחזיק את coverslip זכוכית עם מלקחיים מסוג מספריים פוליפרופילן. התראה: פתרון פיראניה הוא מחמצן חזק מאוד. זכור ללבוש בטיחות משקפיים או משקפי מגן עטיית יחד עם כפפות גומי עבה בכל עת בזמן טיפול הפתרון. עובד רק עם פתרון פיראניה ברדס fume. הימנע חימום, שינוע או לרעוד זה בכל עת במהלך השימוש, כמו זה עלול להתפוצץ. לאסוף את הפסולת פיראניה לתוך בקבוק זכוכית עם חור המכיל עופרת. צור קשר עם ועדת הבטיחות מוסדית על ומשבצת פסולת.</li>
	<li>
לשטוף את שטף coverslips 7 x עם הנדסה גנטית המים על ידי להעביר אותם ברצף בקבוקונים המכילים מים מתוקים. סט coverslips רטוב הצידה כדי לאפשר את המים הנותרים מתגלגלים הכוס נקי, כשמאחוריו הזכוכית יבש.
	<ol>
<li>לחלופין, השתמש טיפ פיפטה המצורפת משאבת ואקום בזהירות להסיר את טיפות המים שנותרו coverslips.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בשכונה סטרילי, ביצוע דילולים של ליפידים שונים כדי לייצר את התמהיל ליפוזום להכנת bilayers. ראשית, לשלב µL 37 של ליפוזומים DOPC 3 µL של Biotinyl-קאפ-PE ליפוזומים. שנית, לערבב µL 14 של ליפוזומים DOPC 15 µL של כלבים-נ ליפוזומים. שלישית, להוסיף 1 µL של המיקס הראשון µL 29 של המיקס השני כדי לפברק את התערובת ליפוזום הסופי.</li>
	<li>
בשכונה סטרילי, הגדרת סביבת עבודה עם coverslips יבשה בקרבת מקום. Aliquot 2 µL של תערובת ליפוזום הסופי (ראה שלב 3.3) בדיוק במרכז של ערוץ הכורך בשקופית. מיד ובדיוק מאוד ליישר coverslip נקי ויבש כאשר השקופית, והורד בעדינות את coverslip על הצד הדביק של השקופית.
	<ol>
<li>אם מכינים יותר משקופית אחת, לעבוד על שקופית אחת בכל פעם מאז התערובת ליפוזום מתאדה במהירות. . תהפוך את השקופית ולהשתמש הטבעת החיצונית של פוליפרופילן סוג מספריים מלקחיים להחלת לחץ עדין על המגע היקפיים של coverslip כאשר השקופית, מוודא כי תגית מחובר בחוזקה אל השקופית כדי למנוע דליפה. הערה: אין להקיש נגד הערוצים של השקופית כדי למנוע שבירת או פיצוח את coverslip.</li>
		<li>פנו את השקופית שוב ושוב ושוב, לסמן את המיקום של bilayer בנוי, שנראה כמו טיפה בין coverslip את השקופית בערוץ, באמצעות ציור 4 נקודות עם סמן קבוע סביב bilayer בצד השקופית חיצוני של ההרכבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לפני הזריקה הראשונה של נוזל לתוך התעלה, יציאה אחת של הערוץ תייעד את יציאת הפוסט ואת הצד השני כ היציאה ולשמור כייעוד לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>כדי למנוע יצירת בועות, הכנס הקצה של הקצה pipet ישירות לתוך יציאת הכניסה של הערוץ. לאט לאט למלא את הערוצים של השקופית עם 50 µL חמים (לפחות חדר טמפרטורה) מאגר assay (ראה שלב 1.5 עבור הרכב המאגר).</li>
