Diese Arbeit wurde von der Pflanze Genome Research Program von der National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388) unterstützt.

1. Wachstum der Pflanzen
<ol><li>Säen von 5-10 Soja (Williams 82) in einem 13 cm-Topf im Gewächshaus unter Bedingungen der langen Tage (16 h Licht bei 1.500 µmol m-2 s-1) bei 25 ° C auf die benutzerdefinierte Erdmischung für Soja (1:1:1 Verhältnis von Erde, Perlite und Torpedo Sand).</li>
</ol>2. Vorbereitung von Plasmid DNA
<ol><li>Mit einem sterilen Pipettenspitze oder Zahnstocher, wählen Sie eine einzelne Kolonie oder gefrorenen Glycerin Lager von E. Coli tragen das Plasmid enthält das gen des Interesses und in 20 mL Luria-Bertani (LB) flüssigen Medium mit geeigneten Antibiotika in ein 50 mL Fläschchen zu impfen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C über Nacht in einen Shaker geben. Sammeln Sie die Bakterien, indem die Federung bei 12.000 x g bei Raumtemperatur für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verworfen. Extrahieren Sie und zu reinigen Sie das Plasmid des Herstellers Verfahren ein Plasmid Prep Kit.</li>
</ol>(3) Protoplasten Isolierung
<ol><li>Schneiden Sie neu erweiterten unifoliate Blätter von 10 - Tage alten Sojabohnen Keimlinge (Abbildung 1). Hinweis: Auswahl von Blättern in einer entsprechenden Entwicklungsstadium ist der Schlüssel zum Erfolg für Sojabohnen Protoplasten Vorbereitung. Verwenden Sie nur gerade erweitert Blätter in frühen Entwicklungsstadien. Als ältere Blätter werden Zellwände schwieriger um zu verdauen.</li>
	<li>Mit einer frischen Rasierklinge entfernen der Mittelrippe aus der unifoliate Blatt und dann schneiden Sie die Reste in 0,5-1 mm Streifen. Hinweis: Zwei unifoliate Blätter in 10 mL Enzymlösung verdaut geben ausreichende Protoplasten für mehr als 10 Transformationen.</li>
	<li>Das Blatt Streifen mit einer Zange, Transfer sofort und sanft in 10 mL frisch zubereitete Enzymlösung (Tabelle 1) in der 15 mL Tube. Vakuum Infiltrat Streifen das Blatt für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Blatt-Streifen in der Enzymlösung mit sanften Agitation (40 u/min) unter schlechten Lichtverhältnissen für 4-6 h bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass das Enzymlösung Gelb-Grün dreht, da Protoplasten veröffentlicht werden. Überprüfen Sie die Enzym/Protoplasten Lösung unter dem Mikroskop (X10). Hinweis: Die veröffentlichten Protoplasten sind kugelförmige geprägt, während die unverdauten Zellen unregelmäßig oder ovale Form haben.</li>
	<li>Übertragen Sie die 10 mL der Lösung Enzym/Protoplasten in einem 50 mL-Tube vorsichtig gießen und 10 mL W5 Lösung (Tabelle 1) bei Raumtemperatur, die Verdauung zu stoppen. Invertieren Sie das Rohr sanft ein paar Mal. Füllen Sie vorsichtig die Enzym/Protoplasten Lösung auf eine saubere 75 µm-Nylon-Mesh platziert eine 50 mL-Tube, unverdaute Blatt Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie durchströmten Enzym/Protoplasten Lösung bei 100 X g in der 50 mL Tube für 1-2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer serologischen 10 mL-Pipette ohne störende Protoplasten Pellet.</li>
