وأيد هذا العمل "برنامج بحوث الجينوم المصنع" من "المؤسسة الوطنية للعلوم" (NSF--بجرب--دائرة الرقابة الداخلية--1339388).

1-نمو النباتات
<ol><li>زرع بذور فول الصويا 5-10 (ويليامز 82) في وعاء 13 سم في الدفيئة ظروف طويلة أيام (الخفيفة في 1,500 µmol m-2 s-116 ح) عند 25 درجة مئوية على مزيج التربة المخصصة لفول الصويا (1: نسبة 1:1 للتربة، البيرليت ونسف الرمال).</li>
</ol>2-إعداد بلازميد الحمض النووي
<ol><li>استخدام تلميح ماصة معقمة أو مسواك، اختيار مستعمرة واحدة أو الأسهم والغليسيرول المجمدة من كولاي يحمل بلازميد يحتوي على الجينات للفائدة وتطعيم أنه في 20 مل بيرتاني لوريا (رطل) المتوسطة السائل مع المضادات الحيوية المناسبة في قارورة 50 مل.</li>
	<li>احتضان قارورة على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في شاكر. جمع البكتيريا سينتريفوجينج التعليق في 12,000 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. استخراج وتنقية بلازميد اتباع الإجراء الخاص بالشركة المصنعة لمجموعة الإعدادية بلازميد.</li>
</ol>3-جبلة مجردة العزلة
<ol><li>قص أوراق أونيفولياتي الموسعة حديثا من شتلة فول الصويا 10-اليوم القديم (الشكل 1). ملاحظة: اختيار الأوراق في مرحلة إنمائية مناسبة هو مفتاح النجاح لإعداد جبلة مجردة فول الصويا. فقط استخدام أوراق موسعة فقط في مراحل النمو المبكرة. كما يترك ناضجة، جدران الخلايا تصبح أكثر صعوبة لهضم.</li>
	<li>مع شفرة حلاقة جديدة، إزالة الضلع الأوسط من نبات أونيفولياتي وثم قص شرائط الرفات إلى 0.5-1 ملم. ملاحظة: سيعطي يترك أونيفولياتي اثنين يهضم في حل الإنزيم 10 مل بروتوبلاستس كافية لتحولات أكثر من 10.</li>
	<li>استخدام زوج من الملقط، نقل شرائط الورقة فورا لطف إلى 10 مل من محلول إنزيم الطازجة (الجدول 1) في أنبوب 15 مل. ارتشاح الفراغ شرائط الورقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>احتضان الشرائط ليف في حل الإنزيم مع الانفعالات لطيف (40 لفة في الدقيقة) تحت ضوء منخفض ح 4-6 في درجة حرارة الغرفة. التأكد من أن الحل إنزيم يتحول الأصفر والأخضر كما يتم الإفراج عن بروتوبلاستس. تحقق من أن الحل إنزيم/بروتوبلاستس تحت المجهر (X10). ملاحظة: بروتوبلاستس المفرج عنهم كروية الشكل، في حين الخلايا عسر الهضم غير منتظمة أو بيضاوية الشكل.</li>
	<li>نقل 10 مل حل الإنزيم/جبلة مجردة في أنبوب 50 مل بصب بلطف وإضافة 10 مل من محلول W5 (الجدول 1) في درجة حرارة الغرفة لوقف عملية الهضم. عكس الأنبوب بلطف عدة مرات. صب بلطف الحل إنزيم/بروتوبلاستس على نايلون ميكرون 75 نظيفة وضعت على رأس أنبوب 50 مل لإزالة أنسجة نبات عسر الهضم.</li>
	<li>الطرد المركزي الحل من خلال تدفق إنزيم/بروتوبلاستس في 100 غرام x في أنبوب 50 مل لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة مصلية 10 مل دون إزعاج بيليه جبلة مجردة بلطف.</li>
	<li>ريسوسبيند بروتوبلاستس، وتمييع لتركيز من 2 × 105 مل-1 في حل W5 مبردة عند 4 درجة مئوية عن طريق العد عدد جبلة مجردة في هيماسيتوميتير تحت المجهر (x10). الحفاظ بروتوبلاستس على الجليد لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>الطرد المركزي من التعليق في 100 غ س ل 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وإزالة بلطف الحل W5 باستخدام ماصة 1 مل دون إزعاج بيليه جبلة مجردة. ريسوسبيند بروتوبلاستس في الحل المعجل (الجدول 1) بتركيز 2 × 105 مل-1 في درجة حرارة الغرفة.</li>
</ol>4-جبلة مجردة التحول
<ol><li>جعل 100 ميليلتر مختبرين من بروتوبلاستس (2 × 104 بروتوبلاستس في 2 × 105 مل-1) في أنابيب ميكروسينتريفوجي التصاق منخفضة 1.5 مل استخدام تقطيعه 200 ميليلتر ماصة النصائح. وضع واحد قاسمة جانبا لتكون بمثابة مراقبة سلبية. إضافة 10 ميليلتر من بلازميد (10-20 ميكروغرام) إلى كل من قاسمة بقية من بروتوبلاستس.</li>
	<li>إضافة ببطء ميليلتر 110 الطازجة شماعة الحل (الجدول 1) على الجدار الداخلي للأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وثم برفق عكس وتدوير الأنبوبة حتى يصبح الحل متجانسة.</li>
	<li>احتضان هذا الخليط التحول في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>للتوقف عن التحويل وإضافة 400 ميليلتر من حل W5 ببطء إلى أنبوب 1.5 مل عند درجة حرارة الغرفة وعكس الأنبوب بلطف حتى يصبح الحل متجانسة. الطرد المركزي الأنبوب في 100 غرام لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل المادة طافية باستخدام ماصة.</li>
	<li>أضف 1 مل من محلول أي (الجدول 1) إلى الأنبوبة وريسوسبيند بلطف بيبيتينج 1-2 مرات. أضف 1 مل مصل العجل العقيمة (المجلد/المجلد) 5% في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة 6-جيدا معطف السطح والحيلولة دون بروتوبلاستس من الالتصاق باللوحة.</li>
	<li>وبعد بضع ثوان، تجاهل مصل العجل باستخدام ماصة. نقل بروتوبلاستس ريسوسبينديد في بئر من لوحة الثقافة. وتغطي اللوحة مع غطاء.</li>
</ol>5-جبلة مجردة الاحتضان والحصاد
<ol><li>احتضان بروتوبلاستس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 يوما في الظلام. ملاحظة: لقد وجدنا أن حضانة يومين غلة أقوى إشارة بروتين فلورسنت بشكل عام بالمقارنة مع الاحتضان يوما واحداً، وأن إشارة البروتينات الفلورية قد تستمر لمدة تصل إلى 3-4 أيام.</li>
	<li>نقل الحل جبلة مجردة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي التصاق منخفضة 1.5 مل. الطرد المركزي الأنبوب في 100 غ س ل 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لحصاد بروتوبلاستس. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة ونقل 10 ميليلتر بروتوبلاستس إلى شريحة زجاج.</li>
	<li>مراقبة الإشارات الفلورسنت تحت الأسفار أو مجهرية [كنفوكل]. استخدام بروتوبلاستس عدم تحويلها كمراقبة سلبية (ينبغي أن تراعي أي إشارة).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+hybridisation+of+plants+by+fusion+of+protoplasts.">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li><li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+white+clover:+callus,+suspension,+protoplast+culture,+and+plant+regeneration.">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).</li><li>L&#246;rz, H., Baker, B., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+cereal+cells+mediated+by+protoplast+transformation.">Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation.</a> Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).</li><li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants.">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li><li>Koop, H. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199 (2), 193-201 (1996).</li><li>Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+enzymes+of+anthocyanin+biosynthesis+in+protoplasts.">Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts.</a> Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).</li><li>Lin, W., Wittenbach, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+proteases+in+wheat+and+corn+mesophyll+protoplasts.">Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).</li><li>V&#246;geli-Lange, R., Wagner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+cadmium+and+cadmium-binding+peptides+in+tobacco+leaves.">Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves.</a> Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defence+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice.">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li><li>Wu, F. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich-a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant methods. 5 (1), 16 (2009).</li><li>Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+polyubiquitin+genes:+structure,+thermal+perturbation+of+expression+and+transcript+splicing,+and+promoter+activity+following+transfer+to+protoplasts+by+electroporation.">Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.