	<li>להכין פתרון כלוריד nickel(II) 0.5 M. להפשיר את aliquot 2 מ"ל של קזאין פתרון באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, משלימים את זה עם פתרון כלוריד ניקל-ריכוז סופי של 200 מיקרומטר.</li>
	<li>לשטוף את bilayers על ידי הזרקת קודם µL 100 של הפתרון קזאין בנמל הכניסה של הערוץ ולאחר מכן להסיר מיד 100 µL מחוץ לנמל היציאה בשקופית על-ידי pipetting. לחסום את bilayers עם הפתרון אותו על ידי הזרקת µL 100 של הפתרון קזאין לתוך יציאת הכניסה של כל אחד מערוצי המקננת השקופית למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הפשרת aliquots של חלבונים6 ו- streptavidin Cy5-ICAM-1-שלו. לשלב את החלבונים במאגר assay בבית הריכוז הסופי של 2 µg/mL בכל. Centrifuge הפתרון למשך 30 דקות ב20, 000-g ו- 4 ° C להוציא אגרגטים כלשהו.</li>
	<li>להסיר את שארית הפתרון חסימת היציאה של הערוץ שקופית על-ידי pipetting. מזריקים µL 100 של התמיסה המכילה ICAM-1 ו- streptavidin ליציאת ה-ערך.</li>
	<li>דגירה השקופית למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. הסר כל עודף של הפתרון חלבון היציאה. לשטוף את bilayer 2 x על ידי הזרקת קודם µL 100 המאגר assay בנמל הכניסה של הערוץ ולאחר מכן להסיר מיד 100 µL מחוץ לנמל היציאה.</li>
	<li>לדלל נוגדן anti-CD3 אלקסה-עבור חיל הים-488-מתויג עם המאגר assay כדי ריכוז סופי של 2 µg/mL. מזריקים µL 100 של הפתרון נוגדן לתוך יציאת הפוסט של השקופית, דגירה זה למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. הסר כל עודף של הפתרון חלבון היציאה. לשטוף את bilayer 2 x עם 100 µL של המאגר assay כמו שלב 3.11.</li>
</ol>4. הדמיה של תאי T אינטראקציה עם Bilayer מישורי
<ol><li>
מחממים את הבמה ואת המטרה של מיקרוסקופ קונפוקלי או הכולל השתקפות פנימית קרינה פלואורסצנטית (TIRF) עד הטמפרטורה היא equilibrated ב 37 º C. להגדיר את השקופית הכוללת bilayer(s) על הבמה מחוממת. לעבור על הבמה עמדה ראויה על פי הסימנים דיו ולהתמקד bilayer העסקת זריחה של מולקולות מתויג Cy ICAM-1.
	<ol>
<li>השתמש מטרה X 61 עבור מיקרוסקופ קונפוקלי, או מטרה X 100 המיקרוסקופ TIRF, עם הגדרות הסינון המתאימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
עבור גרגר לשחרר הדמיה על ידי מיקרוסקופ TIRF, להוסיף אלקסה-עבור חיל הים-568-שכותרתו anti-CD107a נוגדנים חיובי קטעים על התליה תא-ריכוז סופי של 4 µg/mL לפני הזרקת התאים לתוך היציאות כניסה.
