Für den Mangel an Raum meist Review-Artikel haben wir angeführt, und wir entschuldigen uns bei unseren Kollegen, deren ursprüngliche Arbeit nicht zitiert wurde. Die Arbeit im Labor V.C. wird unterstützt durch Zuschüsse aus NIH, NSF, USDA/NIFA, BARDEN und BSF, V.C. und das S.G.L. Labor wird unterstützt von NIH und Fonds aus den Abteilungen der Pflanzenpathologie und Pflanze-Mikroben Biologie, S.G.L.

(1) Pflanzenmaterial
<ol><li>Wahl der Pflanzenarten</li>
	<li>Verwenden Sie die Pflanzenarten heimisch in das Protein von Interesse, d. h., die dieses Protein für körpereigene Proteine kodiert oder der natürliche Wirt für den Erreger für virale Proteine darstellt. Darüber hinaus müssen die ausgewählten Pflanzenarten der gewählten Methode der Transienten genetische Transformation zugänglich sein. Hinweis: Die Studien beschäftigen routinemäßig Nicotiana Benthamiana, die einen guten Gastgeber für TMV darstellt und effizient durch die gentechnische Transformation mit Agrobakterien-vermittelten Technik, d. h., Agroinfiltration umgewandelt (siehe Schritt 3). N. Benthamiana Pflanzen auch leicht angebaut und haben große Blätter, die leicht durch Agrobacterium geimpft sind und leicht durch konfokale Mikroskopie analysiert.</li>
	<li>
Pflanzenwachstum
	<ol>
<li>Pflanzensamen Sie N. Benthamiana in feuchter Erde in hoher Dichte. Halten sie in einer kontrollierten Umgebung Kammer bei 20-25 ° c unter 16 h Licht bei ~ 75 µmol Photonen m-2 s-1 und 8 Stunden der Dunkelheit. Nachdem der Durchmesser des Euphyll 0,5 cm erreicht hat, sorgfältig übertragen Sie die Keimlinge in größere Töpfe und fortzusetzen Sie Wachstum in der gleichen Kammer unter den gleichen Bedingungen.</li>
		<li>Pflegen Sie die Pflanzen, bis sie auf 4-8-Blatt-Stadium innerhalb von 4 Wochen wachsen als die größten Blätter 4-6 cm Durchmesser sind; zu diesem Zeitpunkt können sie für Agroinfiltration verwendet werden (siehe Schritt 3). Hinweis: Verwenden Sie wichtig ist, niemals die Pflanzen wenn sie begann zu blühen, da in diesem Entwicklungsstadium die Blatt-Architektur oft24,25, manchmal führt zu inkonsistenten Ergebnissen variiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Ausdruck Vektor Bau
<ol><li>
Wahl des Expressionssystems
	<ol>
<li>Wählen Sie den Ausdruck System, d. h., Vektoren und Vektor Versandweg, bestens geeignet für Expression des Proteins des Interesses an der Pflanzenarten untersucht. Hinweis: Gelegentlich solche spezifischen Kombinationen der getestete Protein/Pflanzenarten können erfordern spezifische Vektoren und Vektor-Übermittlungsmethode für optimale Expression und Funktion des Proteins des Interesses. Wählen Sie für die meisten zweikeimblättrige Pflanzen jedoch binäre Plasmide als Expressionsvektoren und Agroinfiltration als Delivery-System.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tagging-fluoreszierende Protein
	<ol>
<li>Eindringmittel tag jedes exprimierten Protein für die Analyse von seine subzelluläre Verteilung22, einschließlich Pd Lokalisierung. Hinweis: Verwenden Sie Autofluorescent Proteine, wie GFP und DsRed2, als Tags. Tag der getesteten Proteins mit GFP und coexpress es mit einer kostenlosen DsRed2. GFP-Funktionen als Tag sowie ein Virus-unabhängige Ladung-Molekül. DsRed2 Funktionen Gesamteffizienz des Transienten Expression zu kalibrieren und, weil es Handy-autonomen, zu identifizieren, die zunächst transformierte Zelle; Diese letztere Funktion ist wichtig, bei der Beurteilung von Zelle zu Zelle Bewegung möglicherweise nicht-Zelle-autonomen getesteten Proteine. Für Coexpression mit dem Pd-Marker PDCB1, die auch Zelle autonom ist, tag der getesteten Proteins mit GFP und PDCB1 mit DsRed2.</li>
		<li>Als Faustregel gilt Sicherung der Autofluorescent Tag an den Carboxylgruppen-Terminus des Proteins ausgedrückt. Aber wenn die tagged in voller Länge getestete Protein Exponate Pd targeting gefährdet, übertragen Sie das Tag an den amino-Terminus des Proteins.</li>