	<li>Die Protoplasten Aufschwemmen und zu einer Konzentration von 2 x 105 mL-1 in gekühlten W5-Lösung bei 4 ° C von Protoplasten zählen auf eine Hemacytometer unter dem Mikroskop (x10) verdünnen. Halten Sie die Protoplasten für 30 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Suspension 100 X g für 1-2 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig die W5-Lösung mit einer 1-mL-Pipette ohne störende Protoplasten Pellet. Aufschwemmen der Protoplasten in MMG Lösung (Tabelle 1) in einer Konzentration von 2 x 105 mL-1 bei Raumtemperatur.</li>
</ol>4. Protoplasten transformation
<ol><li>Machen Sie 100 µL-Aliquots von Protoplasten (2 x 104 Protoplasten bei 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL geringe Haftung Mikrozentrifugenröhrchen mit unbeschnittenen 200 µL Pipettenspitzen. Setzen Sie eine aliquote beiseite, um als negative Kontrolle dienen. Fügen Sie 10 µL Plasmid (10-20 µg) in jede der übrigen aliquoten von Protoplasten.</li>
	<li>Fügen Sie langsam 110 µL frisch zubereitete PEG-Lösung (Tabelle 1 hinzu) an der Innenwand der 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, und dann invertieren Sie sanft zu und drehen Sie das Rohr, bis die Lösung homogen wird.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Verwandlung-Mischung bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>Um die Transformation zu stoppen, der 1,5 mL Tube bei Raumtemperatur langsam 400 µL W5-Lösung hinzu und invertieren Sie das Rohr sanft zu, bis die Lösung homogen wird. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 g für 1-2 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette zu.</li>
	<li>Das Rohr 1 mL WI-Lösung (Tabelle 1) hinzu und Aufschwemmen von 1-bis 2-mal sanft pipettieren. Fügen Sie 1 mL 5 % (Vol/Vol) sterile Kälberserum in jede Vertiefung einer Gewebekultur 6-Well-Platte Beschichten der Oberfläche zu verhindern, dass die Protoplasten festhalten an der Platte.</li>
	<li>Verwerfen Sie nach ein paar Sekunden die Kälberserum mit einer Pipette. Die resuspendierte Protoplasten in einen Brunnen der Kultur-Platte zu übertragen. Die Platte mit einem Deckel abdecken.</li>
</ol>5. Protoplasten Inkubation und Ernte
<ol><li>1-2 Tage im Dunkeln inkubieren Sie die Protoplasten bei Raumtemperatur. Hinweis: Wir fanden, dass zwei Tagen Inkubation stärkeren fluoreszierendes Protein-Signal in der Regel im Vergleich zu einem eintägigen Inkubation ergibt und das fluoreszierende Protein-Signal für bis zu 3-4 Tage dauern kann.</li>
	<li>Übertragen Sie die Protoplasten-Lösung auf einem 1,5 mL geringe Haftung Microcentrifuge Schlauch. Zentrifugieren Sie das Rohr 100 X g für 1-2 min bei Raumtemperatur Protoplasten zu ernten. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und übertragen Sie 10 µL Protoplasten auf einen Objektträger.</li>
	<li>Fluoreszenzsignal unter Fluoreszenz oder der konfokalen Mikroskopie zu beobachten. Verwenden Sie nicht-transformierten Protoplasten als Negativkontrolle (kein Signal sollte eingehalten werden).