</a> Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).</li><li>Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+a+wheat+promoter+by+abscisic+acid+in+rice+protoplasts.">Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts.</a> Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).</li><li>Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+fungal+elicitor+regulation+of+a+plant+defense+gene+promoter+in+electroporated+protoplasts.">Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).</li><li>Cocking, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+of+plant+protoplasts+and+vacuoles.">A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.</a> Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rice+plants+produced+by+electroporation-mediated+plasmid+uptake+into+protoplasts.">Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).</li><li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation.">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).</li><li>Crossway, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+DNA+following+microinjection+of+tobacco+mesophyll+protoplasts.">Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).</li><li>Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+barley+by+microinjection+into+isolated+zygote+protoplasts.">Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts.</a> Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).</li><li>Schapire, A. L., Lois, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+rapid+method+for+the+isolation+and+transfection+of+Arabidopsis+leaf+mesophyll+protoplasts+for+large-scale+applications.">A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications.</a> Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).</li><li>Niedz, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+somatic+embryos+from+sweet+orange+(C.+sinensis)+protoplasts+using+semi-permeable+membranes.">Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).</li><li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplast+isolation+and+plant+regeneration+of+different+doubled+haploid+lines+of+cauliflower+(Brassica+oleracea+var.+botrytis).">Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis).</a> Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).</li><li>Grun, P., Chu, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plants+from+protoplasts+of+Solanum+(Solanaceae).">Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae).</a> Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).</li><li>Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+protoplasts:+status+and+biotechnological+perspectives.">Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.</a> Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).</li><li>Pitzschke, A., Persak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poinsettia+protoplasts-a+simple,+robust+and+efficient+system+for+transient+gene+expression+studies.">Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies.</a> Plant methods. 8 (1), 14 (2012).</li><li>Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).</li><li>Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+domestication:+the+origin,+genetic+architecture+and+molecular+bases.">Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases.</a> New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).</li><li>Yang, Y., Li, R., Qi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+plant+promoters+and+transcription+factors+by+agroinfiltration+of+tobacco+leaves.">In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves.</a> Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).</li><li>Marion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+protein+subcellular+localization+and+interaction+using+high-throughput+transient+transformation+of+Arabidopsis+seedlings.">Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings.</a> Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).</li><li>Wu, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGROBEST:+an+efficient+Agrobacterium-mediated+transient+expression+method+for+versatile+gene+function+analyses+in+Arabidopsis+seedlings.">AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings.</a> Plant methods. 10 (1), 19 (2014).</li><li>Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+constitutive+viral+promoters+in+transgenic+soybean+roots+and+nodules.">Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules.</a> Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).</li><li>Nagamatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+soybean+genes+involved+in+flavonoid+biosynthesis+by+virus-induced+gene+silencing.">Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing.</a> Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).</li><li>Juvale, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+Bean+pod+mottle+virus-induced+gene+silencing+in+soybean.">Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean.</a> Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).</li><li>Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+an+efficient+multipurpose+bean+pod+mottle+virus+viral+vector+set+for+foreign+gene+expression+and+RNA+silencing.">The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing.</a> Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).</li><li>Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mesophyll+protoplasts+from+mature+leaves+of+soybeans.">Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans.</a> Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-repeat+MYB+transcription+factor,+GmMYB176,+regulates+CHS8+gene+expression+and+affects+isoflavonoid+biosynthesis+in+soybean.">A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean.</a> Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).</li><li>Faria, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAC+domain-containing+protein,+GmNAC6,+is+a+downstream+component+of+the+ER+stress-and+osmotic+stress-induced+NRP-mediated+cell-death+signaling+pathway.">The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway.</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).</li><li>Kidokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+DREB1/CBF-type+transcription+factors+function+in+heat+and+drought+as+well+as+cold+stress-responsive+gene+expression.">Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression.</a> Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+soybean+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.</a> Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).</li><li>Karimi, M., Inz&#233;, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAY&#8482;+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAY&#8482; vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li><li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+and+characterization+reveal+the+molecular+basis+for+soybean+maturity+locus+E1+that+regulates+photoperiodic+flowering.">Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).</li></ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