	<ol>
<li>Resuspend של CD4 מוכן+ T תאים מבודדים LN או חמאת בוטנים או כבל דם ולהזריק µL 50 של התליה תא ליציאת הכניסה של הערוץ השקופית המכילה את bilayer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבחור את המספרים הרצויים של שדות ותמונות הרשומה של כל שדה 1 x כל 2 דקות למשך 30 דקות לאחר ההזרקה.</li>
	<li>לנצל בהיר-שדה, משתקף האור, פלורסנט וערוצי (488 אלקסה ו- Cy5) של מיקרוסקופ קונפוקלי לרכוש את התמונות. השתמש במצב TIRF עבור קרינה פלואורסצנטית אלקסה-עבור חיל הים-488, אלקסה-עבור חיל הים-568 ו widefield Cy5 פלורסצנטיות, כמו גם הדמיה בהיר-שדה, על המיקרוסקופ TIRF.</li>
</ol>5. התמונה ניתוח
<ol><li>לנתח את התמונות הנרכש באמצעות תוכנה מתאימה. להתבונן תא מורפולוגיה תמונות אור המשודרת, תכלול מקובצים באשכולות ופגעו בעליל או מוות תאים מן הניתוח. לכלול הניתוח תאים המקיימים אינטראקציה באופן פרודוקטיבי עם פני השטח bilayer (כלומר, תאים צבירת פלורסצנטיות אלקסה-עבור חיל הים-488 (נוגדנים anti-CD3)-הממשק) בלבד.</li>
	<li>לקבוע את גודלו של אזור אדהזיה תא 20 דקות לאחר אתחול של התא-bilayer האינטראקציה. הערה: האזור אדהזיה הוא אזור כהה שפותחה הממשק תא-bilayer על הפרעה השתקפות תמונות מיקרוסקופ (IRM).</li>
	<li>להתבונן כל הצטברות של זריחה Cy5-ICAM-1 והיווצרות של צומת טבעת על ידי מולקולות הפרדה Cy-ICAM-1-הממשק תא-bilayer. אם נצבר ICAM-1 מולקולות נוצר של צומת טבעת אדהזיה לפחות שתי תמונות עוקבות, לייעד תאים כאלה כתאי פיתוח של הפריפריה סופרא מולקולרית הפעלת אשכול (pSMAC)12.</li>
	<li>להעריך את שחרור גרגר על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית אלקסה-עבור חיל הים-568-הממשק תא T-bilayer מעל זריחה רקע מחוץ לאזור קשר בסמיכות לתא. לייעד תאים עם יחס של אלקסה-עבור חיל הים-568 האות--לרקע לפחות 1.3 כתאים degranulating.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Somersalo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocytes+form+an+antigen-independent+ring+junction.">Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).</li><li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+theta+regulates+stability+of+the+peripheral+adhesion+ring+junction+and+contributes+to+the+sensitivity+of+target+cell+lysis+by+CTL.">Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL.</a> The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).</li><li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+early+T+cell+receptor+signaling+regulate+the+pathway+of+lytic+granule+delivery+to+the+secretory+domain.">Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain.</a> Immunity. 31, 632-642 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse.">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2007).</li><li>Reuter, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-Specific+CD8(+)+T+Cells+Exhibit+Reduced+and+Differentially+Regulated+Cytolytic+Activity+in+Lymphoid+Tissue.">HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue.</a> Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).</li><li>Buggert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+immune+surveillance+in+lymphoid+tissue+by+cytolytic+CD4++T+cells+during+health+and+HIV+disease.">Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease.</a> PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).</li><li>Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LFA-1/ICAM-1+interaction+lowers+the+threshold+of+B+cell+activation+by+facilitating+B+cell+adhesion+and+synapse+formation.">LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation.</a> Immunity. 20, 589-599 (2004).</li><li>Anikeeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+lymphocyte+function-associated+antigen-1+in+mediating+effective+cytolytic+activity+by+cytotoxic+T+lymphocytes.">Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).</li><li>Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Influence+the+Size+and+Dynamics+of+Signaling+Microclusters+in+a+Pyk2-dependent+Manner.">Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).</li><li>Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+HIV-specific+T-cell+receptor:+expression,+purification+and+analysis+of+the+specificity.">Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity.</a> Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).</li><li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Riddell, S. R., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+anti-CD3+and+anti-CD28+monoclonal+antibodies+to+clone+and+expand+human+antigen-specific+T+cells.">The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).</li><li>Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+interleukin-15+on+anti-CD3/anti-CD28+induced+apoptosis+of+umbilical+cord+blood+CD4++T+cells.">Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells.</a> European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).</li><li>Anikeeva, N., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+controlling+granule-mediated+cytolytic+activity+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes.</a> Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הטכניקה הרומן שמתואר כאן מנצל ריאגנטים דומה הנדרש כדי לבנות מישורי bilayers תא הזרימה קונבנציונלי5 , יכול להיות מיושם בהצלחה לביצוע ההדמיה של תא T אנושי ראשוני – bilayer ממשקים3,4 ,15. הטכניקה מציע ירידה משמעותית השימוש מולקולות פלורסנט ודורש 10 – 20 x פחות תאים T לעומת תזרים תא מערכת5, יצירת ההזדמנות לנתח העיקרי בתאי T אנושיים מן הדם ורקמות אחרות.
