Der Autor dankt der National Institutes of Health für die letzten Finanzierung und Dank Michael R. Green für die Synthese von Oligonukleotiden.

Hinweis: Abbildung 1 gibt einen Überblick über Phosphorothioat Mutagenese und fasst die wichtigsten Schritte im Prozess.
1. Generation aus einer Bibliothek von Mutanten-Doping DNA Schablone mit Wild-Typ Nukleotide
<ol><li>Synthetisieren T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3 ") durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer.</li>
	<li>Durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer, die Protein-Bindungsstelle entspricht einem dotierten Oligonukleotid (komplementäre Strang) zu synthetisieren. Verwenden Sie eine geeignete Mischung von Phosphoramidites bei der chemischen Synthese für jeden Standort von doping (X unten) mit einem Verhältnis von 90 % A als der Wildtyp Nukleotid und 10 % T als Wild-Typ Nukleotid (siehe repräsentative Ergebnisse für weitere Einzelheiten über dieses Verhältnis). Hinweis: Hier ist die Reihenfolge des dotierten Oligonukleotids 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 ". Die unterstrichene Sequenz ist die umgekehrte Ergänzung SXL-Protein-Bindungsstelle, plus zusätzliche Nukleotide außerhalb der Bindungsstelle, die bieten nützliche Kontrollen bestätigt wird, dass nicht jede Änderung in der RNA wirkt sich verbindlich, als laden-Steuerungen für Vergleich und Normalisierung der Nukleotide in die Bindungsstelle. Die SXL-Bindung Seite Reihenfolge UUUUUGUUGUUUUUUUU, die im Transformator Pre-mRNA14,15,16,17vorhanden ist, wurde verwendet, um die vorgeschlagene Methodik zu entwickeln. Die Reihenfolge in Kursivschrift ist komplementär zu der T7 Primer Sequenz und ist der T7-Promotor für in-vitro- Transkription.</li>
</ol>2. Synthese von RNA
<ol><li>
RNA in einer 20 µL Transkription Reaktion, wie zuvor beschrieben18zu synthetisieren.
	<ol>
<li>Mix-T7 Transkription Puffer und 1 µM T7 Oligonukleotid, 1 µM dotierten Oligonukleotid, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM ATP, CTP, und UTP (Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uridin Triphosphat) und 2 U/µL T7 RNA-Polymerase.</li>
		<li>Fügen Sie in zwei separaten Mikrozentrifugenröhrchen 0,167 mM α-Thio ATP oder 0,05 mM α-Thio UTP, RNAs phosphorthioate (siehe Schaltpläne in Abbildung 2) einzubringen. Hinweis: Für alternative Protokolle fügen Sie 0,2 mM α-Thio CTP oder 0,2 mM α-Thio GTP zu einer entsprechenden Transkription Reaktion mit einer dotierten Oligonukleotid um die beiden verbleibenden Nukleotid Substitutionen zu testen hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die RNA-Synthese Reaktionsgemisch für 2 h bei 37 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die RNA-Probe 2,5 µL Hitze-labile alkalische Phosphatase und 2,5 µL 10xphosphatase-Puffer hinzufügen. Inkubieren Sie diese 25 µL Reaktion für 10-30 min bei 37 ° C, 5' Phosphate zu entfernen.</li>
	<li>Inaktivieren Sie das Enzym alkalische Phosphatase durch Erhitzen auf 80 ° C für 2 – 5 min.</li>
	<li>Radiomarkierung 5'-Ende der rezeptorsignals RNA (5 Pmole) mit 1 µL T4-Polynukleotid-Kinase und 1 µL γ -32P ATP in eine 10 µL Reaktionsvolumen. Inkubieren Sie die Reaktion Mischung für 30 – 60 min bei 37 ° c</li>
	<li>Deaktivieren Sie das T4 Polynukleotid Kinase Enzym durch Erhitzen bei 65 ° C für 20-30 min.</li>
	<li>Gel reinigen die RNA durch Elektrophorese in einer 10 % denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Suchen Sie RNA auf das Gel durch Autoradiographie. Verbrauchsteuern die Gel-Scheibe mit radioaktiven RNA, Zerkleinern in einem Microcentrifuge Schlauch durch Drücken gegen die Wände mit einer Pipettenspitze und Proteinase K (PK) Puffer (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Sodium Dodecyl Sulfat) einziehen. Drehen Sie das Rohr bei Raumtemperatur von 2 h über Nacht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Gel-Gülle, entsorgen Sie das Gel und Sammeln der Pufferlösung.</li>
	<li>Die Lösung zweimal in gleicher Lautstärke von Phenol-Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert und die wässrige Phase zu sammeln.</li>
	<li>Hinzufügen der wässrigen Phase 0,1 Volumen von 3M Natriumacetat, pH 5,2, Träger tRNA oder Glykogen und 2,5 Volumen Ethanol. Halten Sie die Probe bei-80 ° C für 1 h.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe für 5 – 10 min in ein high-Speed-Microcentrifuge 16.873 x g. Entfernen Sie die Puffer/Ethanol-Lösung ohne störende RNA Pellet vorsichtig.</li>