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+hybridisation+of+plants+by+fusion+of+protoplasts.">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li><li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+white+clover:+callus,+suspension,+protoplast+culture,+and+plant+regeneration.">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll für die Isolierung von Soja Protoplasten und die Anwendung auf transiente Expression Studien wurde gründlich getestet und funktioniert sehr gut in unserem Labor. Die Verfahren sind einfach und leicht und erfordern ordentliche Ausrüstung und minimalen Kosten. Unser Protokoll liefert große Mengen an gleichbleibende hohe Qualität Protoplasten im Vergleich zu bereits gemeldeten Methoden34,35,36,37,38. Aber da gibt es viele Faktoren, die Protoplasten Erträge und Transformation Preise beeinflussen, wird es dringend empfohlen für Forscher, die Bedingungen, nach experimentellen Bedingungen, wünschenswerte Ergebnisse und verwendeten Materialien zu optimieren. Während dieses System äußerst nützlich für die Untersuchung der unmittelbaren Regulierungs- und biochemische Ereignisse in pflanzlichen Zellen ist, eignet sie sich nicht für die Beobachtung der langfristigen zelluläre Prozesse und Ereignisse, die im Gewebe oder organismal Ebenen auftreten.
Wir fanden, dass die Auswahl der kräftig wachsenden pflanzlichen Rohstoffen in eine ideale Entwicklungsstadium der entscheidende Faktor bei der Sojabohne Protoplasten Vorbereitung war. Es bestimmt nicht nur die Erträge des Protoplasten, sondern Qualität, die die anschließende DNA-Transformation betrifft. Es ist wichtig, immer Sojapflanzen in eine konstante Umwelt Weg von jeglichem Stress, wie z. B. Dürre, Überschwemmungen, extreme Temperaturen oder Schädlinge wachsen. Die höchste Effizienz der Protoplasten Ertrag und Transformation kann nur erweiterte unifoliate Blätter von Jungpflanzen mit erreicht werden. Für Anfänger wird es vorgeschlagen, unifoliate Blätter in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und machen einen Vergleich die besten Ergebnisse zu erzielen.
Protoplasten/DNA-Verhältnis ist ein wichtiger Faktor für optimale Transformationseffizienz. Es ist in der Regel am besten zunächst das Verhältnis von 2 x 104 Protoplasten/10-20 µg DNA, aber Optimierung des für einzelne Konstrukte25empfohlen wird. Der Einsatz von hochwertigen DNA erhalten durch ein DNA-Reinigung-Kit wird dringend empfohlen.
Bei der Wahl der Vektoren für transiente Expression in Protoplasten sind hohe Kopienzahl und kleine Vektoren im Allgemeinen bevorzugt. Obwohl binäre für Agrobacterium Tumefaciens Vektoren-vermittelten Transformation von Pflanzen für die Protoplasten Transformation verwendet werden, die Größe dieser Vektoren kann weniger optimale Transformationseffizienz führen. Für GLP-Fusion-Protein-Expression verwenden wir in der Regel Vektoren, die kein Selektionsmarker für Pflanzen und sind somit relativ klein (ca. 6-7 kb), wie p2GWF7 und p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be) besitzen.
Mehreren Vektoren können verwendet werden, um Protoplasten gleichzeitig zu verwandeln. Wir hatten Erfolg BiFC Vektoren für die Prüfung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, sowie mehrere fluoreszierende Proteine für Organellen und subzelluläre Beschriftung in Soja Protoplasten zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus bietet Einfachheit und große Erträge unserer Methode ein ideales System zur Prüfung von Regulierungs- und biochemischen Ereignisse, gen-targeting Vektor-Design, Isolierung der Transient exprimierten Proteinen und Protein-komplex und Reinigung des spezifischen Organellen wie Kerne, weitere Anwendungen auf Schwellen-Genomik und Proteomik nähert.