هذا البروتوكول لعزل بروتوبلاستس فول الصويا والتطبيق لدراسات التعبير عابر قد تم اختبارها بدقة، ويعمل بشكل جيد للغاية في المختبر. الإجراءات بسيطة وسهلة، وتتطلب معدات عادية وأقل تكلفة. لدينا بروتوكول ينتج كميات كبيرة من بروتوبلاستس موحدة وعالية الجودة بالمقارنة مع أساليب سبق الإبلاغ عنها34،35،36،،من3738. ومع ذلك، نظراً لوجود العديد من العوامل التي تؤثر على غلة جبلة مجردة ومعدلات التحويل، من المستحسن بشدة للباحثين لتحسين الشروط وفقا للظروف التجريبية والنتائج المرجوة والمواد المستخدمة. في حين أن هذا النظام مفيد للغاية لدراسة الأحداث التنظيمية والبيوكيميائية الفوري في الخلايا النباتية، أنها ليست مناسبة للمراقبة طويلة الأجل العمليات الخلوية والأحداث التي تحدث على المستوى العضوي أو الأنسجة.
لقد وجدنا أن التحديد بشدة تزايد المواد النباتية في مرحلة النمو مثالي هو أهم عامل في إعداد جبلة مجردة فول الصويا. وهو يحدد ليس فقط من غلة من بروتوبلاستس، ولكن النوعية التي تؤثر على تحويل الحمض النووي اللاحقة. من المهم دائماً زراعة نباتات فول الصويا في بيئة ثابتة بعيداً عن أي ضغوط، مثل الجفاف والفيضانات، ودرجات الحرارة القصوى أو الآفات. يمكن تحقيق الكفاءة الغلة والتحول جبلة مجردة أعلى استخدام أوراق أونيفولياتي الموسعة فقط من الشباب الشتلات. للمبتدئين، ويقترح استخدام أوراق أونيفولياتي في مراحل إنمائية مختلفة وإجراء مقارنة للحصول على أفضل النتائج.
جبلة مجردة/الحمض النووي نسبة عامل هام لتحقيق الكفاءة المثلى التحول. فمن الأفضل عادة من المستحسن البدء بنسبة 2 × 104 بروتوبلاستس/10-20 ميكروغرام الحمض النووي، ولكن الأمثل النسبة لكل بنيات25. من المستحسن استخدام عالية الجودة التي حصلت عليها مجموعة تنقية الحمض النووي DNA.
لاختيار ناقلات للتعبير عابرة في بروتوبلاستس، عدد النسخ عالية وناقلات صغيرة الحجم المفضل عموما. على الرغم من أن ثنائي متجهات ل tumefaciens المتبعة-التحول وساطة من النباتات يمكن أن تستخدم لتحويل جبلة مجردة، والحجم الكبير لهذه الناقلات قد ينتج أقل كفاءة التحويل الأمثل. للتعبير البروتين بروتينات فلورية خضراء-الانصهار، ونحن عادة استخدام ناقلات الأمراض التي لا تمتلك علامة تحديد للنباتات وهي صغيرة نسبيا ومن ثم (6-7 كيلو بايت)، مثل p2GWF7 و p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
متجهات متعددة يمكن استخدامها لتحويل بروتوبلاستس في وقت واحد. كان علينا النجاح في التعبير عن المتجهات بيفك لاختبار تفاعلات البروتين البروتين، فضلا عن البروتينات الفلورية متعددة عضية والعلامات سوبسيلولار في بروتوبلاستس فول الصويا. وعلاوة على ذلك، يقدم البساطة والغلة كبيرة لدينا أسلوب نظام مثالي لدراسة الأحداث التنظيمية والكيمياء الحيوية، واستهداف الجين تصميم ناقل، عزل البروتينات أعرب عابر والبروتين المعقدة، وتنقية محددة النهج عضية مثل النوى، تمكين مزيد من الطلبات الناشئة الجينوم، والبروتين.