		<li>Klonen Sie die kodierenden Sequenzen der Proteine in einer geeigneten Anlage Expressionsvektor getestet werden. Hinweis: Es gibt viele verschiedene Pflanzenarten Expressionsvektoren, die fluoreszierende tagging ermöglichen. Wir verwenden eine Reihe von pSAT Plasmide26 oder einige ihrer Derivate27,,28, die eignen sich für das Klonen von der Reihenfolge des Interesses direkt im Rahmen mit den vorgeschlagenen Autofluorescent Tags (siehe Schritt 2.2.1) in beiden amino- und Carboxylgruppen-Terminal Orientierungen.</li>
		<li>Übertragen Sie jedes Expressionskassette in einer binären Vektor Agrobacterium. Hinweis: Obwohl pSAT basierende Konstrukte sind geeignet für direkte biolistischen Lieferung ins Pflanzengewebe, Agroinfiltration, nämlich die Transformationsmethode empfohlen hier (siehe Schritt 3), verlangt, dass die Expressionskassette liegen zwischen der T-DNA soll Grenzen einer Binärdatei Vektor-29. Hinweis: Alle pSAT Vektoren sind entworfen, um solche Versetzung auf die pPZP-RCS2 multigene Ausdruck binären Vektor26,30 durch einen einstufigen Klonen mit seltenen schneiden Nukleasen AscI-PpoI, -SceI, ich-CeuI, PI-PspI und PI-TliI 26. Forscher, die lieber recombinatorial Klonen, nutzen z.B.mit heterologen Lox Seiten31, pSAT Vektor Varianten26,27beschäftigen können.</li>
		<li>Für Coexpression, beiden Expressionskassetten zu übertragen, z.B., getestete Protein GFP und DsRed2 oder getestete Protein GFP und PDCB1-DsRed2 (siehe Schritt 2.1), auf den gleichen pPZP-RCS2 binären Vektor. Hinweis: Alternativ Agrobacterium Kulturen beherbergen einzelne binären Konstrukte können gemischt werden für Infiltration in N. Benthamiana (siehe Schritt 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Agroinfiltration
<ol><li>
Fügen Sie 1 µg der ein pPZP-RCS2-basierte Plasmid aus Schritt 2.2.5 bis 100 µL Kultur zuständigen Zellen des Agrobacterium Tumefaciens Stamm EHA105 oder GV3101 als beschrieben32vorbereitet, Inkubation für 30 min auf Eis, Schockfrosten in flüssigem Stickstoff für 1 min, und bei 28 ° C für 15 min inkubieren.
	<ol>
<li>Dann fügen Sie 1 mL LB-Medium (10 g/L Tryptone, Hefeextrakt 5 g/L und 10 g/L NaCl) auf die zuständigen Zelle Mischung und bei 28 ° C für 2 h Spin die Zellen bei 3.000 × g für 1 min inkubieren, wieder auszusetzen in 0,2 mL LB , und sie auf LB-Agar mit geeigneten Antibiotika (z.B.100 mg/L Spectinomycin und 50 mg/L Rifampicin für pPZP-RSC2-basierte Vektoren26,30) ergänzt. Wachsen Sie bei 28 ° C für 48 h, bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie und mehrere einzelne Kolonien auf eine frische LB-Agar-Platte-Platte (siehe Schritt 3.1), wachsen bei 28 ° C für 48 h, und nehmen Sie eine kleine Menge von Bakterien für die Analyse von Kolonie-PCR-33 um das Vorhandensein der spezifischen binären Konstrukte bestätigen.</li>
	<li>
Wachsen Sie jede Agrobacterium Kolonie mit dem Konstrukt von Interesse über Nacht bei 28 ° C in 5 mL LB-Medium mit geeigneten Antibiotika (siehe Punkt 3.1.1) ergänzt. Die Zellen bei 3.000 × g zentrifugiert, und wieder auszusetzen, OD600= 0,5 im Agroinfiltration-Puffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 150 µM Acetosyringone). 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
	<ol>
<li>Wenn Sie eine Mischung aus binären Plasmide, anstatt einer einzigen multigene Ausdruck Plasmid für Protein Coexpression verwenden, mischen Sie die entsprechenden Zellkulturen im Verhältnis 1:1 V/V vor Eindringen. Inkubieren Sie dann die Zellen bei 28 ° C für 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laden Sie das Inokulum in eine 1 mL Kunststoffspritze und drücken Sie die Düse der Spritze (ohne Nadel) gegen die untere (abaxial) Epidermis der vollreifen N. Benthamiana verlässt. Halten Sie das Blatt mit einem behandschuhten Finger auf die adaxial Gesicht34,35.
