C.m. wird unterstützt durch die Finanzierung von NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) und die NIAID (1DP1AI124453).

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Um den Erfolg dieses Protokolls sicherzustellen, ist es wichtig, Maßnahmen ergreifen, um eine ausreichende Anzahl von Larven, die Experimente durchführen zu erhalten. Dazu gehören Pre-Fütterung die fliegen in Hefe einfügen-haltigen Fläschchen für 2-3-d zur Eiablage zu verbessern. Die Fläschchen müssen platziert in einer Schale mit Wasser Fläschchen und eingeschlossen in eine klare Plastiktüte, die bewahrt der Feuchtigkeit der Nahrung und fördert effektive Fütterung durch die Larven während der Exposition gegenüber normalen hell-dunkel-Zyklen bei schönem. Die Hefe-Paste sollte jedoch nicht so weich sein, dass die fliegen gefangen werden. Die Anzahl der Weibchen pro Vial richtet sich nach dem Genotyp. Bei w1118ist es in der Regel ausreichend um ~ 12 Weibchen und Männchen ~ 6 Eier für 3 h zu ermöglichen. Zwei Fläschchen bieten in der Regel genug Larven (100-200 Larven) auf eine Platte für die Einzel-Richtungs-Assay. Wenn die Fliege Aktie weniger Eier als Wildtyp legt- oder des Anteils der Larven, die schlüpfen sinkt, fügen Sie hinzu (bis zu 30-35/Vial) zusätzliche Weibchen und Männchen.
Es gibt viele Ursachen der unbeabsichtigten Variabilität bei der Durchführung dieser Tests. Das Entwicklungsstadium beeinflusst die Temperatur-Einstellung der Larven. Daher ist es zwingend notwendig, um die Larven von einem definierten Zeitpunkt mit Vorsicht verwenden. Dazu sammeln Sie Larven über einen engen Zeitrahmen (z. B. 3 h). Da die Aufzucht Bedingungen (Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Licht-Dunkel-Zyklus und Art der Nahrung) und einige Mutationen die Rate der Entwicklung betreffen, verlassen Sie sich nicht ausschließlich auf die Zeit nach der Eiablage um vergleichsweise analysieren Larven im Alter. Es ist auch wichtig, körperliche Merkmale, wie die Größe der Mund Haken und Luftlöcher7 , ob Larven der verschiedenen Genotypen in der gleichen Entwicklungsphase sind zu untersuchen. Die Zeiten für 1St, 2Nd und 3rd Instar Larven entwickeln (Tabelle 1) basieren auf mit Maismehl-basierten Lebensmitteln und Inkubation bei 25 ° C unter 12 h Licht: 12 h dunkel-Zyklen. Larven wachsen langsamer auf Melasse basierenden Nahrung. Richtige Hydratation und Nahrung frische wirkt sich auch auf das Wachstum der Larven. Die Menge des Wassers in der Nahrung sollte das Essen weder zu trocken, um wieder aus der Durchstechflasche schälen noch zu locker durch überschüssiges Wasser lassen. Im Idealfall die ~ 5 mm Schicht am nächsten Lebensmittel-Oberfläche ist bedingt durch die wachsenden Larven und bewegt sich leicht, wenn das Fläschchen gekippt oder angezapft wird. Diese Bedingung kann mit frisch zubereiteten Speisen mit 50-100 Larven erreicht werden.
Es ist unentbehrlich, eine stabile Temperaturgradient vor Beginn des Tests. Daher schalten Sie das Wasserbad ca. 1-2 h vor der Einleitung der Test wie die Wasserbädern Wärme erzeugen und die Raumtemperatur ändert, die haben wiederum Auswirkungen auf den Verlauf haben. Nach 1-2 h gestalten die Umgebungstemperatur der meisten klimatisierte Zimmer. Dies muss jedoch in jeder Umgebung bestimmt werden. Darüber hinaus, wenn Sie einen Farbverlauf mit einem großen Temperaturbereich zu generieren (> 3,0 ° C/cm), es kann schwierig sein, einen stabilen Verlauf zu erhalten. Eine winzige Bewegung der Assay-Platte noch bedeutsamer ist der Temperaturgradient ändert, wenn die Auswahl groß ist (z. B. > 3,0 ° C/cm). Wir fanden, dass ein Gefälle von 1 bis 2 ° C/cm die stabilsten Gradienten produziert.