מספר התאים מוזרק השתמשו במחקר זה אפשר לנו תמונה כ-50 תאי הדמיה שדה עם מטרה X 60. ריכוז גדול הביאה מצבור תא, צמצום מספר תאים מתאימים לניתוח. אנחנו יכולים לצמצם עוד יותר את מספר התאים מוזרק x 10 – 50, אך הגבול התחתון של המספר הנייד תלוי תא הטרוגניות, על מספר שדות הדמיה, הנבחנים. כמה חוקרים בעבר השתמשו bilayers נבנה חדר פתוח עם חלק תחתון זכוכית נדרש מספר דומה של תאים עבור ניתוח16. עם זאת, מערכת סגורה המתוארת כאן, עם ערוץ לגובה של 0.1 - 0.4 מ מ, מאפשר משקעי סחף תאים מהירה לסנכרן את הקובץ המצורף תא וניתוח של התגובה T-cell ללא הסיכון של אידוי נוזלים. מערכת דביק שקופית נוספת מאפשרת היווצרות של bilayers עד שלושה לכל ערוץ. לפיכך, תא באותה דגימת זרע יכול לשמש עבור ניתוח בהתנהגות התא על bilayers נפרדות עם הרכב שונה של מופחתים, הדבקות, מולקולות costimulatory.
כמה אמצעי זהירות יש לנקוט במהלך ההרכבה של שקופיות דביק, coverslips עבור צורה bilayer מוצלחת. במיוחד, coverslips צריך להיות יבש לחלוטין, אפילו כמות קטנה של נוזל עזב על משטח זכוכית עלולה לגרום לדליפת במהלך bilayer שוטף. בהליך. חשוב, הכרחי אפילו את coverslip מצורף בקצוות של איש הקשר עם הטבעת החיצונית של פוליפרופילן סוג מספריים מלקחיים כדי למנוע דליפה (כפי שמתואר בשלב 3.4.1). חשוב גם להימנע מכל מבעבעים בנמלי הכניסה הערוצים. אם כל הבועות הזן ערוץ, הם כמעט בלתי אפשרי להסיר ולהרוס את bilayer בערוץ. בדומה לכך, חשוב להימנע מכל מהיר pipetting, כיוון הזרימה מערבולות של נוזל עלול להציג בועות לתוך הערוץ ונזק bilayer.
פרסום של גרגרי cytolytic מזוהה על ידי הופעתו של CD107a-הממשק תא T-bilayer. מחוזות נוגדנים anti-CD107a אלקסה-עבור חיל הים-568-הנקרא fab יתווספו בתאי CD8 T לפני ההעמסה על bilayers. מיקרוסקופ TIRF מנצלת גל evanescent כדי להאיר את האזור כ-100 nm מעל bilayer באמצעי האחסון המוגדר evanescent אחסון, המאפשר להגדיל את הרזולוציה אנכי של ההדמיה. נוגדן שכותרתו פאבס, אשר מפוזר מאוד במהירות בתוך האחסון evanescent ב 37 מעלות צלזיוס, אינם מפיקים אות ניאון לזיהוי. במהלך הפיוז'ן הממברנה של lysosomes מיוחדות המכילה מולקולות lytic עם קרום התא, חלבון ממברנלי CD107a מופיע על ה-T תאים לפנות משטח במיקומים נפרדים. פאבס לקבל מאוגדים החלבון CD107s באותו הזמן. מצורף החלבון CD107a, Fab(s) התווית על-ידי פלורסנט בצורת אשכולות משותק ליצור פלורסצנטיות בהיר לזיהוי על ידי מיקרוסקופ TIRF, הרומז על מצבה העגום של תא T degranulation.