	<ol>
<li>Die Agrobacterium Infiltration Medium durch langsame Injektion einzuführen. Statistische Signifikanz sind mehrere Blätter auf jede Pflanze zu infiltrieren. Hinweis: Beachten Sie, dass die ältesten Blätter nicht verwendet werden, da sie konsequent Ausdruck Niveaus nicht nachgeben.</li>
		<li>Alle Blätter in Situzu impfen. Pflegen Sie die infiltrierte Pflanze bis Beobachtung, wie in Schritt 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. der konfokalen Mikroskopie
<ol><li>Verwenden Sie eine Klinge, um jedes Blatt in Fragmente zwischen den Adern geschnitten 24-48 h nach der Infiltration (abhängig von der Effizienz der Transienten Expression des getesteten spezifischen Proteins); die Größe der einzelnen Segmente Gewebe sollte so sein, dass die Scheibe durch das Deckglas (22 x 40 mm) für die Mikroskopie verwendet vollständig bedeckt ist.</li>
	<li>Ort, an dem die Blatt-Scheiben auf das Objekt mit der abaxial Blattoberfläche nach oben schieben geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Blatt-Scheibe und mit dem Deckglas abdecken. Das Deckglas mit kleinen Klebestreifen auf jeder Seite zu immobilisieren.</li>
	<li>
Beobachten Sie das Agroinfiltrated Gewebe unter einem Laser-scanning-confocal Mikroskop und zeichnen Sie die daraus resultierenden Bilder.
	<ol>
<li>Zuerst verwenden Sie ein 10 X-Objektiv, um Zellen mit dem Signal zu identifizieren, und verwenden Sie dann 63 X Objektiv für genauere Beobachtungen.</li>
		<li>Verwendung der 458 nm Wellenlänge aus eine Argon-Ionen-Laser GFP und 543 begeistern nm DsRed2 begeistern. Behalten Sie alle Einstellungen für die Bildaufnahme, d. h., Laserintensität und Photomultiplier Röhre (PMT) Einstellungen zwischen Experimente. Im Durchschnitt 100-120 Zellen für jede experimentelle Bedingung zu prüfen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Identifizierung der PLS
<ol><li>Die Lokalisierung des getesteten Proteins mit confocal Mikroskop (Abschnitt 4) zu diagnostizieren. Überprüfen Sie, ob das getestete Protein die charakteristische peripheren punktförmige Muster25,36,37,38,39,40,41 hat und colocalizes mit dem Pd-Marker PDCB123. Dies bedeutet, dass das getestete Protein am ehesten PLS Sequenzen enthält.</li>
	<li>Nach Bestätigung der PLS Tätigkeit der getesteten Protein, schrittweise seine offenen Leserahmen (ORF) (Genbank Zbl-Nummer BAF93925.1) in kleinere Fragmente, Autofluorescently, (z. B.GFP) unterteilen beschriften Sie jeden von ihnen und analysieren ihre subzelluläre Lokalisation wie in Schritt 4 beschrieben. Zunächst empfiehlt sich die Größe von 100 Aminosäurereste für jedes Fragment unterteilt.</li>
	<li>Weiter unterteilen die abgeschnittenen Fragmente, die haben die PLS-Aktivität und überprüfen Sie ihre subzelluläre Lokalisation, wie unter Schritt 4 bis zu den kleinsten Fragment, die noch auf Pd lokalisiert, d.h. ist ausreichend, um den Autofluorescent Tag Fracht transportieren für Pd identifiziert. Dieses Fragment ist vermutlich die PLS-Sequenz darstellen.</li>
	<li>Löschen Sie der vermeintlichen PLS vom Full-length getestete Protein, d.h. Sicherung den restlichen Teil des Proteins Test ohne vermeintliche PLS Autofluorescent Tag, und bestimmen Sie die subzelluläre Lokalisation des daraus resultierenden mutierten Proteins zu, wie in Schritt beschrieben (4) Unterlässt diese mutierten Proteins, die vermeintliche PLS fehlt, Pd zu lokalisieren, wird dies bedeuten, dass die identifizierten PLS nicht nur ausreichend (siehe Schritt 5.3), aber auch für den Pd-Transport des getesteten Proteins notwendig ist.</li>
	<li>Agroinfiltrate bauen die Blätter mit einer Mischung aus Agrobacterium Kulturen beherbergen den Ausdruck für die GFP-Tags PLS und kostenlose DsRed2 (siehe Schritt 3.3). Infiltrierten Gewebe mit Objektiv 10 x mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 4.3 confocal Mikroskop zu beobachten.</li>