Es gibt mehrere zusätzliche Überlegungen, die müssen kontrolliert werden, um die Variabilität in der Thermotaxis-Assays zu begrenzen. Waschen Sie die Larven ist kritisch, wie das Vorhandensein von Speiseresten oder Saccharose auf die Larven der Assay auswirken kann. Die Waschschritte müssen gründlich durchgeführt werden, aber schnell, weil ihre Sauerstoffversorgung Begrenzung übermäßig während sie in eintauchen Wasser beeinträchtigen ihre Gesundheit. Wir empfehlen daher, mit der Zelle-Sieb (Option 2) um die Larven zu reinigen. Ein Sieb mit einer Porengröße von 300 µm funktioniert gut für die Larven bei den ersten 3rd instar Bühne (72 h AEL) oder älter. Es ist darüber hinaus wichtig, Experimente zur gleichen Zeit des Tages, wie z. B. vom Zeitgeber (ZT) ZT4, ZT8 Zeit (ZT = 0 ist, wenn die Lichter eingeschaltet sind), Variabilität aufgrund der Auswirkungen der zirkadianen Rhythmen auf Temperaturwahl zu begrenzen. Der Grad der Feuchtigkeit auf die Agarose-Platte kann auch Variabilität in den Ergebnissen führen. Während die Oberfläche der Platten feucht sein muss, könnte Wassertropfen fangen die Larven und müssen daher vermieden werden.
Begrenzung der Variabilität in der Assays machen es möglich, robuste Ergebnisse zu erhalten, ohne die große Anzahl von unabhängigen Experimenten durchführen. In der Regel sind 3-8 unabhängige Experimenten ausreichen, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erhalten. Ordnungsgemäße Aufstellung der Ergebnisse ist auch entscheidend für den Erfolg von Thermotaxis-Assays. Zählen Sie nicht Larven in den Regionen innerhalb 0,5 cm von den Wänden Aluminium verteilt, da die Temperaturen in diesen Regionen nicht linear sind. Einige Larven werden an der Grenze zwischen zwei Zonen gleichzeitig positioniert, die der Test abgeschlossen ist. Wenn mehr als 50 % der Körperlänge in einer Zone befindet, schließen Sie die Larve in der Aufstellung für die jeweilige Zone. Wenn eine Larve genau 50 % in jeder der beiden Zonen ist, dann zählen Sie das Tier als 0,5 Larven in jeder Zone.
Während gradient Assay die Larven verschiedener Temperaturunterschiede zu unterscheiden kann, gibt es Beschränkungen in Bezug auf die unteren und oberen Temperaturen, die effektiv getestet werden können. Es ist nicht möglich, Temperaturen testen < 10 ° C, da die Mobilität der Larven verringert sich stark bei niedrigeren Temperaturen. Obwohl Farbverläufe mit der oberen Temperatur bis 42 ° C hergestellt werden können, fast keine Kontrolle Larven bleiben in jeder Zone > 28 ° C. Daher können nicht kontinuierliche Steigung Assays verwendet werden, um Temperatur-Einstellungen zwischen verschiedenen Zonen unterscheiden > 28 ° C. Allerdings könnte gradient Assays bei diesen erhöhten Temperaturen Mutanten zu charakterisieren, wenn sie sehr warme Temperatur Einstellungen verschoben haben verwendet werden.
Wenn eine Mutante Bewegungsorgane Mangel aufweist, ist es möglicherweise erforderlich, zusätzliche Experimente um sicherzustellen, dass die scheinbare Temperatur-Einstellung durch eine Beeinträchtigung der Bewegung nicht zutrifft. Um dieses potentielle Problem zu beheben, kann es längere Assay Zeiten erlauben die Tiere zusätzliche Zeit, sich auf ihre gewünschten Zonen festzulegen sein. Die bidirektionale gradient Assay kann auch eingesetzt werden, zu prüfen, ob die Tiere wählen Sie die gleichen bevorzugte Zone, unabhängig davon, wo sie zunächst auf dem Teller platziert werden.