Protoplasten sind Pflanzenzellen, die Zellwände entfernt haben. Sie pflegen die meisten Funktionen und Aktivitäten von Pflanzenzellen, Protoplasten sind ein gutes Modellsystem zur Beobachtung und Auswertung der vielfältigen zelluläre Ereignisse, und wertvolle Tools für die somatische Hybridisierung1 zu studieren und Werk Regeneration2. Protoplasten wurden für Werk Verwandlung3,4,5, ebenfalls weit verbreitet genutzt, da Zellwände sonst den Durchgang von DNA in die Zelle blockieren würde. Protoplasten besitzen einige der physiologischen Reaktionen und zelluläre Prozesse der intakten Pflanzen, daher bietet Grundwert in der Grundlagenforschung, Protein subzelluläre Lokalisation6,7,8zu studieren, Protein-Protein Interaktionen9,10und Promotor-Aktivität11,12,13 in Leben Zellen.
Die Isolation der Pflanze Protoplasten wurde erstmals 196014 gemeldet und die Protokolle für Isolation und Transformation von Protoplasten entwickelt und optimiert wurden. Ein Standardverfahren der Protoplasten Isolation beinhaltet das Schneiden der Blätter und enzymatische Verdauung der Zellwände, gefolgt von Trennung von freigegebenen Protoplasten von Gewebe nicht verdaut Schutt. Transformationsstrategien umfasst Elektroporation15,16, Mikroinjektion17,18und Polyethylenglykol (PEG)4,5,19 Methoden. Eine Vielzahl von Arten gemeldet wurden erfolgreich für die Protoplasten Isolierung, einschließlich Zitrusfrüchte20, Brassica21, Solanaceae22 und anderen Zierpflanzen Familien23,24. Während verschiedene Gewebetypen in verschiedenen Arten verwendet werden, wurde ein System von transienten Expression in Arabidopsis Mesophyll Protoplasten (TEAMP) aus den Blättern der Modellpflanze Arabidopsis Thaliana isoliert gut etablierte25 und weit verbreiteten für vielfältige Anwendungen.
Sojabohne (Glycine max (L.) GESEG.) gehört zu den wichtigsten Protein und Öl Nutzpflanzen26. Im Gegensatz zu Arabidopsis und Reis transgene Sojapflanzen zu erhalten gilt eher schwierig und geringe Effizienz. Agrobacterium Tumefaciens-vermittelten Infiltration ist im Volksmund für transiente Genexpressionsstudien in der Epidermiszellen in Tabak27 und Sämlinge in Arabidopsis28,29, verwendet worden, während Transformation von behaarten Wurzeln in Soja30 Agrobacterium Rhizogenes bestritten. Virusbedingte Gen-Silencing-Ansätze wurden für Herabregulation von Ziel Gene31,32 und transiente Expression33 in einer systematischen Art und Weise genutzt. Protoplasten bieten eine wertvolle und vielseitige Alternative zu diesen Ansätzen. Protoplasten können Soja die oberirdische Materialien entnommen werden und ermöglichen schnelle und synchronisierte Transgene Ausdruck. Jedoch, seit die erste erfolgreiche Isolierung der Sojabohne Protoplasten in 198334gab es nur Berichte über die Anwendung von Protoplasten in Soja35,36,37, 38, in erster Linie aufgrund der relativ niedrigen Erträgen von Soja Protoplasten.
Hier beschreiben wir eine einfache und effiziente Protokoll für die Isolierung von Soja Protoplasten und seinen Antrag auf vorübergehende Genexpressionsstudien. Junge unifoliate Blätter aus Soja-Keimlingen konnten wir große Mengen an lebenswichtigen Protoplasten innerhalb weniger Stunden zu erhalten. Darüber hinaus haben wir einen PEG-Kalzium-vermittelten Transformationsmethode optimiert, die einfache und kostengünstige, DNA in Soja Protoplasten mit hohem Wirkungsgrad zu liefern ist.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASE &quot;ONOZUKA&quot; R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plates</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA plasmid miniprep kit</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Ingram&#039;s Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox (Powder)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for isolation of soybean protoplasts and application to transient gene expression analyses