	<li>Zellen, die GFP und DsRed2 Signale als anfangs infiltrierten Zellen enthalten, und Gäste der benachbarten Zellen, die nur das GFP-Signal als diejenigen enthalten diese Ausstellung Bewegung der Gäste. Hinweis: Dieser Schritt prüft der identifizierten PLS für seine potentielle Bewegungsfähigkeit der Zelle zu Zelle; und zwar deshalb, weil viele Proteine, die auf Pd (darunter die meisten Pflanzen virale MPs) auch durch Pd zu den benachbarten Zellen zu bewegen. Die Konzentration von Agrobacterium verwendet für Infiltration hängt der Ausdruck Effizienz unterschiedlicher Strukturen bzw.. Agroinfiltration stellen Sie sicher, die Zelle-Kultur-Verdünnung, die (i) die Umwandlung der Einzelzellen, verlassen die benachbarten Zellen untransformierten gewährleistet, (Ii) erreicht eine ähnliche Effizienz des Ausdrucks zu verwenden. Zum Beispiel nutzen unsere Experimente bzw. OD600 0,01 und 0,005 für Ausdruck der GFP-Tags PLS und kostenlose DsRed2.</li>
</ol>6. Identifikation der Schlüssel PLS Rückstände mit Alanin Scannen42
<ol><li>Verwenden Sie PCR-Standardprotokolle, um Codierung Sequenz mit ein paar Zündkapseln enthalten wie beschrieben die gewünschte Mutation, d. h., Substitution von Ziel Aminosäurerest mit Alanin in der zentralen Region jeweils Fibel soll PLS verstärken 21. besser gekleideteres Design und Verwendung der Site-verwiesene Mutagenese-Kit für Site-verwiesene Mutagenese nach den Anweisungen des Herstellers durchzuführen.</li>
	<li>Die daraus resultierende PCR-Produkte mit jeder Standardbausatz DNA Reinigung reinigen und verdauen sie bei 37 ° C mit DpnI der Elternzeit zu beseitigen (d. h.nicht mutiert) methyliert und Hemimethylated DNA. Kühlen Sie das für 5 min bei Raumtemperatur (nicht auf dem Eis ab). Dann umwandeln Sie die Mischung direkt in E. Coli kompetente Zellen43, und identifizieren Sie Kolonien mit der gewünschten mutierte Konstrukte zu, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Führen Sie die mutierten Konstrukte in der binären Vektor ein, wie unter Punkt 2.2.4 beschrieben, führen Sie Agroinfiltration, wie in Schritt 3 beschrieben, und bewerten Sie Pd Ausrichtung wie in den Schritten 4 und 5.1 beschrieben.</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Dieses Protokoll hat vier Kern-Bestandteile: das Konzept der Identifizierung einer Sequenz, die notwendig und ausreichend für die Zielgruppenadressierung auf Pd, systematische Einteilung des Proteins des Interesses der Fragmente, die in der Länge, degressiv sind Absicherung der getesteten Fragmente, ein Autofluorescent Protein, die dient sowohl als Tag als makromolekulare Fracht- und funktionelle Assay für Pd-targeting in lebenden Pflanzen Gewebe nach transiente Expression von den getesteten Fusionsproteinen. Beachten Sie, dass Transienten Expression Agrobakterium-vermittelten Daten innerhalb relativ kurzer Zeit, d. h., mehrere Tage, im Vergleich zu benötigt für die Herstellung von transgenen Pflanzen, die häufig in ähnlichen Studien15Monate generiert.
Coexpression des Proteins des Interesses mit subzelluläre Lokalisation Marker, z. B.PDCB1 oder kostenlose DsRed2 in der Regel erfolgt aus einem multigene Expressionsvektor. Jedoch wenn Übertragung von mehreren Expressionskassetten in einen einzigen Vektor technisch problematisch ist, Coexpression kann auch durchgeführt werden durch jede Kassette in eine separate binäre Konstrukt zu übertragen und entspricht Volumen der flüssigen Kulturen der kombinieren die daraus resultierende Agrobakterium Stämme für Agroinfiltration. Da dieses Protokoll transiente Expression nutzt, muss der binären Vektor nicht Selektionsmarker für stabile Transformation ausführen, obwohl ihre Anwesenheit nicht nachteilig auf die Effizienz der Ausdruck ist.