	<li>Waschen Sie die Pellets mit 70 % Ethanol und Zentrifugieren für 2 – 5 min. entfernen Ethanol sorgfältig. Das Pellet in Luft zu trocknen.</li>
	<li>Das Pellet in 20 – 50 µL Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) aufzuwirbeln-behandeltem Wasser. Bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit radioaktiven RNA mit entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen und Plexiglas Schild zum Schutz vor Radioaktivität. Derzeit sind Spin Spalten häufig verwendeten und bequemer zu entfernen nicht inkorporierten Radioaktivität, als Alternative zu Gel-Reinigung von RNA.</li>
</ol>3. Verbindliche Reaktion und Trennung von gebundenen RNA protein
<ol><li>Das rekombinante Protein in Express und Reinigen von E. Coli.</li>
	<li>Rekombinantes Protein-Konzentration durch Spektralphotometrie oder durch die Trennung in einem SDS-Polyacrylamid-Gel neben einem bekannten Protein standard, bovine Serum-Albumin (BSA) zu schätzen. Visualisieren Sie das Protein des Interesses und der BSA standard durch die Färbung des Gels mit Coomassie Brilliant Blue R-250. Das Protein im Vergleich zu bekannten Größen der BSA Verdünnungen auf dem gleichen Gel quantitate. Hinweis: Bewahren Sie rekombinantes Protein bei - 80 ° C bis zur Verwendung und verdünnt in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-Ethanesulfonic Säure (HEPES), pH 8.0, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 0,05 % NP-40, 20 % Glycerin. Verwendung von 0,5-1,0 mM Protease-Inhibitor Phenylmethane Sulfonyl Fluorid (PMSF) ist optional.</li>
	<li>Führen Sie RNA-bindende Reaktion (20 – 100 µL) in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0,5 Einheiten/µL RNase-Inhibitor, 0,09 µg/µL acetyliert Rinderserumalbumin, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL tRNA, 5'-Ende radioaktiv RNA und 6 µL (eine entsprechende Konzentration Konzentration auf die ~ 50 % der RNA an Protein bindet) des Proteins. Hinweis: Dieser Bindung Puffer arbeitet für drei RNA-bindende Proteine (SXL, U2AF65, und PTB), aber für ein Protein des Interesses standardisiert werden muss. Schätzen die Proteinkonzentration empirisch mit verschiedenen Verdünnungen für ein gegebenes Protein-Vorbereitung, die erforderlich ist, um ca. 50 % erzielen RNA-bindende. Dieser Zustand oder Kd stellt den empfindlichsten Teil der RNA-bindende Kurve.</li>
	<li>Inkubieren Sie Protein verbindliche Reaktion für 20-30 min bei 25 ° C (oder auf Eis).</li>
	<li>
Der ungebundene Anteil mit einer der beiden Ansätze trennen Sie den proteingebundenen RNA Bruch:
	<ol>
<li>Nitrozellulose Filtern Bindung<ol>
<li>Auftragen Sie die verbindliche Reaktion (20 – 100 µL) auf einen Nitrozellulose-Filter angeschlossen, vielfältige Vakuum bei Raumtemperatur. Hinweis: Nur der RNS-Protein-Komplex wird auf dem Filter beibehalten und ungebunden RNA fließt durch den Filter. Die verbindliche Perspektiven Filter ermöglicht höhere Wiederherstellung der gebundenen RNA und ist schneller und einfacher, im Vergleich zu Gel Mobilität Verschiebung Assay. Durch die Platzierung einer DEAE Membran unterhalb der Nitrozellulose-Filter ist es auch möglich, sammeln den ungebundenen RNA-Bruch oder freie RNA zum Vergleich mit dem gebundenen Bruch.</li>
			<li>Schneiden Sie den Teil der Nitrozellulose-Filter, enthält die einbehaltenen radioaktiven RNA in kleinere Stücke zu einem Microcentrifuge Schlauch passt in ausreichend PK Puffer (300 – 500 µL mit 10 – 20 µg (PK), die Filter-Stücke einzutauchen einweichen und eluieren RNA aus dem filter für 2 – 3 h oder über Nacht.</li>
			<li>Mit Phenol-Chloroform, Chloroform, extrahieren und wässrigen Phase zu sammeln. Hinzufügen von Natriumacetat und Ethanol und, nach der Inkubation in Gefrierschrank, Zentrifugieren, waschen, Trocknen und RNA in DEPC-behandeltem Wasser aufschwemmen. Gehen Sie folgendermaßen vor wie in Schritten 2.10, 2.14 oben beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gel-Mobilität-Verschiebung<ol>
<li>Vorbereiten und polymerisieren eine 5 % native Polyacrylamid-Gel (60:1 Acrylamide:bis-Acrylamid) in 0,5 X TBE (standard Tris-Borat-EDTA Puffer) vor Beginn der verbindliche Reaktion, als Alternative zur Bindung Filtermethode.</li>
			<li>Pre-führen Sie das Gel für 15 min bei 250 V in einem kalten Zimmer (4 ° C).</li>