Abschließend müssen die Steigung Assays, die hier beschriebenen Vorteile gegenüber anderen Thermotaxis-Assays. Während zwei-Wege-Wahl-Assays nützlich sind, da sie robustere Ergebnissen führen können, vor allem, wenn die Temperaturunterschiede zwischen den beiden Zonen groß sind, sind sie nicht wirksam bei der Enthüllung der Idealtemperatur von Larven in einem einzigen Experiment bevorzugt. Dazu muss viele zwei-Wege-Wahl Kombinationen ermitteln, die am meisten bevorzugte Temperatur5,6,7durchführen. Im Gegensatz dazu bietet der gradient-Test dem Tier die Möglichkeit, wählen ihre bevorzugte Temperaturzone in einem Umfeld mit einer einzigen kontinuierlichen Temperatur-Landschaft. So ist es nicht notwendig, eine große Kombination der zwei-Wege-Entscheidungen die bevorzugte thermische Umgebung bestimmt zu entwickeln. Studium mit einer Runde Petrischale Thermotaxis wurde eingesetzt, um die Auswirkungen der Temperatur auf die beweglichen Dynamik einer Larve10bewerten. Allerdings ist es weniger nützlich in der Unterscheidung zwischen Einstellungen zwischen verschiedenen Temperaturen, da jede Zone eine andere Größe ist. Schließlich kann aufgrund der Einfachheit des Assays und seine Nützlichkeit in den unterscheidenden kleine Temperatur-Einstellungen in einem einzigen Assay, es Bildschirm Dutzende von Kandidatengenen eingesetzt werden, die potenziell Larven Temperatur bevorzugt beteiligt sind, die möglicherweise Ansonsten werden Sie übersehen mit anderen assays

Thermotaxis wird durch mobile Tiere eingesetzt, um eine Umgebung mit den günstigsten Bedingungen1,2,3auswählen. Wenn das Klima übermäßig heiß oder kalt, dieses Verhalten ist wichtig für das Überleben ist. Darüber hinaus viele Tiere reagieren empfindlich auf sehr kleine Unterschiede in der Temperatur im Bereich von komfortablen und Umgebung mit einer idealen Temperatur aufsuchen. Dies ist von besonderer Bedeutung für wechselwarme Organismen wie Fruchtfliegen, die ihre Körpertemperatur mit der Umgebung equilibrate. Assays, Larven Thermotaxis überwachen wurden maßgeblich bei der Identifizierung und Klärung der Rolle der molekularen Sensoren wie Drosophila Transienten Rezeptor Potential (TRP) Kanäle4,5,6, rhodopsine7,8und Ionotropic Rezeptor-Rezeptoren (IRs)9, die diese Tiere mit Temperatur Empfindlichkeiten in verschiedenen Temperaturbereichen zu verleihen.
Ein zwei-Wege-Choice-Test bietet einen Ansatz zur Untersuchung der thermischer Präferenzen in Larven6,7. Der Test beinhaltet zur Gründung zwei unterschiedliche Temperaturzonen und erlaubt den Tieren, eine Seite über die andere auswählen. Die Ergebnisse von zwei-Wege-Choice-Tests sind robust, vor allem wenn die Temperaturunterschiede zwischen den beiden Optionen groß sind. Darüber hinaus da jedes Assay tabellarisieren nur zwei Gruppen umfasst, können die Daten als einfache Präferenz-Index ausgedrückt werden. Die Leichtigkeit und Einfachheit der zwei-Wege-Wahl-Assays sind auch genetische Bildschirme zugänglich. Eine große Einschränkung ist jedoch, dass viele Experimente erforderlich sind, um die gewünschte Temperatur der Wildtyp oder mutierte Tiere zu etablieren.
Ein gradienter Assay bietet die Möglichkeit, die gewünschte Temperatur in einem einzigen Test8aufzunehmen. Darüber hinaus ermöglicht es im Gegensatz zu den zwei-Wege-Choice-Test, die Auswertung der Verteilung der einer Gruppe von Tieren, konfrontiert mit einer kontinuierlichen Reihe von Temperaturen. Ein gradient Assay verwendet eine Petrischale und Einzeltiere und eignet sich gut für die Charakterisierung von detaillierten Verhaltens einzelner Tiere10. Jedoch da Petrischalen Runde sind, die Größen der Temperaturzonen variieren und sind abhängig von der Entfernung vom Zentrum nach und nach kleiner. Dieses Setup ist daher nicht ideal für die Überwachung der Temperatur-Auswahl der Populationen von Tieren.