הידע המדעי של התכונות מבנית של תא T החיסון הסינפסות ולקשר שלהם לפעילות פונקציונלי של תאי T נוצרה בעיקר מן המחקר של שורות תאים, שיבוטים נגזרת PB. כדי באיזו מידה ממצאים אלה מתייחסות העיקרי בתאי T שהתקבל מן הדם או הלימפה ברקמות אנושיות עדיין לא ברור, כפי שיש הממשקים סינפטית של תאי T המתגוררים רקמות הלימפה ואחרים לא נותחו עד כה. חשוב, המתעוררים הנתונים מראים כי תאי T רקמות תושב ו הלימפה איברים-נגזר יכול להיות הבדלים משמעותיים שלהם פנוטיפ ופעילות תפקודית בהשוואה לאלו ב PB6,7. זה התחזק עוד יותר את הצורך להבין טוב יותר את התכונות של הממשק סינפטית T-cell בתאי T אדם ראשי
לשם כך, פיתחנו בגישה מידה מיני הרומן ניצול שומנים בדם bilayers בנוי לתוך שקופיות רב-ערוצי זרימה המאפשרת לנו לבצע ההדמיה של T-תא/bilayer ממשקים עם פחות מ- 105 ראשי תאי T מבודד PB אנושי, LN. טכניקה חדשנית זו מאפשרת חקר המאפיינים ביופיזיקלי של ראשי אדם T-cell סינפטית ממשקים כדי מודל טוב יותר ולהבין ויוו תא-תא אינטראקציות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD4 T cell isolation kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 T cells Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-096-495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOGS NTA</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790528C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl Cap PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870273C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin</td>
			<td>Octapharma USA</td>
			<td>NDC 68982-643-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips for sticky-Slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioptech FCS2 Chamber</td>
			<td>Bioptech</td>
			<td>060319-2-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-0037-81</td>
			<td>OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- CD28 antibody</td>
			<td>Genetex</td>
			<td>GTX14664</td>
			<td>9.3 clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEO4-NHS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Cy5 NHS Ester</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>PA15101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V412020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>37409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free Drosophial media Insect-XPRESS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-730Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma YN1/1.7.4</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL1878</td>
			<td>The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9142</td>
			<td>Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterFlex tangential flow concentrator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77601-60 7592-40</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Lab Tangential Flow Systems</td>
			<td>Pall Laboratory</td>
			<td>FS002K10 OS010T12 FS005K10</td>
			<td>Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td>131384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human antibody against CD107a</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td>555798</td>
			<td>Clone H4A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ansell Natural Blue Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-014-539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6320-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>ProZyme</td>
			<td>SA10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph Premier Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the synaptic interface of primary human t cells from peripheral blood and lymphoid tissue

להבנת הדינמיקה הנוכחי ותכונות מבנית של T-cell ממשקי סינפטית כבר נקבע במידה רבה באמצעות הנתמכות על-ידי זכוכית bilayers מישורי, במבחנה-תא T נגזר שיבוטים או קווים1,2 3, ,4. כמה ממצאים אלה חלות ראשי T תאים אנושיים מבודד מן הדם או הלימפה ברקמות אינו ידוע, בין השאר בשל קשיים משמעותיים בהשגת מספר מספיק של תאים עבור ניתוח5. כאן נוכל לטפל בבעיה זו דרך פיתוח טכניקה ניצול הזרימה רב-ערוצי שקופיות כדי לבנות השומנים מישורי bilayers המכילה מולקולות הפעלת והצמדות. הגובה הנמוך של השקופיות זרימה מקדם שקיעת תאים מהירה כדי לסנכרן מצורף תא: bilayer, ובכך לאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של היווצרות ממשק סינפטית וקינטיקה של המהדורה גרגירים. אנו מיישמים גישה זו כדי לנתח את ממשק סינפטית של מעטים כמו 104 עד 105 ראשי cryopreserved תאי T מבודד מן בלוטות הלימפה (LN) ודם היקפי (PB). התוצאות חושפים כי הטכניקה bilayer השומנים מישורי הרומן מאפשר חקר המאפיינים ביופיזיקלי של ראשי האנושי T תאים שמקורם דם ורקמות בהקשר של מחלה ובריאות.

