HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse zu HAC vom National Institute of General Medical Sciences Center Excellence Grant P50 GM071508 (p.i. David Botstein), PhRMA Foundation Grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879, David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Nationales Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, die Eli &#38; Edythe breit Zentrum für Regenerative Medizin &#38; Forschung an Stammzellen, die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, und die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli &#38; Edythe breite Zentrum für Regenerationsmedizin &#38; Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.

Alle beschriebenen Experimente stimmten institutionelle Review Boards an der Princeton University und der University of California, Los Angeles.
1. bereiten Sie wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten für ActD zeitlicher Verlauf
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Timecourse mit vier Zeitpunkte. Drei biologisch unabhängige Stichproben können pro Timepoint gesammelt werden, durch das Sammeln von verschiedenen Gewebekultur Platten in einem Experiment, oder das Experiment kann mehrere Male mit unterschiedlichen Kulturen der Zellen wiederholt werden. Nach unserer Erfahrung bietet eine 10 cm (Durchmesser) Gewebekultur Teller (ein Teller) ausreichend RNA für die Analyse. Bei Bedarf können mehrere Gewebekultur Gerichte für jede Probe, die Zahl der Zellen in jedem Timepoint gebündelt. Darüber hinaus kann das gleiche Experiment durchgeführt werden, mit Fibroblasten aus verschiedenen Individuen isoliert, da wirklich unabhängige biologische repliziert.
<ol>
	<li>Proliferierende und ruhende Kulturen der Zellen für die Mitschrift Verfall Analyse zu etablieren. Teilen Sie für wuchernden Zellen die Zellen alle drei Tage während der Kontakt gehemmt Zellen Kontakt gehemmt werden.
	<ol>
		<li>Verändern Sie das Medium für die Kontakt-gehemmt Zellen alle 2 Tage für 7 Tage. Aufteilen der proliferierenden Zellen 2 Tage, bevor die Kontakt gehemmt Fibroblasten zur Abholung bereit ist. Ein Beispiel für eine Zelle-Kultur-Schema ist in Abbildung 1dargestellt. Die verbleibenden Schritte in diesem Abschnitt bieten ein detailliertes Protokoll für die Einrichtung und Aufteilung der Zellen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Primäre dermale Fibroblasten von Neugeborenen Haut nach etablierte Protokolle13zu isolieren. Durchgang Fibroblasten um eine homogene Bevölkerung zu gewährleisten. Hinweis: Fibroblasten können eingefroren und wieder aufgetaut, wenn nötig.</li>
	<li>Auftauen oder Fibroblasten, replate, wenn nötig. Wachsen Sie Fibroblasten in DMEM mit 10 % Serum unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Verwenden Sie die Fibroblasten, die für weniger als 10 Passagen angebaut wurden. Fibroblasten soll &#60; 80 % Zusammenfluss am Tag der Teilung Zellen, wuchernde und ruhende Bevölkerungen zu machen.</li>
	<li>In einer Gewebekultur-Platte in mehrere Platten, prewarm PBS, Trypsin und Medium mit Serum in einem 37 ° C Wasserbad 20 Minuten aufgeteilt.</li>
	<li>Aspirieren Sie oder verwenden Sie ein Pipettieren jede Gewebekultur-Platte mit Zellen, formulierte werden das Medium entfernt.</li>
	<li>Pipettieren warm PBS auf jede Platte (10 mL der Lösung für ein 150 mm Platte, 5 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte) und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte.</li>
	<li>Absaugen oder pipettieren, PBS aus jeder Gewebekultur-Platte zu entfernen.</li>
	<li>Sanft Pipettieren 1 x Trypsin-EDTA auf jede Platte (8 mL Lösung für einen 150 mm Teller, 3 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte). Hinweis: Stellen Sie 1 x Trypsin-EDTA durch Verdünnung steril 10 x Trypsin-EDTA in sterilen PBS. Die letzte 1 X Lösung sollte 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA.</li>
	<li>Inkubieren Sie Trypsin mit Zellen für 5 min.</li>
	<li>Klopfen Sie leicht die Platte, um Zellen von der Platte zu verdrängen.</li>
	<li>Pipettieren, Zellen in eine einzelne Zelle Suspension aufzuwirbeln.</li>
	<li>Übertragen Sie Zellen in Trypsin-Lösung auf eine konische Rohr mit dem gleichen Volumen DMEM mit 10 % Serum (8 mL Lösung für einen 150 mm Teller, 3 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen einer 12 gut Platte).</li>
	<li>Spin-down Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 1000 X g , Trypsin zu entfernen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in einem entsprechenden Volumen des Mediums und zählen mit einer Hemacytometer Zelle Konzentration bestimmt.</li>
	<li>Samen 5 x 105 Zellen pro 100 mm Gewebekultur Platte für wuchernden und Kontakt-gehemmt.</li>
	<li>Mit dieser Methode zu etablieren die wuchernden und Kontakt gehemmt Proben für Analyse (Abbildung 1) erforderlich.</li>
</ol>
(2) ActD zeitlicher Verlauf
<ol>
	<li>Aufschwemmen Sie ActD in ein Lager Konzentration von 1 mg/mL (für 1 mg des ActD, Einsatz 950 µL steriler PBS und 50 µL steriler DMSO). Hinweis: Gefrorene Stammlösungen ActD sollte stabil für einen Monat bei-20 ° c sein Verdünnte Lösungen sollten verworfen und nicht zur weiteren Verwendung gespeichert werden.</li>
	<li>Das entsprechende Volumen der vorgewärmte Medium ActD hinzufügen, für alle biologischen replizieren Zellkultur-Platten wurden für die 0, 120, 240 und 480 min Zeitpunkte (Abbildung 2) eingerichtet. ActD in einer Konzentration von 15 µg pro mL Medium hinzufügen. Mischen Sie gut, aspirieren Sie das alte Medium, und die Zellen fügen Sie ActD-haltigen Medium hinzu.