Eine kontinuierliche thermischen Gradienten Apparat, der gut geeignet, um die Temperatur-Einstellungen von Gruppen von Larven zu beurteilen ist eine rechteckige Arena beschäftigt und wird hier beschrieben. Das Gerät ist einfach zu konstruieren und montieren. Die Steigung ist linear und ist flexibel, da es verwendet werden kann, inwieweit Thermotaxis über große Temperaturbereiche von 10 ° C bis 42 ° C. Der Test ist schnell und unkompliziert durchzuführen und liefert reproduzierbare Daten. Neben der Berichterstattung der bevorzugten Temperatur der Larven, zeigt es die Präferenzen der Bevölkerung von Tieren über eine gesamte lineare Bereich in einem einzigen Experiment. Aufgrund dieser Vorteile ist es eine ausgezeichnete Wahl für die Identifizierung von Genen, die für Thermotaxis erforderlich.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gradient assay apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>9106</td>
			<td>This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum assay plate (for single directional gradient)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate (for bidirectional gradient)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector for aluminum blocks and tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91355K82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Sanitary Silicone Tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>57296</td>
			<td>1/4&#34; ID x 3/8&#34; OD x 1/16&#34; wall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Items and reagents for assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>17361</td>
			<td>Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>51II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>K type</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal microplate lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6980A77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9380D40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape (for bidirectional gradient)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-951</td>
			<td>Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td>Prepare 1% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389-5KG</td>
			<td>Prepare 18% solution right before starting assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoopula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL round wide-mouth bottle</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1395-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (300 mm pore)</td>
			<td>PluriSelect</td>
			<td>43-50300</td>
			<td>Optional item for larvae washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard box (vial tray)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>FS32-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila food</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22,400 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg</td>
			<td>LabScientific Inc.</td>
			<td>NC0535320</td>
			<td>1,609 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewers yeast 100 lbs</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN90331280</td>
			<td>379 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriSoy&#174; Soy Flour (10 kg/unit)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-115</td>
			<td>221 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar, Type II (5 kg)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-103</td>
			<td>190 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karo light corn syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td>1,700 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H5501-5KG</td>
			<td>72 g/240 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid puriss. p.a.,&#62;99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>81910-1 L</td>
			<td>108 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid&#160;ACS reagent, &#8805;85 wt. % in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438081-500 mL</td>
			<td>8.5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a temperature gradient assay to determine thermal preferences of drosophila larvae

Viele Tiere, einschließlich der Taufliege Drosophila Melanogaster, sind in der Lage, unterscheidende winzige Unterschiede in der Umgebungstemperatur, die ihnen ermöglicht, ihre bevorzugten Thermenlandschaft suchen. Um die Temperatur-Einstellungen von Larven über einen definierten linearen Bereich zu definieren, haben wir einen Test mit einem Temperaturgradienten entwickelt. Um einen Single-direktionalen Verlauf zu etablieren, sind zwei Aluminium-Blöcke mit unabhängigen Wasserbäder, verbunden, die jeweils die Temperatur der einzelnen Blöcke steuert. Die beiden Blöcke setzen die unteren und oberen Grenzen des Farbverlaufs. Der Temperaturgradient entsteht durch eine Agarose-beschichteten Alu-Platte über die zwei Wasser-gesteuerte Blöcke platzieren, damit die Platte erstreckt sich über den Abstand zwischen ihnen. Die Enden der Aluminiumplatte, die oben auf dem Wasser-Blöcke festgelegt ist definiert die minimalen und maximalen Temperaturen und die Regionen zwischen den beiden Blöcken bilden ein linearer Temperaturgradient. Der gradient-Test kann an Larven verschiedener Altersstufen angewendet werden und kann verwendet werden, um durch Mutation entstehende Variationen zu identifizieren, die Ausstellung Phänotypen, wie jene mit Mutationen Gene codieren, TRP-Kanäle und Opsins, die für Temperatur Diskriminierung erforderlich sind.