ראשית, השווינו את המבנה של הממשק סינפטית הנוצרת על-ידי הופעל CD8 כבל דם-נגזר+ T תאים נחשפים השומנים bilayers נבנה גם זרימה בקנה מידה גדול מסורתיים בתוך מערכות התא (ראה את הטבלה של חומרים לפרטים)1 ,2,3,4 או בשקופיות זרימה רב-ערוצי. Bilayers הכילה התווית על-ידי פלורסנט אנטי CD3 ו- ICAM-1-50 מיקרומטר2 ומולקולות 300/מיקרומטר2, בהתאמה. CD8+ T תאים שמקורם דם טבורי האנושי הופעלו על ידי גירוי עם צלחת מכורך אנטי CD3 ו- anti-CD28 נוגדנים13,14. לא היה הבדל בין CD8+ T תאים את הסינפסות אימונולוגי קלאסית בנוי על bilayers השומנים בנה התא זרימה או השקופית רב-ערוצי זרימה (איור 1). כל הניסויים אחרים בוצעו עם השומנים bilayers תוצרת השקופיות זרימה רב-ערוצי.
בשלב הבא, בדקנו את היכולת של חמאת בוטנים ו LN-נגזר CD4 האנושי+ T תאים כדי ליצור ממשקים סינפטית עם bilayers השומנים מישורי ולשחרר גרגרי. נוכל לנצל את TIRF מיקרוסקופ כדי להגדיל את הרזולוציה אנכי-הממשק תא T-bilayer דמיינו degranulating תאים וכדי להעריך את קינטיקה של המהדורה גרגר. נצפו 4 קבוצות של תאים עבור שניהם CD4 LN, PBMC-נגזר+ T תאים: כמה תאים T הקים בוגר הסינפסות המערכת החיסונית, אך גם עשה או לא תשחרר בגרגרים, ותאי T אחרים שפורסמו את גרגרי ללא היווצרות של הסינפסות בוגרת, ואני עדיין תאי T אחרים לא נוצר הסינפסות ולא פרסמה את גרגרי (איור 2)7. ההבדל בין CD4 LN - ו PBMC-נגזר+ T תאים התברר כאשר קינטיקה של המהדורה גרגר הוערך. CD4 נגזר PBMC+ T תאים היו מסוגלים להתחיל שחרור בגרגרים כמעט פי שתיים יותר מהר CD4 LN, נגזר+ תאים (איור 3)7. בסך הכל, הנתונים להדגים זאת למרות הזה של CD4 LN - ו PBMC-נגזר+ T תאים, האחרון הכיל שבריר של T תאים מסוגלים degranulation מהירה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig1.jpg"> איור 1: השוואה של המערכת שקופית זרימה זרימת קונבנציונאלי תא. (A) לוח זה מראה זרימת רב-ערוצי שקופית המאפשר הרכבה של 6 הנתמכות על-ידי זכוכית השומנים מישורי bilayers. כל bilayer מחובר המשלוח לבין נמלי יציאה. פחות מ 1 x 105 תאים מספיקים לניתוח. (B) לוח זה מציג מערכת קאמרית הזרימה קונבנציונאלי המאפשר הרכבה של 1 הנתמכות על-ידי זכוכית מישורי ליפידית. 2 x 106 תאים נדרשים לניתוח. הלוחות האחרים להראות (C ו- D) נציג מיקרוסקופ TIRF ו- (E ו- F) עם הפרעות השתקפות מיקרוסקופ קונפוקלי (IRM) תמונות של הממשק שפותחה על ידי הפעלת נגזר דם טבורי ותאי CD8 T. התאים נחשפו ליפידית המכיל ICAM-1 (2מולקולות 300/מיקרומטר) ונוגדנים anti-CD3 (50 מיקרומטר/מולקולות2) רכשה (C ו- E), זרימה שקופיות או (D ו- F) בקונבנציונאלי מערכת זרימה בתנאים דומים. מיקרוסקופ TIRF ואת קונאפוקלית באמצעות IRM תמונות נלקחים