	<ol>
		<li>Für eine 1 mg/mL Brühe hinzufügen 15 µL ActD für jedes mL Medium, z. B.für 10 mL Medium für eine 100 mm-Platte hinzufügen 150 µL ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Die Null Timepoint Probe sammeln, sanft aus dem ActD Medium und Pipettieren Aspirieren vorgewärmt PBS auf die Zellen. Pipettieren 10 mL der Lösung für ein 150 mm-Platte, 5 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte.</li>
	<li>Aspirieren Sie sanft oder Pipettieren von PBS. Hinweis: Alle Schritte mit RNA Isolierung sollte mit RNase-freies Wasser, RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen und RNase-freie Pipetten durchgeführt werden. Handschuhe sollten getragen und verändert oft beim Arbeiten mit RNA.</li>
	<li>Fügen Sie Phenol-Guanidin-Herstellung-Lösung (1 mL/10-cm-Platte mit 4 x 105 4 x 107 Zellen) direkt in der Gewebekultur-Platte. Hinweis: Phenol-Guanidin erfolgt ist eine monophasische Lösung, die RNS-Qualität hält während der Lyse der Zellen und DNA, RNA und Protein voneinander zu trennen. Achtung: Phenol und Guanidin Herstellung sind korrosiv. Verwenden Sie geeignete Schutzmaßnahmen.</li>
	<li>Pipettieren der Phenol-Guanidin erfolgt Lösungszelle Gemisch nach oben und unten mehrmals, um eine homogene Mischung zu machen. Hinweis: Phenol-Guanidin erfolgt Lösung lysate kann bei 4 ° C über Nacht oder bei-20 ° C bis zu einem Jahr aufbewahrt werden.</li>
	<li>Sammeln Sie jeden Zeitpunkt, nachdem die entsprechende Menge an Zeit vergangen ist in Schritte 2.3-2.6 beschriebene Methode verwenden.</li>
</ol>
3. Isolation von Gesamt-RNS von Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Lysate
<ol>
	<li>Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 5 min um die vollständige Auflösung der RNA-Protein-komplexe zu gewährleisten. Hinweis: Die Schritte des Protokolls Phenol-Guanidin erfolgt Lösung können bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.</li>
	<li>Stellen Sie Spike-Steuerelement-Transkripte, die mit der Methodik erkannt werden können.</li></ol>Führen Sie diese Steuerelemente in jede Probe in einer bekannten Menge und Konzentration. Hinweis: Die externen RNA Kontrolle Konsortium (ERCC) Spike-Steuerelement Mischung14 hat als ein Spike-Steuerelement RNA-FF wurde speziell für Es kann auch für Nordflecken oder Echtzeit-qPCR verwendet werden. Spike-in Steuerungen speziell für Microarray Technologien sind auch erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).