			<li>Laden Sie jede verbindliche Reaktion (siehe oben) in separaten Brunnen von oben vor dem Rechenlauf Gel. Hinweis: Der Protein-Speicher-Puffer bietet ausreichend Glycerin für probenbeladung in Vertiefungen.</li>
			<li>Trennen Sie die Protein-gebundenen RNA durch Gelelektrophorese in einem kalten Raum bei 250 V für 1 bis 2 h, je nach Größe der RNA und spezifisches Protein.</li>
			<li>Platzieren Sie die RNS-Protein-Komplex auf dem Gel durch Autoradiographie. Verbrauchsteuern Sie die Gel-Scheibe mit der RNS-Protein-Komplex. Eluieren Sie die RNA von der Gel-Scheibe durch Zerkleinerung des Gel-Slices und Einweichen in der PK-Puffer.</li>
			<li>Mit Phenol-Chloroform, Chloroform, extrahieren und wässrigen Phase zu sammeln. Hinzufügen von Natriumacetat und Ethanol nach der Inkubation in Gefrierschrank, Zentrifugieren, waschen, Lufttrocknen, und RNA in DEPC-behandeltem Wasser aufschwemmen. Gehen Sie folgendermaßen vor wie in Schritten 2.10, 2.14 oben beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analyse der Jod gespalten Phosphorothioat Produkte für die Erkennung von mutierten Nukleotid-Positionen
<ol><li>Fügen Sie 1 mM Jod in einer 20 µL DEPC-behandeltem Wasser mit bis zu 10 µg Träger tRNA, RNAs (gefesselt und total RNAs) an den Standorten der Phosphorothioat Gründung zu Spalten. In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Weitere Informationen über Jod Spaltung mit leicht unterschiedlichen Bedingungen — 7 % (V/V) Iodoethanol, Heizung bei 95 ° C für 3 min — Gish & Eckstein 198819entnehmen.</li>
	<li>Niederschlag abgespalten RNA durch Zugabe von Natrium Acetat/Ethanol, wie oben beschrieben. In einem Laden Farbstoff für Denaturierung Gele aufzuwirbeln. Erhitzen Sie und laden Sie die Probe um RNA-Fragmente durch Elektrophorese in einem 15 – 20 % denaturierenden Polyacrylamid-Gel zu trennen.</li>
	<li>Setzen Sie das Polyacrylamid-Gel auf einem Röntgenfilm.</li>
	<li>Erkennen Sie Bands in der gebundenen Anteil gegenüber total Pool mit Autoradiographie. Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit Jod in einer Dunstabzugshaube. Für RNA-Trennung hier gezeigt ist eine keilförmige Gel eingesetzt, das wird erreicht durch eine Verdoppelung der Dicke der beiden Abstandhalter am unteren Rand der Gel-Platten durch das Einfügen einer extra langen Abstandshalter an der Unterseite des Gels. Diese Form ermöglicht mehr einheitliche oder engeren Abstand zwischen kürzeren RNA-Fragmente. Alternativ kann ein Phosphorimager anstatt Röntgenfilme für die Erkennung und Quantifizierung von Radioaktivität verwendet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects.">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li><li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila.">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li><li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+germ+cells+choose+their+sex?+Drosophila+as+a+paradigm.">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li><li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary.">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li><li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline.">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li><li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins.">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520 (2007).</li><li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo.">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li><li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology.">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li><li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila.">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li><li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells:+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination.">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li><li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B.">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary.">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis.">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal.">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li><li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection.">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li><li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA.">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li><li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry.">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li></ol>