Um eine 18 ° C - 28 ° C Single-direktionale etablieren soll Gefälle, wir die Temperaturen der zwei Wasserbäder 16,8 ° C und 31 ° C. Wir erreichen die Temperaturen auf 13 Punkte durch Messen der Temperatur bei 26 Positionen innerhalb der oberen und unteren Abschnitte aller 6 Zonen, die Grenzlinien zwischen den Zonen und an den äußersten Enden der Agarose-Gel-Oberfläche (Abbildung 2, 2E). Die Temperaturverteilung entlang der Steigung war fast linear (Y = 0,9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (Abb. 2E).
Wir untersucht die Temperatur Präferenzen der Kontrolle (w1118) Larven in verschiedenen Altersstufen. 1St (24 ± 1,5 h AEL), 2Nd (48 ± 1,5 h AEL) und frühen 3rd Larven (72 ± 1,5 h) zeigte Gipfeln in die 24 ° C-Zone (Abb. 3A, B). Die Temperatur-Einstellungen geändert während 3rd instar Larvalentwicklung. Der größte Anteil der Mitte 3rd Instar (96 ± 1,5 h AEL) angesammelt in den 18 ° C-Zone (Abb. 3A, B), und diese Tendenz erhöht sich mit zunehmendem Alter. Unter den späten 3rd Instar Larven (Pre-Klettern; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50 % gruppierten in 18 ° C-Zone, und die Auswahl von dieser Temperatur war ~ 4-fach höher als die angrenzenden 20 ° C-Zone (18 ° C-Zone, 50,2 %; 20 ° C-Zone, 15,1 %; Abbildung 3A " B). Die Neigung zu akkumulieren in der 18 ° C-Zone w 1118 lag nicht an ein Randeffekt seit den späten 3rd instar Larven noch angesammelt in der 18 ° C-Zone mit einem bidirektionalen Temperaturgradienten (Abbildung 3E, F ).
Wir testeten auch spät-3rd Instar Larven (120 ± 1,5 h AEL) mit Mutationen in Genen, die für anspruchsvolle Temperaturunterschiede im Bereich von komfortablen erforderlich. Dazu gehören trpA1, was für normale Temperaturwahl in 18 ° C - 24 ° C Reihe5,7,8erforderlich ist. Larven mit einer null-Mutation im trpA1 (trpA11) verteilen sich gleichmäßig über die gesamte 18 ° C-28 ° C Farbverlauf (Abbildung 3). Fehlt nur der A und B Isoformen (trpA1-ABG4) oder der C und D Isoformen (trpA1-CDG4) auch Larven zeigen schwere Beeinträchtigungen (Abbildung 3). Fliegen zwei Isoformen von Phospholipase Cβ (PLC21C und NORPA) kodieren, und Mutationen NorpA (NorpAP24) aber nicht plc21c (plc21cP319) auch stören Akkumulation im Bereich von 18 ° C ( 3D Abbildung).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig1.jpg"> Abbildung 1: Vorrichtung zur Durchführung von Einzel-direktionale Temperaturgradient Assay. (A) Aluminium Platte verwendet für Untersuchung Larven Thermotaxis Verhalten testen. Die 13 schwarzen Linien am oberen und unteren abzugrenzen 12 Zonen (10 mm). Die Unterseite der Platte ist mit schwarzer Farbe eloxiert, so dass es einfacher ist, die Larven zu visualisieren. (B) Dimensionen der Aluminiumplatte (angegeben in mm). Die äußere Größe der Aluminiumplatte ist 140 x 100 x 9 mm. Die innere Größe der Aluminiumplatte ist 130 x 90 x 8 mm. Die Abgrenzungen sind um 10 mm getrennt. Die erste und letzte Abgrenzung ist 5 mm von den Kanten des inneren Bereichs der Platte. (C) Top und Seitenansichten eines Aluminium-Blöcke verwendet, um die Temperatur des Verlaufs zu kontrollieren. Der Block hat zwei Steckverbinder Anfügen an Silizium-Röhren, die mit einem Wasserbad verbinden. (D) Dimensionen von einem Aluminiumblock. Die äußere Größe der Aluminiumblock ist 255 x 50 x 14 mm. Der Durchmesser des inneren Wasserweg beträgt 7 mm. Zwei 30-mm-Anschlüsse auf der linken Seite verbinden Sie mit Silikon-Schläuche, die auf dem Wasserbad erstreckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57963/57963fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig2.jpg"> Abbildung 2: Einzel- und bidirektionale gradient Assay-Setups. (A) Single-direktionale