Sojabohne (Glycine max (L.) GESEG.) ist eine wichtige Kulturarten und eine Hülsenfrucht-Modell für das Studium der genetischen und biochemischen Wege geworden. Daher ist es wichtig, eine effiziente transiente gen Expressionssystems in Soja zu etablieren. Hier berichten wir ein einfaches Protokoll für die Vorbereitung der Sojabohne Protoplasten und seinen Antrag auf vorübergehende Funktionsanalysen. Wir fanden, dass große Mengen an hochwertigen Protoplasten jungen unifoliate Blätter aus Soja-Keimlingen führte. Durch die Optimierung der PEG-Kalzium-vermittelten Transformationsmethode, erreichten wir hohe Transformationseffizienz mit Soja unifoliate Protoplasten. Dieses System bietet ein effiziente und vielseitige Modell für die Prüfung von komplexen regulatorischen und Signalisierung Mechanismen im live Soja Zellen und können helfen besser zu verstehen, diverse zelluläre, Entwicklungsstörungen und physiologische Prozessen von Leguminosen.

Verschiedene Organe des 10 - Tage alten Sojabohnen für Vorbereitung der Protoplasten (Abbildung 1) getestet wurden und Erträge beobachtet, unter dem Mikroskop (Abbildung 2). Zellwände aus Keimachse und Epicotyl waren kaum verdaut, und einige Zellen geblieben (Abbildung 2 b, 2 C) miteinander verbunden. Im Keimblatt (Abb. 2D) und Wurzel (Abbildung 2A) wurden die Zellwände nur in einem kleinen Teil der Zellen entfernt. Im Gegensatz dazu eine große Anzahl von Protoplasten beobachtet wurden, als unifoliate war (Abbildung 2E-G) verwendet. Unifoliate Blätter in unterschiedlichen Entwicklungsstadien wurden weiter untersucht (Abb. 2 H). Während die unexpanded und nur erweiterte unifoliate Blätter in hohe Erträge von Protoplasten geführt, die Größe des Protoplasten von nur erweiterte unifoliate waren mehr Uniform (Abb. 2F) als unausgebreiteten unifoliate (Abb. 2E). Für den voll entfalteten waren unifoliate, die Zellwände noch intakt in den meisten Zellen (Abbildung 2). Wir testeten Zellwand-Verdauung Enzyme von drei verschiedenen Herstellern und vergleichbare Ergebnisse erhalten, wie oben beschrieben. Aufgrund dieser Beobachtungen, schlossen wir, dass Auswahl von Pflanzenmaterial ausschlaggebend war und nur erweiterte unifoliate Blätter von jungen Sojabohnen Keimlinge das beste Material für Protoplasten Vorbereitung waren.
Eine Reihe von unterschiedlichen Mengen von Plasmid DNA (0,1 µg, 1 µg, 5 µg und 20 µg) wurde für optimale Transformationseffizienz von Soja unifoliate Protoplasten (Abb. 3A-D) getestet. 20 µg Plasmid DNA zeigte die höchste Transformationseffizienz mit mehr als 50 % Transformationsrate (Abbildung 3D), während die niedrigste 0,1 µg zeigte (weniger als 1 %) (Abb. 3A). Wir erhalten vergleichbare Transformationseffizienz mit verschiedenen DNA-Reinigung-Kits von drei Herstellern. Dieses Ergebnis legt nahe, dass größere Mengen von Plasmid DNA erheblich dazu beitragen würde, um die Transformationseffizienz zu erhöhen.
Abbildung 4 ist konfokale Bilder von Soja Protoplasten verwandelt mit Konstrukt p2GWF7-E1, die GFP verschmolzen mit der Hülsenfrucht-spezifische gen E1 (Glyma.06G207800), angetrieben von der CaMV 35 s -Promoter in den Vektor p2GWF7 ausdrückt 39. E1-GFP Fusionsprotein zeigt nuklearen Lokalisierung in Soja Protoplasten, die steht im Einklang mit einer früheren Studie mit Arabidopsis Protoplasten System40. Angesichts der Tatsache, dass E1 eine Hülsenfrucht-spezifische gen ist, bietet unser Ergebnis mit dem Soja Protoplasten System einen schlüssigen Einblick in die subzelluläre Lokalisation des E1-Protein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig1.jpg"> Abbildung 1: Darstellung, die die Organe eines Keimlings Sojabohnen, die getestet werden Protoplasten Vorbereitung in dieser Studie, einschließlich der Wurzel, Keimachse, Samenlappen, Epicotyl und unifoliate. Nach ein paar unifoliate Blätter entwickeln Sojabohnen Keimlinge zählig Blätter. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57258/57258fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig2.jpg"> Abbildung 2: Protoplasten Zellen aus verschiedenen Organen und Entwicklungsstadien der Sojabohnen Keimlinge vorbereitet. (A-D) Zellen aus verschiedenen Organen der 10 - Tage alten Sojabohnen Keimlinge vorbereitet: root (A), Keimachse (B), Epicotyl (C), Samenlappen (D). (E-G) Protoplasten Zellen aus unifoliate Blätter in unterschiedlichen Entwicklungsstadien vorbereitet: unexpanded (E), nur (F) erweitert und vollständig erweitert (G) unifoliate, entspricht die Sojabohnen Keimlinge in (H) links, Mitte und rechts, beziehungsweise. Der Maßstab ist 25 µm (A-G) oder 25 mm (H). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57258/57258fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig3.jpg"> Abbildung 3. Konfokale Bilder zeigen Transformationseffizienz Sojabohnen unifoliate Protoplasten mit unterschiedlichen Mengen von Plasmid DNA. Bilder der GLP (grün dargestellt) und hellen Bereich (grau) zusammengeführt werden. Protoplasten verwandelten sich mit unterschiedlichen Mengen des Plasmids p2GWF7-E1: 0,1 µg (A), 1 µg (B), 5 µg (C) und 20 µg (D). Fluoreszenzsignal des GFP wurde 24 Stunden nach der Transformation unter Mikroskopie überwacht. Der schwarze Maßstabsbalken ist 50 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57258/57258fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig4.jpg"> Abbildung 4. Konfokale Bilder zeigen die subzelluläre Lokalisation der E1-GLP im Nucleus Soja unifoliate Protoplasten. Das Plasmid p2GWF7-E1 wurde für die Transformation verwendet. Bilder der GLP (grün dargestellt) und hellen Bereich (grau) werden zusammengeführt. Fluoreszenzsignal des GFP wurde 24 Stunden nach der Transformation überwacht. Der schwarze Maßstabsbalken ist 5 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57258/57258fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Enzymlösung (frisch zubereitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5,7</td>
			<td>20mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellulasen CELF</td>
			<td>2 % (w/V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pectolyase Y-23</td>
			<td>0,1 % (w/V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannit</td>
			<td>0,75 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 % (w/V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DVB-T</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">W5-Lösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>154 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>125 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5,7</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">MMg-Lösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5,7</td>
			<td>4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannit</td>
			<td>400 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>15 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">PEG-Lösung (frisch zubereitet)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEG4000</td>
			<td>20 % (w/V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannit</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">WI-Lösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5,7</td>
			<td>4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannit</td>
			<td>0,5 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Lösungen für Sojabohnen Protoplasten Isolierung und Transformation verwendet.

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A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Wir entwickelten ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung großer Mengen von Soja Protoplasten, komplexe regulatorische und Signalisierung Mechanismen in lebenden Zellen zu studieren.

Eine einfache Methode zur Isolierung der Sojabohne Protoplasten und Anwendung auf vorübergehende Genexpressionsanalysen

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K Aufrufe.  California State University, Northridge. Wir entwickelten ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung großer Mengen von Soja Protoplasten, komplexe regulatorische und Signalisierung Mechanismen in lebenden Zellen zu studieren.

Serie: A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Umwelt

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biologie

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Immunologie und Infektion

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Hocheffiziente Produktion von transgenen Sojabohnen-Haarwurzeln

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

Autor im Rampenlicht: Sojabohnen-Haarwurzeltransformation für die Analyse der Genfunktion  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Eine einfache Methode zur Isolierung der Sojabohne Protoplasten und Anwendung auf vorübergehende Genexpressionsanalysen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus

Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion

Sojabohnen-Haarwurzeltransformation zur Analyse der Genfunktion