Dieses Protokoll ist optimiert für die Proteinexpression und targeting in N. Benthamiana; Allerdings kann es in anderen Pflanzenarten, darunter Arabidopsis45,46, offen für gentechnische Transformation durch Agrobacterium verwendet werden. Für andere Pflanzenarten oder falls anders gewünscht, kann dieses Protokoll biolistischen Lieferung41 für transiente Expression direkt vom pSAT-basierte Vektoren, vermeiden die Notwendigkeit, die Expressionskassetten auf binäre Vektoren übertragen nutzen angepasst werden.
Ein kritischer Punkt in diesem Protokoll ist der konsequente physiologische und Entwicklungsstörungen Zustand des Pflanzenmaterials. Insbesondere müssen alle Pflanzen gesund durch das ganze Experiment sein und für Agroinfiltration, N. Benthamiana Pflanzen müssen kleiner sein als 4 Wochen alt und bei 4-8-Blatt-Stadium mit dem größten Blatt wird ca. 4-6 cm im Durchmesser. Wenn die Pflanzen zu jung sind, werden die Auswirkungen der Agroinfiltration zu streng, Ausdruck und Lokalisierung der tagged Proteine stören. Auf der anderen Seite weisen die älteren Pflanzen oft Variable Architektur Pd24,25, auch Auswirkungen auf die Konsistenz der Pd-targeting Muster.
Noch, aufgrund der unterschiedlichen physiologischer Bedingungen des Werkes als Ganzes und seiner transformierten Zellen insbesondere, die Effizienz der Pd Ausrichtung in jedem Experiment etwas variieren. So ist es wichtig zu analysieren, eine relativ große Anzahl von Zellen (> 100) pro Experiment, und mindestens drei biologische Wiederholungen der einzelnen Experimente durchführen. Im Allgemeinen betrachten wir eine getestete Fragment Pd targeting Aktivität enthalten, wenn es Pd Lokalisierung in mindestens 70 % der transformierten Zellen aufweist. Unterschiede in der Ausrichtung auf Effizienz jedes Fragment, z.B., Prozent der transformierten Zellen zeigen das Pd-spezifische punktförmige Anreicherung Muster, Pd sollte analysiert werden, indem der Student t-Test und p-Werte < 0,05-0.01, entsprechend der statistische Wahrscheinlichkeit von mehr als 95-99 %.
Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Position der fluoreszierenden Tag/Fracht in die Fusion-Molekül. Einige Pd gezielt Proteine auch assoziieren mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER), und dieser Vereinigung kann die freie amino-terminalen Sequenz erfordern. In diesen Fällen, amino-terminalen Fusionen, in denen die Carboxylgruppen-Terminus des Proteins Fragments des Interesses an den amino-Terminus des fluoreszierenden Tags verschmolzen wird sollte z. B.GFP oder DsRed2, verwendet werden. Diese Standard-Platzierung des Tags kann in folgenden Fällen geändert werden. (i) wenn die amino-terminalen Fusionen nicht nutzbar – d. h., sie nicht sinnvolle subzelluläre Lokalisation Muster aufweisen, werden schlecht ausgedrückt oder erzeugen keine Fluoreszenzsignal ausreichend für zuverlässige Erkennung – und wenn das Protein des Interesses amino-terminalen Signalsequenzen oder Carboxylgruppen-terminale Fusionen in denen amino-Terminus des getesteten Fragments an den Carboxylgruppen-Terminus des Tags verschmolzen ist nicht enthalten, sie sollte versucht werden. (Ii) die Carboxylgruppen-terminale Fusionen sollte auch verwendet werden, wenn das Protein des Interesses Signalsequenzen an seine Carboxylgruppen-Endstation enthält. (Iii) wenn das Protein des Interesses beide amino - und Carboxylgruppen-Terminal-Signale, z. B. auf GPI-verankerte Proteine hat, oder wenn es ein amino-terminalen Signalpeptid enthält noch die amino-terminalen Verschmelzung nicht verwendbar ist, sollte die Beschriftung werden intern platziert) oder stromabwärts des amino-terminalen Signals oberhalb der Carboxylgruppen-Terminal-Signal). Einige nützlichen Verfahren für interne fluoreszierende tagging von Proteinen werden in unseren früheren Publikationen47,48beschrieben.
Derzeit gibt es keine bekannten Konsensussequenz für PLS. Als solche (im Schritt 5.2) empfehlen wir, zunächst Unterteilung des Proteins in zusammenhängenden ~100-200 Rückstand lange Fragmente. Diese können dann schrittweise kürzer gemacht werden anhand der beobachteten Pd-targeting-Aktivität oder das Fehlen derselben. Man sollte eingedenk der anderen potenziellen targeting Signale in das Protein (z.B.NLS, Signal-Peptide, etc.) vorhanden sein. Da die mögliche Überschneidung von solcher Sequenzen mit PLS-Sequenzen nicht bekannt ist, sollte dieser Protein-Regionen in dieser seiner Analyse enthalten.