gradient Setup mit zwei Aluminiumplatten Assay auf zwei Aluminium-Blöcken. Die Temperaturen der Aluminium-Blöcke werden durch zirkulierende Wasser aus zwei Wasserbäder gesteuert. (B) die Anordnung der drei Aluminium-Blöcke, Wasserbäder und eine Alu-Platte (250 x 220 mm) für einen bidirektionalen Farbverlauf. Die linken und rechten Blöcke mit dem gleichen Wasserbad verbunden sind und der mittleren Block mit anderen Wasserbad verbunden ist. Assay Aluminiumplatte wird mit Klebeband auf eine 10 mm Wand um 1 % Agarose enthalten bilden umwickelt. (C) Positionen, Temperaturen (durch Punkte gekennzeichnet) zu überprüfen und zu Larven auf der Platte zu lösen. Überprüfen Sie vor der Einleitung eines Experiments die Temperatur an zwei Punkten innerhalb jeder Zone zu bestätigen, dass der gewünschte linearer Temperaturgradient entsteht. Larven werden innerhalb des angegebenen Bereichs in der Nähe der Mittellinie freigegeben. Die Larven werden in jedem der 2-cm-Zonen gezählt. (D) Positionen, Temperaturen (durch Punkte gekennzeichnet) und die Freigabe-Zonen für die Larven auf einer bidirektionalen Steigung zu überprüfen. Eine gleiche Anzahl von Larven werden entlang der Mittellinie des jeweils die Hälfte des bidirektionalen Verlaufs freigegeben. Die Zahl der Larven sind in jedem der 10 (2 cm) Zonen gezählt. Ein typischer Satz von Temperaturen (18 ° C - 26 ° C) auf der Oberfläche der Agarose wird angezeigt. (E) Temperaturen gemessen entlang der Grenzlinien und Mittellinien der einzelnen Zonen in einem Beispiel Single-direktionale Farbverlauf. Darstellung von Daten Mitteltemperaturen ± SD n = 8 Assays (150 ± 50 Larven/Assay). Teile davon werden von Sokabe Et Al. reproduziert. 8 mit geringfügigen Änderungen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57963/57963fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57963/57963fig3.jpg"> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse mit Single-direktionale und bidirektional gradient Assays. (A, B) Bedeuten Sie Prozentsätze der Larven in 6 Zonen auf der Single-direktionalen Verlauf. Daten umfassen 3rd Instar Larven angegebenen Stunden nach der Eiablage (AEL). n = 6-7. Die Fehlerbalken in ein dar ±SEM. (C) thermische Distributionen des Pre-Klettern Ende 3rd instar Larven der Kontrolle (w1118) und trpA1 Mutanten auf der Single-direktionalen Verlauf. n = 3-4. Die Fehlerbalken darzustellen ±SEM. (D) thermische Verteilungen der späten 3rd Instar Larven der Kontrolle (w1118) und PLCβ Mutanten auf der Single-direktionalen Verlauf. n = 4-6. Die Fehlerbalken darzustellen ±SEM. (E) repräsentative Verteilung der Pre-Klettern, spät-3rd Instar Larven (w1118) auf den bidirektionalen Farbverlauf. Die linken und rechten Assay-Zonen sind durch punktierte Linien gekennzeichnet und getrennt durch die keine-Count-Zone in der Mitte (schattigen Bereich). (F) Prozentsatz des Kletterns bereits Ende 3rd instar Larven (w1118) in jeder Zone entlang das Temperaturgefälle. Larven wurden in der linken und der rechten Seite lassen Sie Zonen. Der Assay-Zonen sind durch eine 3 cm-keine-Graf-Zone in der Mitte getrennt und die Verteilungen werden unabhängig voneinander berechnet. Die Fehlerbalken darzustellen SEMs. n = 3 Assays (200-400 Larven/Assay). Teile davon werden von Sokabe Et Al. reproduziert. 8 mit geringfügigen Änderungen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57963/57963fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stunden AEL</td>
			<td colspan="2">Larvenstadium</td>
		</tr>
<tr>
<td>24</td>
			<td colspan="2">1St instar</td>
		</tr>
<tr>
<td>48</td>
			<td colspan="2">2Nd instar</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td colspan="2">Ersten 3rd instar</td>