بروتوبلاستس هي الخلايا النباتية التي تحتوي على جدران الخلايا إزالة. كما يحتفظون بمعظم الميزات وأنشطة الخلايا النباتية، بروتوبلاستس هي نظام نموذجا جيدا لمراقبة وتقييم الأحداث الخلوية المتنوعة، وهي أدوات قيمة لدراسة تهجين جسمية1 ومصنع التجدد2. بروتوبلاستس على نطاق واسع أيضا استخدمت محطة التحول3،،من45، نظراً لجدران الخلايا إلا تعرقل مرور الحمض النووي في الخلية. بروتوبلاستس تمتلك بعض الاستجابات الفسيولوجية والعمليات الخلوية للنباتات سليمة، ومن ثم تقديم قيمة أساسية في البحوث الأساسية لدراسة البروتين سوبسيلولار التعريب6،،من78، يعيش البروتين-بروتين تفاعلات9،10، ومروج النشاط11،،من1213 في الخلايا.
عزل محطة بروتوبلاستس أبلغ أولاً في عام 196014 وقد وضعت بروتوكولات للعزلة والتحول من بروتوبلاستس ومحسن. إجراءات موحدة لعزل جبلة مجردة ينطوي على قطع أوراق الشجر والهضم الأنزيمي لجدران الخلية، متبوعاً بالفصل بين بروتوبلاستس المفرج عنهم من الحطام الأنسجة غير هضمها. وتشمل استراتيجيات التحول انهانسر15،16،17،microinjection18، والمستندة إلى البولي إثيلين غليكول (شماعة)4،5،19 أساليب. وأبلغ مجموعة واسعة من الأنواع الناجحة لعزل جبلة مجردة، بما في ذلك الحمضيات20وكرنب21، الباذنجانية22 و23،أسر أخرى من نباتات الزينة24. بينما يتم استخدام أنواع الأنسجة المتنوعة في مختلف الأنواع، نظام التعبير عابر في نبات mesophyll جبلة مجردة (تيمب) المعزولة من أوراق النبات نموذج التمويل نبات كانت راسخة25 واعتمدت على نطاق واسع لتطبيقات متنوعة.
فول الصويا (ماكس جليكاين (L.) Merr.) واحد من أهم البروتين ومحاصيل النفط26. وخلافا نبات الأرز، والحصول على نباتات فول الصويا المعدلة وراثيا المعروف أن صعبة بل ومنخفضة الكفاءة. Tumefaciens المتبعة-قد استخدم تسلل وساطة شعبيا لدراسات التعبير الجيني عابر في خلايا البشرة في27 من التبغ وشتلة في نبات،من2829، في حين وقد استخدمت رهيزوجينيس المتبعة لتحول جذور شعر في30من فول الصويا. استخدمت دوونريجوليشن31،الجينات المستهدفة32 وعابرة التعبير33 نهج إسكات الجينات الناجمة عن الفيروس بطريقة منهجية. بروتوبلاستس توفر بديلاً قيماً وتنوعاً لهذه النهج. ويمكن الحصول على مواد سطحي لفول الصويا بروتوبلاستس والسماح بالتعبير التحوير سريعة ومتزامنة. ومع ذلك، عزل بروتوبلاستس فول الصويا في عام 198334الناجحة الأولى، هناك منذ التقارير المحدودة على تطبيق بروتوبلاستس في فول الصويا35،،من3637، 38، أساسا بسبب المحاصيل منخفضة نسبيا من فول الصويا بروتوبلاستس.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيط وفعال للعزلة من فول الصويا بروتوبلاستس وتطبيقه لدراسات التعبير الجيني عابر. استخدام أوراق أونيفولياتي الشباب من بذور فول الصويا، كنا قادرين على الحصول على كميات كبيرة من بروتوبلاستس الحيوية في غضون ساعات قليلة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن الأمثل طريقة تحول الكالسيوم توسطت شماعة بسيطة ومنخفضة التكلفة إيصال الحمض النووي في بروتوبلاستس فول الصويا بكفاءة عالية.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASE &quot;ONOZUKA&quot; R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plates</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA plasmid miniprep kit</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Ingram&#039;s Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox (Powder)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for isolation of soybean protoplasts and application to transient gene expression analyses