Der Autor erklärt keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Mutagenese ist lang verwendet, um Protein-Bindungsstellen zu charakterisieren. Erstens kann eine Reihe von Mutanten konstruiert und einzeln getestet in verbindlichen Assays, ihre Auswirkungen auf verbindliche Affinität zu analysieren. Während ein standard Mutagenese-Ansatz bietet eine Möglichkeit, mehrere Sequenzen zu analysieren, mehrere Schritte der Standardansatz, wie Mutanten Bau und Durchführung einer Reihe verbindlicher Reaktionen für jeden Mutant beteiligt, ist mühsam und zeitaufwendig und kann nicht Sättig...

Genregulation spielt eine wichtige Rolle in der Biologie. Gene reguliert werden können, auf der Ebene der Transkription, Pre-mRNA Spleißen, 3' Ende Bildung, RNA-Export, Übersetzung, mRNA Lokalisierung, Verfall, Post-translationale Modifikation/Stabilität, etc. , die beide DNA und RNA-bindende Proteine Schlüsselrollen in gen spielen Verordnung. Während Molekulare genetische Analysen zahlreiche regulatorische Proteine identifiziert haben, nur eine kleine Teilmenge davon wurden charakterisiert voll und ganz für ihre Zellfunktionen oder verbindliche Sites in Vivo. Phylogenetische Sequenzanalyse und Mutagenese bieten sich ergänzende Ansätze zur Charakterisierung von DNA oder RNA-Protein-Interaktionen.
RNA-bindende Proteine sind wichtig für Entwicklungsprozesse, einschließlich der sexuellen Differenzierung. Der Drosophila -Protein Sex-lethal (SXL) oder die Geschlecht-Hauptschalter Protein fehlt in Männchen, sondern Gegenwart bei Frauen. Es erkennt Uridin-reichen Sequenzen oder Pyrimidine-Traktate neben spezifischen Spleißstellen in nachgeschalteten Pre-mRNA-Ziele (Transformator, Sex-tödlicheund männlich-spezifische lethal2) in somatischen Zellen1,2 ,3,4. Darüber hinaus regelt es polyadenylierungsstelle Wechsel durch die Bindung an Uridin-reiche Polyadenylation Enhancer Sequenzen in die Verstärker der rudimentären (e(r)) Transkript5,6. SXL wahrscheinlich regelt zusätzliche Ziele in der weiblichen Keimbahn, die noch werden identifiziert,1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Charakterisierung von einer Bindungsstelle umfasst Mutagenese, in der Regel, z. B. durch Löschung oder Ersatz von einzelnen oder mehreren Nukleotiden. Jede mutierte Bindungsstelle gegenüber dem Wildtyp RNA-Sequenz wird dann analysiert, mit einer Reihe von proteinkonzentrationen seine Bindungsaffinität zu bestimmen (Kd oder Gleichgewicht Dissoziation Konstante) für das Protein des Interesses; K-d ist die Konzentration des Proteins erforderlich um 50 % RNA-bindende zu erhalten. Dieser arbeitsintensive Prozess detaillierte Mutagenese beinhaltet, Erzeugung und Analyse von zahlreichen Mutanten – drei Wild-Typ Nukleotiden für jede Position in die Bindungsstelle. So gibt es eine Notwendigkeit für einen alternativen Ansatz für schnellere, einfachere und preiswerte Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS.
Hier beschreiben wir einen One-Step-Ansatz, der Sättigung Mutagenese von einem Protein-Bindungsstelle in RNA ermöglicht. Es geht um doping DNA Schablone mit Wildtyp-Nukleotide in die Bindungsstelle, Synthese von separaten RNAs mit jeder Phosphorothioat Nukleotid und Isolierung von der gebundenen Anteil nach Inkubation mit Protein. Störungen durch Wildtyp-Nukleotiden führt zu ihren bevorzugten Ausschluss aus der Fraktion proteingebundener. Dies wird durch Gelelektrophorese nach selektiven chemischen Spaltung mit Jod Phosphodiester-Anleihen mit phosphorthioate (Phosphorothioat Mutagenese oder PTM) überwacht. Dieser einstufigen Sättigung Mutagenese Ansatz ist anwendbar auf die Charakterisierung der Protein-Bindungsstelle in RNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Uridine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217; a-thio triphosphate</td>
			<td>NEN (Boston, Massachusetts)</td>
			<td>NLP-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>XX1002500</td>
			<td>Millipore&#160;25&#160;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX2702552</td>
			<td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td>PROTRAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dephosphorlyation Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Plates</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis equipment</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray films</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel solutions</td>
			<td>Standard</td>
			<td>Standard</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates

Genregulation spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung. Zahlreiche DNA und RNA-bindende Proteine binden ihre Ziel-Sequenzen mit hoher Spezifität zur Genexpression kontrollieren. Diese regulatorischen Proteinen Steuern Genexpression auf der Ebene der DNA (Transkription) oder auf der Ebene der RNA (Pre-mRNA Spleißen, Polyadenylation mRNA Transport, Verfall und Übersetzung). Identifizierung von regulatorischen Sequenzen hilft zu verstehen, nicht nur wie ein Gen ein- oder ausgeschaltet ist, sondern auch welche nachgeschalteten Gene durch ein bestimmtes regulatorischen Protein reguliert werden. Hier beschreiben wir einen One-Step-Ansatz, der Sättigung Mutagenese von einem Protein-Bindungsstelle in RNA ermöglicht. Es geht um doping DNA Schablone mit Wildtyp-Nukleotide in die Bindungsstelle, Synthese von separaten RNAs mit jeder Phosphorothioat Nukleotid und Isolierung von der gebundenen Anteil nach Inkubation mit Protein. Störungen durch Wildtyp-Nukleotiden führt zu ihren bevorzugten Ausschluss aus der Fraktion proteingebundener. Dies wird durch Gelelektrophorese nach selektiven chemischen Spaltung mit Jod Phosphodiester-Anleihen mit phosphorthioate (Phosphorothioat Mutagenese oder PTM) überwacht. Dieser einstufigen Sättigung Mutagenese Ansatz ist anwendbar auf die Charakterisierung der Protein-Bindungsstelle in RNA.

Das Prinzip der Sättigung Mutagenese mit doping:
Verwenden Sie für eine entsprechende Molverhältnis von Wildtyp und andere Nukleotide eine gleiche Mischung von allen vier Nukleotide, wenn nur eine Position soll analysiert werden. Jedoch, wenn mehrere Positionen gleichzeitig analysiert werden, das Verhältnis zwischen wilden Typ Wildtyp Nukleotide muss angepasst werden, d. h. reduziert. Ansonsten neben einzelnen Ersetzun...

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A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Proteine, die bestimmte RNA-Sequenzen binden spielen wichtige Rollen in der Genexpression. Ausführliche Charakterisierung von diese Bindungsstellen ist entscheidend für unser Verständnis der Genregulation. Hier wird ein Einzelschritt-Ansatz für Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS beschrieben. Dieser Ansatz ist relevant für alle Protein-Bindungsstellen in der RNS.

Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

6.5K Aufrufe.  University of Colorado at Boulder. Proteine, die bestimmte RNA-Sequenzen binden spielen wichtige Rollen in der Genexpression. Ausführliche Charakterisierung von diese Bindungsstellen ist entscheidend für unser Verständnis der Genregulation. Hier wird ein Einzelschritt-Ansatz für Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS beschrieben. Dieser Ansatz ist relevant für alle Protein-Bindungsstellen in der RNS.

Serie: A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Forschung

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV integration sites can be used as functional markers of active regulatory elements. Here, we present a retroviral scanning tool, which allows the genome-wide identification of cell-specific enhancers and promoters. Briefly, the target cell population is transduced with an mLV-derived vector and genomic DNA is digested with a frequently cutting restriction enzyme. After ligation of genomic fragments with a compatible DNA linker, linker-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) allows the amplification of the virus-host genome junctions. Massive sequencing of the amplicons is used to define the mLV integration profile genome-wide. Finally, clusters of recurrent integrations are defined to identify cell-specific regulatory regions, responsible for the activation of cell-type specific transcriptional programs.
The retroviral scanning tool allows the genome-wide identification of cell-specific promoters and enhancers in prospectively isolated target cell populations. Notably, retroviral scanning represents an instrumental technique for the retrospective identification of rare populations (e.g. somatic stem cells) that lack robust markers for prospective isolation.

Here, we describe a protocol for genome-wide mapping of the integration sites of Moloney murine leukemia virus-based retroviral vectors in human cells.

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...