		</tr>
<tr>
<td>96</td>
			<td colspan="2">Mitte-3rd instar</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td colspan="2">Spät-3rd Instar, kurz vor der Bühne Klettern</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Die Beziehung zwischen den Stunden nach der Eiablage (AEL) und Larvenstadien.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperaturgradienten auf Agarose-Teller (Steigung)</td>
			<td>Temperaturen von Wasserbäder</td>
			<td>Temperaturen von Aluminium-Blöcken</td>
		</tr>
<tr>
<td>10,0-25,0 ° C (1,5 ° C/cm)</td>
			<td>~6.5-7°C/~28.5°C</td>
			<td>~8.5°C/~26.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>18.0-28,0 ° C (1° C/cm)</td>
			<td>~16.8°C/~31.0°C</td>
			<td>~17.8°C/~29.7°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>14.0-34,0 ° C (2° C/cm)</td>
			<td>~10.0°C/~40.0°C</td>
			<td>~11.8°C/~36.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>12,5-42,0 ° C (2,95 ° C/cm)</td>
			<td>~7.0°C/~55.0°C</td>
			<td>~9.4°C/~49.4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. Typische Temperaturgradienten und die entsprechenden Temperaturen der Wasserbäder und Aluminium Blöcke für einzelne gerichtete Steigungen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperaturgradienten auf Agarose-Teller</td>
			<td>Temperaturen von Wasserbäder</td>
			<td>Temperaturen von Aluminium-Blöcken</td>
		</tr>
<tr>
<td>22.10.22 ° C (1,5 ° C/cm)</td>
			<td>~5.0°C /~25.0°C</td>
			<td>~7.5°C/~24.0°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>26-18-26 ° C (1° C/cm)</td>
			<td>~15.8°C /~30.6°C</td>
			<td>~16.9°C/~28.4°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>30-14-30 ° C (2° C/cm)</td>
			<td>~8.5°C /~36.4°C</td>
			<td>~10.9°C/~32.8°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm)</td>
			<td>~5.0°C /~47.2°C</td>
			<td>~7.9°C/~40.9°C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Typische Temperaturgradienten und die entsprechenden Temperaturen der Wasserbäder und Aluminium Blöcke für bidirektionale Farbverläufe.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Larven Alter (AEL)</td>
			<td>Assay-Zeit (einzelne Richtungen)</td>
			<td>Assay-Zeit (bidirektional)</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 h</td>
			<td>30 min</td>
			<td>35 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>48 h</td>
			<td>22 min.</td>
			<td>27 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 h</td>
			<td>16 min.</td>
			<td>21 min.</td>
		</tr>
<tr>
<td>96 h</td>
			<td>13 min.</td>
			<td>18 min.</td>
		</tr>
<tr>
<td>120 h</td>
			<td>10 min</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4. Larval Altersgruppen (AEL) und die entsprechenden Assay-Zeiten.

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A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die bevorzugte Umgebungstemperatur von Drosophila -Larven mit einem kontinuierlichen Temperaturgefälle zu bestimmen.

Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

a-temperature-gradient-assay-to-determine-thermal-preferences

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

7.5K Aufrufe.  University of California, Santa Barbara. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die bevorzugte Umgebungstemperatur von Drosophila -Larven mit einem kontinuierlichen Temperaturgefälle zu bestimmen.

Serie: A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Gepaart Nanoinjection und Elektrophysiologie-Test zum Screening auf Bioaktivität der Verbindungen unter Verwendung des Drosophila melanogaster Riesen-Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...