فول الصويا (ماكس جليكاين (لام) مير.) هو أنواع محاصيل هامة، وأصبحت نموذجا البقول للدراسات الخاصة بالمسارات الجينية والبيوكيميائية. ولذلك، من المهم إقامة نظام تعبير الجيني عابر فعالة في فول الصويا. هنا، نحن تقرير بروتوكول بسيط لإعداد بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيقه للتحليلات الفنية عابرة. ووجدنا أن يترك أونيفولياتي الشباب من بذور فول الصويا أدى إلى كميات كبيرة من بروتوبلاستس عالية الجودة. عن طريق تحسين أسلوب تحويل الكالسيوم توسطت شماعة، حققنا التحول عالية الكفاءة باستخدام فول الصويا أونيفولياتي بروتوبلاستس. هذا النظام يوفر نموذج كفاءة وتنوعاً للنظر في آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية من فول الصويا، وقد تساعد على تحسين فهم العمليات الخلوية والتنموية والفسيولوجية المتنوعة من البقوليات.

تم اختبار أجهزة مختلفة من فول الصويا 10-يوم قديمة لإعداد جبلة مجردة (الشكل 1)، ولوحظت غلة تحت المجهر (الشكل 2). كان لا يكاد يهضم جدران الخلايا من hypocotyl وابيكوتيل، وبقيت بعض الخلايا المتصلة ببعضها البعض (الشكل 2، ج 2). وفي كوتيليدون (الشكل 2D) والجذر (الشكل 2A)، أزيلت جدران الخلية فقط في جزء صغير من الخلايا. وفي المقابل، لوحظ عدد كبير من بروتوبلاستس عندما كان أونيفولياتي المستخدمة (الشكل 2E-ز). أوراق أونيفولياتي في مراحل إنمائية مختلفة كانت مزيد بحث (ح الشكل 2). في حين يترك أونيفولياتي unexpanded والموسع فقط أسفرت عن ارتفاع غلة بروتوبلاستس، حجم بروتوبلاستس من مجرد توسيع أونيفولياتي كانت أكثر زي (الشكل 2 واو) من unexpanded أونيفولياتي (الشكل 2E). للموسع تماما أونيفولياتي، جدران الخلية لا تزال سليمة في معظم الخلايا (الشكل 2). لقد اختبرنا إنزيمات الهضم جدار الخلية من ثلاث شركات مختلفة، والحصول على نتائج قابلة للمقارنة، كما هو موضح أعلاه. وبناء على هذه الملاحظات، خلصنا إلى أن اختيار المواد النباتية عاملاً حاسما، وأن يترك أونيفولياتي الموسعة فقط من بذور فول الصويا الشباب هي أفضل المواد لإعداد جبلة مجردة.
تم اختبار مجموعة من كميات مختلفة من بلازميد الحمض النووي (0.1 ميكروغرام، 1 ميكروغرام، 5 ميكروغرام و 20 ميكروغرام) لكفاءة التحويل الأمثل من فول الصويا أونيفولياتي بروتوبلاستس (الشكل 3 ألف-دال). 20 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي أظهرت كفاءة التحول أعلى بأكثر من معدل تحول 50% (الشكل 3D)، في حين أظهرت 0.1 ميكروغرام أقل (أقل من 1%) (الشكل 3A). ونحن الحصول على كفاءة تحويل قابلة للمقارنة باستخدام مختلف مجموعات تنقية الحمض النووي من ثلاث شركات. هذه النتيجة تشير إلى أن كميات أكبر من بلازميد الحمض النووي أن يساعد كثيرا في زيادة كفاءة التحويل.
الرقم 4 هو صور [كنفوكل] من فول الصويا بروتوبلاستس تحول مع بناء p2GWF7-E1، الذي يعبر عن بروتينات فلورية خضراء تنصهر فيها الجينات الخاصة بالبقول E1 (Glyma.06G207800)، مدفوعا بالمروج 35S كامب في p2GWF7 مكافحة ناقلات 39-البروتين الانصهار E1-بروتينات فلورية خضراء يظهر التعريب النووية في بروتوبلاستس فول الصويا، وما يتسق مع دراسة سابقة لاستخدام نظام جبلة مجردة أعطيت40. E1 جين البقول على حدة، فإن لدينا نتيجة استخدام نظام جبلة مجردة فول الصويا يوفر نظرة قاطعة في ترجمة سوبسيلولار بروتين E1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig1.jpg"> رقم 1. رسم توضيحي يبين أجهزة الشتلات فول الصويا اختبارها لإعداد جبلة مجردة في هذه الدراسة، بما في ذلك الجذر، هيبوكوتيل، كوتيليدون، ابيكوتيل وأونيفولياتي- بعد زوج من أوراق أونيفولياتي، وضع شتلة فول الصويا أوراق ثلاثية. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57258/57258fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig2.jpg"> رقم 2. جبلة مجردة خلايا المعدة من الأجهزة المختلفة ومراحل نمو شتلات فول الصويا. (أ-د) إعداد الخلايا من أجهزة مختلفة من 10-القديمة يوم شتلة فول الصويا: الجذر (A)، هيبوكوتيل (ب)، ابيكوتيل (ج)، كوتيليدون (د). (ه-ز) جبلة مجردة الخلايا أعد من أوراق أونيفولياتي في مراحل إنمائية مختلفة: unexpanded (E)، توسيع فقط (و)، وتوسيع الكامل (ز) أونيفولياتي، المقابلة للشتلات فول الصويا في (ح) على اليسار والأوسط والحق، على التوالي. شريط مقياس هو 25 ميكرومتر (أ-ز) أو 25 مم (ح). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57258/57258fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig3.jpg"> الشكل 3. [كنفوكل] صور تظهر كفاءة التحويل من فول الصويا بروتوبلاستس أونيفولياتي مع كميات مختلفة من بلازميد الحمض النووي. صور للتجارة والنقل (ممثلة باللون الأخضر) ومشرق يتم دمج الحقل (رمادي)- تم تحويل بروتوبلاستس مع كميات مختلفة من بلازميد p2GWF7-E1: 0.1 ميكروغرام (A)، 1 ميكروغرام (ب)، 5 ميكروغرام (ج) و 20 ميكروغرام (د). وتم رصد إشارة الأسفار للتجارة والنقل 24 ساعة بعد التحول تحت المجهر. هو شريط أسود مقياس 50 ميكرومتر. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57258/57258fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig4.jpg"> الشكل 4. [كنفوكل] الصور التي تبين توطين سوبسيلولار E1-التجارة والنقل في نواة لفول الصويا بروتوبلاستس أونيفولياتي. تم استخدام بلازميد p2GWF7-E1 للتحول. صور للتجارة والنقل (ممثلة باللون الأخضر) ومشرق يتم دمج الحقل (رمادي). وتم رصد إشارة الأسفار للتجارة والنقل 24 ساعة بعد التحويل. هو شريط أسود الحجم 5 ميكرومتر. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57258/57258fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">حل الإنزيم (طازج)</td>
		</tr>
<tr>
<td>مس، 5.7 درجة الحموضة</td>
			<td>20 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>سيلولاسي سلف</td>
			<td>2% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-23 بيكتولياسي</td>
			<td>0.1% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>المانيتول</td>
			<td>0.75 متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاكل2
</td>
			<td>0.2 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>جيش صرب البوسنة</td>
			<td>0.1% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>0.5 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">الحل W5</td>
		</tr>
<tr>
<td>كلوريد الصوديوم</td>
			<td>154 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاكل2
</td>
			<td>125 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوكل</td>
			<td>5 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>مس، 5.7 درجة الحموضة</td>
			<td>2 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">الحل المعجل</td>
		</tr>
<tr>
<td>مس، 5.7 درجة الحموضة</td>
			<td>4 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>المانيتول</td>
			<td>400 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجكل2
</td>
			<td>15 ملم</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">الحل شماعة (طازج)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEG4000</td>
			<td>20% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>المانيتول</td>
			<td>200 ملم</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاكل2
</td>
			<td>100 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">أي الحل</td>
		</tr>
<tr>
<td>مس، 5.7 درجة الحموضة</td>
			<td>4 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>المانيتول</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوكل</td>
			<td>20 مم</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1. الحلول المستخدمة لعزل جبلة مجردة فول الصويا والتحول.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses at JoVE.com