	<li>Übertragen Sie die Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Mischung zu einem 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer Pipette. Die Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Mischung für jeden 1 mL der Phenol-Guanidin Herstellung eingesetzte Lösung 0,2 mL Chloroform hinzufügen (z. B.0,3 mL Chloroform zu 1,5 mL Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Mischung hinzufügen).</li>
	<li>Schütteln Sie den Microcentrifuge Schlauch kräftig für 15 s und dann Mischung Chloroform-Phenol-Guanidin erfolgt bei Raumtemperatur 3 min inkubieren.</li>
	<li>Spin-Proben bei 12.000 X g 20 min bei 4 ° C. Hinweis: Nach der ersten Spin, sollte die Probe in 3 Schichten - eine rote organischen Schicht auf der Unterseite, ein weiß/rosa Interphase in der Mitte und einer klaren wässrigen Schicht auf der Oberseite (Abbildung 3) trennen.</li>
	<li>Übertragen Sie die wässrige Schicht auf einen neuen 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer Mikropipette. Hinweis: Achten Sie darauf, die Defiant während dieses Prozesses zu stören. Es ist okay, einige der wässrigen Fraktion zu verlassen. Es ist besser, einige der wässrigen Fraktion zu verlassen, als auch einige der Interphase Schichten, als auch die Interphase ausgedehnt Schicht die RNA mit DNA verunreinigen würde. Die wässrige Schicht werden die Hälfte des ursprünglichen Volumens, also etwa 0,9 mL etwa, wenn die Phenol-Guanidin erfolgt Lösung/Chloroform Mischung 1,8 mL war.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Interphase und organischen Fraktionen.</li>
	<li>Der wässrige Anteil ein gleiches Volumen von 2-Propanol hinzu und invertieren Sie die Röhre 10 Mal. Fügen Sie bis zu 1 µL 20 mg/mL wässrige Lösung von Glykogen pro 20 µL der Probe, vor allem, wenn die Ausbeute wird voraussichtlich niedriger sein, weil weniger als 106 Zellen gesammelt wurden. Hinweis: Dadurch wird eine Dichte, feste Pellet, das einfach nach den Spin-Schritten zu überwachen, die Folgen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
	<li>Spin-Proben bei 12.000 X g 20 min bei 4 ° C. Sicherstellen Sie, dass am Ende dieser Runde, die RNA ausgefällt hat, um einen weißen Pellet am unteren Ende der Röhre bilden.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Pipette und entsorgen Sie des Überstands besondere Sorgfalt nicht zu stören das weiße RNA-Pellet. Hinweis: Eine lose Pipettieren Spitze in der hand gehalten kann verwendet werden, um überschüssige Ethanol zu entfernen. Wenn die RNA-Pellet ist gestört, aber nicht verworfen, kann der Prüfer wiederholen Sie den Spin und überstand wieder entfernen. Vermeiden Sie verwerfen das Pellet, bedarf dies die Ermittler, den gesamten Vorgang wiederholen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung von 75 % Ethanol und 25 % Nuklease-freies Wasser. Fügen Sie 1 mL 75 % Ethanol pro 1 mL der Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Reagenz, das Pellet zu waschen.</li>
	<li>Spin-Proben bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Nach dem entfernen die meisten des Überstands, verwenden Sie ein pipettieren, um so viel Ethanol wie möglich zu entfernen, während noch kümmert sich nicht um die Pellets zu stören. Hinweis: Die RNA-Pellet ist bei diesem Schritt weniger kompakt und neigt zu bewegen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Umgang mit der Pellets zu diesem Zeitpunkt nicht zu verlieren die RNA.</li>
	<li>Drehen Sie Proben 12.000 X g für 2 min bei Raumtemperatur zu Pellets alle überschüssige Ethanol.</li>
	<li>Entfernen Sie alle überschüssige Ethanol aus dem Rohr mit einer Mikropipette kümmert sich um das Diabolo nicht zu stören.</li>
	<li>Lassen Sie die RNA-Pellet-Luft für 5 min trocknen.</li>
	<li>Die RNA-Pellet 50 µL Nuklease-freies Wasser hinzu und Aufschwemmen Sie das Pellet in der Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Behandlung von Proben mit 1 µL DNase (2 Einheiten/µL), DNA zu entfernen und dann inaktivieren DNase und kationen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>RNA-Proben in 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei-80 ° c aufbewahren</li>

4. Analyse der Abschrift Fülle
<ol>
	<li>Quantifizieren Sie, RNA und prüfen Sie RNA auf Reinheit mit einem Spektralphotometer. Hinweis: Das Verhältnis der Absorption bei 260 nm, 280 nm sollte ungefähr 2.0 für RNA.</li>
	<li>Analysieren Sie RNA mit einer 1 % Agarosegel oder eine gleichwertige Technologie, das Ausmaß der Schädigung zu visualisieren. Hinweis: Zwei klare Bands vertreten 18 s und 28 s rRNA sollte deutlich sichtbar (Abbildung 4). Wenn diese Bänder nicht sichtbar sind, kann die RNA beeinträchtigt werden. Trouble shooting Tipps für RNA-Abbau sind in der Diskussion zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Northern blots18oder Monitor Transkript Fülle in den gesammelten Aliquote RNA verglichen mit Pfennigabsatz in internen Standards mittels Microarrays15, RNA-Seq16, Echtzeit-qPCR17.