Bisher wurde dieses Protokoll verwendet, um einen einzigen PLS in einer Protein-Molekül-21zu identifizieren. Potenziell, jedoch kann ein Protein enthalten, mehr als eine Signalsequenz; in der Tat mehrere NLSs wurden in vielen nuklearen Proteine, einschließlich GATA Transkription Faktoren49beschrieben. So bei der Analyse der verschiedenen Fragmente des getesteten Proteins für Pd-targeting ist es möglich, dass mehrere solcher Fragmente identifiziert werden, auf das Vorhandensein von mehreren PLSs, die unabhängig voneinander oder synergistisch wirken kann.
Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist, dass nach Agroinfiltration, Visualisierung der subzellulären Lokalisierung von vorübergehend exprimierten Proteine des Interesses am besten erreicht, in Epidermiszellen und relativ schmalen Wachstumsphase. Bei Bedarf kann diese Einschränkung durch Herstellung transgener Pflanzen, die stabil jedes der getesteten Proteine in den meisten Geweben und Zelltypen ausdrücken überwunden werden. Dieses Protokoll wäre auch nicht nützlich für die Studien der viralen MPs oder andere Pd gezielt Proteine, die nur in Pflanzenarten funktionieren, die nicht vergänglich genetische Transformation zugänglich sind.
Während wir diese Technik zur Identifikation von einem PLS TMV MP entwickelt, kann es verwendet werden, für die Entdeckung der PLSs in einer anderen Anlage virale MPs oder bei endogenen Pflanzeneiweiß, die vorübergehend oder dauerhaft, Pd, lokalisieren. Darüber hinaus ist, wenn in Kombination mit entsprechenden subzelluläre Lokalisation Marker47dieses Protokoll zur Identifizierung von vielen anderen targeting Signale innerhalb der Proteine des Interesses an Pflanzen geeignet.

Plasmodesmata (Pd) Funktion als Kanäle für den interzellulären Transport der wichtigsten Regulatoren der Pflanzenentwicklung und Morphogenese von Transkriptionsfaktoren bis hin zu mRNA und kleine RNA-Moleküle. Darüber hinaus ist dieser makromolekularen Transport Pd durch die meisten Pflanzenviren für ihre interzellulären Ausbreitung während der Infektion ausgelastet; um Pd zu durchlaufen, entstanden Pflanzenviren spezialisierte Proteinen bezeichnet Bewegung Proteine (MPs), die gezielt auf Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekulare Signalwege Pd Transportmittel sind höchstwahrscheinlich mit spezifischen Sequenzen, die auf die transportierten Proteine in diese Bahnen eng verbunden. So kann Identifikation dieser Pd Lokalisierung Signale (PLSs) Diagnose der entsprechenden Pd Transport Weg sein. Dies ist analog der Pd Transport8, z. B. zu verschiedenen nuklearen Import Pathways, die spezifisch für verschiedene nukleare Lokalisierung Signal (NLS) Sequenzen9,10sein kann. Im Prinzip stehen für NLSs und PLSs nicht spaltbaren subzelluläre targeting-Sequenzen, die notwendig und ausreichend für die Ausrichtung sind. Im Gegensatz zu NLSs11ist jedoch die Reihenfolge Informationen über PLSs stark eingeschränkt. Insbesondere wurden nur vier Proteinsequenzen beteiligt bei der Ausrichtung der Pd mit allen von ihnen abgeleitet von endogenen pflanzlichen Proteinen beschrieben. Ersteres wird durch ein Homeobox-Domäne der KN112 – einen Transkriptionsfaktor, der Epidermis der Pflanze Blatt13 aus inneren Zellschichten bewegt – und seine KNOX homologe14dargestellt. Das zweite ist auch aus einen Transkriptionsfaktor, Dof, enthält eine vermeintliche PLS beschrieben als der interzellulären Handel (IT) Motiv15. Die dritte Sequenz ist aus das Membranprotein PDLP1 Plasmodesmata ansässige Typ 1, und es wird durch eine transmembrane Domäne16dargestellt. Schließlich die vierte Pd targeting Sequenz wurde kürzlich berichtet, für Glycosylphosphatidylinositole (GPI)-verankerte Proteine und es wird durch die Glycosylphosphatidylinositole (GPI) Änderung Signal17dargestellt.