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وفعالة لإعداد كميات كبيرة من فول الصويا بروتوبلاستس لدراسة آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية.

طريقة بسيطة لعزل بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيق لتحليل التعبير الجيني عابر

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

a-simple-method-for-isolation-soybean-protoplasts-application-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

24.9K Views.  California State University, Northridge. قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وفعالة لإعداد كميات كبيرة من فول الصويا بروتوبلاستس لدراسة آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية.

Video: A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetics

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Environment

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

عزلة Protoplasts من أنسجة لمدة 14 يوما من عمره الشتلات thaliana Arabidopsis</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Immunology and Infection

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

إنتاج عالي الكفاءة لجذور فول الصويا المشعرة المعدلة وراثيا

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

تسليط الضوء على المؤلف: تحويل جذر فول الصويا المشعر لتحليل وظيفة الجينات  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

تحويل جذر فول الصويا المشعر لتحليل وظيفة الجينات

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

طريقة بسيطة لعزل بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيق لتحليل التعبير الجيني عابر

Summary

Explore More Videos

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون

عزلة Protoplasts من أنسجة لمدة 14 يوما من عمره الشتلات thaliana Arabidopsis

الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من

تحويل جذر فول الصويا المشعر لتحليل وظيفة الجينات

تحويل جذر فول الصويا المشعر لتحليل وظيفة الجينات

تحويل جذر فول الصويا المشعر لتحليل وظيفة الجينات