באמצעות 100 X 60 X הגדלה מטרות, בהתאמה. האחוז של תאי T טופס בוגרת synapses על bilayers בנה או בשקופית זרימה או זרימה קונבנציונאלי קאמרית היה דומה מאוד אך משתנה בין ניסויים בין 75% ל- 90%. כל התמונות, מולקולות Cy-5-מתויג ICAM-1 מוצגים בכחול; נוגדנים אנטי-CD3 אלקסה-עבור חיל הים-488-שכותרתו מוצגים בירוק; נוגדנים אנטי-CD107a אלקסה-עבור חיל הים-568-שכותרתו מאוגדים CD107a מוצגים באדום; IRM תמונות מוצגות באיור תכלת; בפסי בקנה מידה 10 מיקרומטר באורכו. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig2.jpg"> איור 2: מבנה של תא T – bilayer ממשק ואת התבנית של degranulation על ידי הלימפה ההיקפית דם תאי CD4+ T תאים. תאים LNMC או PBMC-נגזר היו מיון כדי להפריד CD4+ T תאים אשר נחשפו את bilayers המכיל 50 מיקרומטר/מולקולות2 של נוגדנים אנטי-CD3 ומולקולות 300/מיקרומטר2 ICAM-1 חלבון. הממשק בין התאים bilayers צולמה על ידי מיקרוסקופ TIRF. פסי בקנה מידה הם 5 מיקרומטר. (א) אלה להחליפן בתמונות של תא T - bilayer ממשק להדגים את המבנה של תא T – bilayer ממשקים, דפוס degranulation. (B) הצג דיאגרמות אלה ייצוג של CD4 LNMC ו PBMC-נגזר+ T תאים עם מבנה שונה של ממשקי סינפטית ודפוסים של שחרור גרגר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58143/58143fig3.jpg"> איור 3: שינויים דינמיים של המבנה של ממשק תא T – bilayer וקינטיקה של degranulation ושל הלימפה ההיקפית דם תאי CD4+ T תאים. (א) לוח זה מראה שינויים תלויי-זמן של ממשק תא T – bilayer את המראה של גרגרי שפורסמו. פסי בקנה מידה הם 5 מיקרומטר. (B) לוח זה מראה על כימות של קינטיקה של שחרור גרגר על ידי CD4 LN-derived+ T תאים (מעגלים סגורים) ו CD4 נגזר PBMC+ T תאים (מעגלים פתוחים). כל מעגל בודדים מציין את הזמן של ההופעה הראשונה של שחרור גרגר לזיהוי על ידי תאים בודדים. החציון ואת IQR (טווח בין רבעוני) מוצגים עבור כל פיזור החלקות. מאן-ויטני בדיקות בוצעו כדי להשוות את ההבדלים בין הקבוצות המצוין של תאי T. P < 0.05, * * P < 0.01. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58143/58143fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue at JoVE.com

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

assessment-synaptic-interface-primary-human-t-cells-from-peripheral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.4K Views.  Thomas Jefferson University. הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.

Video: Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

ניתוח של חילוף החומרים של תאי הרוצח הטבעי האנושי

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...