Interessant ist, bis vor kurzem keine PLSs gemeldet wurden für virale MPs. Frühere Studien gezeigt das Vorhandensein von vermeintlichen PLS Sequenzen im Werk virale MPs18,19, aber keine wahre PLS, d. h., eine minimale Aminosäure-Sequenz notwendig und ausreichend für Pd Angriffe auf eine unabhängige Ladung Molekül ( zB., GFP) in eine virale MP identifiziert worden. Noch war eines dieser Proteine, MP das Tabakmosaikvirus (TMV), das erste für die Pd Lokalisierung und Transport demonstrierten20gewesen sein.
Um diese Lücke zu begegnen, entwickelten wir eine experimentelle Strategie um TMV MP PLS zu identifizieren. Diese Strategie basierte auf drei Konzepte. (i) Wir haben PLS als eine minimale Aminosäure-Sequenz, die notwendig und ausreichend für das Protein targeting auf Pd21ist definiert. (Ii) weil TMV MP richtet sich zunächst an Pd und dann durch diese Kanäle22translocates, wollten wir Entkopplung diese beiden Tätigkeiten und der Ausarbeitung der bona-fide PLS, welche Funktionen nur für Pd targeting und nicht für den nachfolgenden Verkehr. (Iii) wir analysiert die identifizierten PLS für Aminosäurereste wichtig für seine Pd targeting Aktivität, ob strukturell oder funktional. Mithilfe dieses Ansatzes abgegrenzt wir eine 50-amino Acid Rückstände Sequenz am amino-Terminus des TMV MP, die als bona fide PLS dient. Dies geschah durch produziert eine Reihe von TMV MP-Fragmente, die die gesamte Länge des Proteins gesättigt, tagging ihre Carboxylgruppen-Termini mit GFP und vorübergehend in Pflanzengewebe auszudrücken. PD-Lokalisierung aller getesteten Fragmente wurde durch coexpressing sie mit einem Pd Marker Protein, PDCB1 (Pd Zellstress bindendes Protein 1)23bestimmt. Die kleinsten Fragment, das nach wie vor auf Pd lokalisiert, aber nicht durchqueren, Pd, galt als PLS darstellen. Schließlich war die PLS Alanin gescannt, die wichtige Aminosäurereste benötigt für seine Struktur und/oder Funktion zu bestimmen.
Während hier wir diesen Ansatz mit der Kennung des TMV MP PLS Beschreibung veranschaulichen, können verwendet werden PLSs in jeder anderen Pd-bezogenen Proteinen zu entdecken ob Pflanzenpathogene oder die Pflanzen selbst kodiert; und zwar deshalb, weil unsere Methode keine Besonderheiten des viralen MPs in Bezug auf ihre Fähigkeit zum Ziel Pd nutzen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) sind Zell-Zell-Verbindungen, die als Gateways fungieren durch die kleine und große Molekülen zwischen den Pflanzenzellen transportiert werden. Während Pd Transport von kleinen Molekülen, wie Ionen und Wasser, angenommen wird, dass passiv auftreten, Zell-Zell-Transport von biologischen Makromolekülen, solche Proteine am ehesten erfolgt über einen aktiven Mechanismus, spezifische targeting Signale auf der Molekül transportiert. Die Knappheit der identifizierten Plasmodesmata (Pd) Lokalisierung Signale (PLSs) hat stark eingeschränkt, das Verständnis der Protein-Sortierung Bahnen beteiligt zu Pflanzen, makromolekulare Transport von Zelle zu Zelle und Kommunikation. Aus einer Fülle von Pflanzen endogene und virale Proteine bekannt für den Verkehr durch Pd, nur drei PLSs gemeldet wurden bis heute wurden alle von endogenen pflanzlichen Proteinen. So ist es wichtig, eine zuverlässige und systematische experimentelle Strategie um einen Funktionsablauf PLS zu identifizieren, die sowohl notwendig und ausreichend für Pd-targeting, direkt im Wohnzimmer zu entwickeln Pflanzenzellen. Hier beschreiben wir eine solche Strategie verwenden als Paradigma der Zelle zu Zelle Bewegung Protein (MP) das Tabakmosaikvirus (TMV). Diese Experimente, die identifiziert und charakterisiert die erste virale PLS plant, kann für Entdeckung der PLS-Sequenzen in den Pd-bezogenen Proteinen angepasst werden.

Die repräsentativen Daten, die treu illustrieren die beschriebenen Protokolle erwarteten Ergebnisse und der TMV MP PLS zu identifizieren, werden angepasst von Yuan Et al. 21. Abbildung 1A zuerst fasst wichtige Konstrukte, die mit dem Ausdruck der Full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestehend aus den ersten 50 Aminosäurereste des Proteins, 1-50), und seine Alanin Scannen V4A Derivate mit GFP (generiert als verschmolzen beschriebenen Schritte 2.2, 5.2 und 6) während Abbildung 1 b fasst und die subzelluläre Lokalisation dieser tagged Proteine quantifiziert. Abbildung 1 zeigt die charakteristischen peripheren punctata Pd Lokalisierung beobachteten Mustern für TMV MP-GFP und für TMV MP PLS-GFP als auch für den coexpressed Pd-Marker, PDCB1-DsRed2 (siehe Schritt 5.1). Abbildung 2A zeigt Pd Ausrichtung des TMV MP-GFP und für TMV MP PLS-GFP und Nucleocytoplasmic Verteilung der coexpressed freie DeRed2 (siehe Schritt 5.1). Zu guter Letzt zeigt Abbildung 2 b den Verlust von Pd-targeting von TMV MP und TMV MP PLS mit einer einzigen Alanin Substitution V4A, darauf hinweist, dass dieser Rückstand für die PLS-Struktur oder Funktion wichtig ist; in den gleichen Zellen den coexpressed PDCB1 noch, Pd lokalisiert Pd-Marker (siehe Schritt 6).
Diese Daten zeigen, dass diese konzeptionell und technisch einfache Prozedur der systematische Erstellung von Proteinfragmente, Fusion, ein Autofluorescent-Marker-Cargo-Protein und Test für die Fähigkeit, auf Pd lokalisieren eine minimale Proteinsequenz identifizieren können notwendig und ausreichend für Pd targeting, d. h., PLS. Für eine korrekte Interpretation dieser Lokalisierung-Daten, ist es wichtig, NS1 Experimente mit einem bekannten Pd-Protein, z.B., PDLP oder PDCB Familienmitglieder16,23 oder eines Werks virale MPs, die auf Pd44 sortieren . Natürlich muss die NS1 nicht vollständig sein, da nicht alle P-Lokalisierung von Proteinen zu den gleichen Pd ausgerichtet sein können, sondern eine statistisch signifikante NS1 mit mindestens einem Pd-Marker-Proteine notwendig ist für die Definition der PLS-Aktivität.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig1.jpg"> Abbildung 1: Identifizierung des TMV MP pls (A) Zusammenfassung der wichtigsten GFP-Fusion-Konstrukte zum TMV MP pls TMV MP Sequenzen, grüne Felder identifizieren; GFP, blauen Kästen; P, Förderer; T, Terminator. Zahlen auf der linken Seite zeigen die Aminosäurereste in jedem TMV MP-Fragment enthalten. (B) Zusammenfassung der subzellulären Lokalisierung von Fusionsproteinen in (A) gezeigt. PD-Lokalisierung oder Nucleocytoplasmic Lokalisierung wurde basierend auf die Lokalisierung der entsprechenden subzelluläre Marker, PDCB1-DsRed2 und kostenlose DsRed2 bzw. bestimmt. Der Anteil der Zellen, die jede Lokalisierung Muster ausstellen wird basierend auf 100 mit dem Ausdruck ihrer Zellen pro Konstrukt in drei unabhängigen Experimenten scoring angezeigt. Daten sind Mittelwert ± Standardfehler (SE). (C) Pd Ausrichtung der TMV MP-GFP, TMV MP PLS-GFP und der Pd-Marker PDCB1-DsRed2. GFP-Signal ist in blau; DsRed2 Signal ist in lila; Plastiden Autofluoreszenz wurde herausgefiltert. Bilder sind einzelne konfokale Abschnitte. Skalieren von Balken = 10 µm. DIC, Differential Interferenz Kontrast Schliffbild. Diese Zahl ist von Yuan Et al. 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55301/55301fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig2.jpg"> Abbildung 2: Pd Ausrichtung der TMV MP, TMV MP PLS und ihre Alanin-Scannen durch Mutation entstehende Variationen. (A) subzelluläre Lokalisation des TMV MP-GFP, TMV MP PLS-GFP und der Nucleocytoplasmic Marker DsRed2. (B) Verlust von Pd auf Fähigkeit der V4A Alanin-scanning Mutanten TMV MP PLS-GFP und TMV MP-GFP. Te wurden durch Coexpression von der Pd-Marker PDCB1-DsRed2 visualisiert. GFP-Signal ist in blau; DsRed2 Signal ist in lila; Plastiden Autofluoreszenz wurde herausgefiltert. Bilder sind einzelne konfokale Abschnitte. Skalieren von Balken = 10 µm. DIC, Differential Interferenz Kontrast Schliffbild. Diese Zahl ist von Yuan Et al. 21. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55301/55301fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K Aufrufe.  State University of New York. Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Serie: Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.