	<ol>
		<li>Bestimmen Sie die Hülle und Fülle für jedes Protokoll zu jedem Zeitpunkt im Vergleich mit einer Steuerung versetzt-in der bekannten Fülle. Hinweis: Für Microarrays werden die Werte Fluoreszenz-Intensitäten. Für Nordflecken können Bands auf dem Röntgenfilm quantifiziert werden. Für Echtzeit-qPCR kann durch Vergleich mit bekannten Standards mit der 2- σσC-T -Methode19Transkript Fülle bestimmt werden. Für RNA-Seq können als FPKM oder Fragmente pro Kilobase Exon pro million liest abgebildet normalisierte Werte ermittelt werden. Isoform-spezifische Verfall Preise können mit Isoform bewusst Methoden wie DEXSeq20RNA-Seq-Daten analysiert werden. Isoform-spezifische Verfall Preise richten sich am besten mit RNA-seq. Wenn sie mit Microarray Daten ermittelt werden sollen, müssen die Daten auf einer Sonde durch die Sonde Basis anstatt einer gen durch gen-Basis analysiert werden. Die Analyst muss bei der Interpretation der Informationen aus einer begrenzten Anzahl von Sonden aufpassen. Z. B. möglicherweise höchstens 5 Sonden, die über eine bestimmte Isoform informativ sind. In diesem Fall wird die Analyst benötigen, um festzustellen, ob das Verhalten von diese Sonden hinreichend konsistent ist, damit die Ergebnisse zuverlässig sind.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Führen Sie in Echtzeit qPCR auf der isolierten RNA17 in den gesammelten Proben analysieren rasch verfallenden Gene, wie c-Myc und ein langsam verfallenden gen wie GAPDH, Vertrauen zu gewinnen das Transkript-Zerfall, die Preise genau erfasst wurden. Hinweis: Für weitere Bestätigung Echtzeit qPCR Isoform-spezifischen Sonden können entwickelt und verwendet, um die Fülle an spezifische Isoformen über Zeit21überwachen.</li>
</ol>
5.Konstante Tariffindung Verfall
<ol>
	<li>Für jede Timepoint Log-Transformation die Fülle Werte für jedes Protokoll (Gen-spezifische oder Isoform-spezifisch). Hinweis: Log-Transformation werden die Werte exponentiellen Zerfall Kurven Linien konvertieren, die mit einem linearen Verfall Modell22passen können.</li>
	<li>Passen Sie der Ausdruck Profil für jedes Protokoll (Gen-spezifische oder Isoform-spezifische) zu einem linearen Verfall Modell. Die Formel für ein solches Modell ist f(t) = C - R * t. In dieser Gleichung C ist eine konstante, die eine Abschrift des Ausgangsbetrags darstellt, R ist der Rückgang und t ist die Zeit seit Beginn des Experiments. Aus dieser Gleichung bestimmen die Zerfallsrate als r*ln(10) (siehe Referenz-11). Hinweis: Die MaSigPro-Software-Paket ist eine Regression basierenden Ansatz entwickelt, um signifikante gen Ausdruck Profil Unterschiede in Zeit Kurs Daten23erkennen. Beispielcode und Ergebnisse für die MaSigPro stehen an: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>Gene, die eine Log-lineare Verfall Modellanpassung nicht herausfiltern. Dies kann mit einem ANOVA F-Test erreicht werden. Hinweis: der F-Test basiert auf der F-Statistik, definiert als die Variation zwischen Probe dividiert durch die Variation innerhalb der Proben. Korrigieren Sie die p-Werte für multiple Vergleiche durch die Anwendung der linearen step-up Benjamini und Hochberg false Discovery Verfahren24. Ein Q-Wert größer als 0,05 mit dem F-Test als eine Abkürzung für Gene verwendet werden kann, die kein Log-lineare Verfall Modell passen.</li>
	<li>Führen Sie einen ANOVA F-Test um Abschriften mit eine signifikante Wechselwirkung Laufzeit zwischen einem kategorischen Zellzyklus Zustand und die Zeit zu bestimmen (false Discovery Rate, FDR &#60; 0,05).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+reveals+multiple+pathways+for+unique+regulation+of+mRNA+decay+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).</li><li>Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes.">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).</li><li>Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+during+T+cell+activation:+alternate+regulation+of+mRNA+transcription+and+mRNA+stability.">Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability.</a> BMC Genomics. 6, 75 (2005).</li><li>Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decay+rates+of+human+mRNAs:+correlation+with+functional+characteristics+and+sequence+attributes.">Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes.</a> Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).</li><li>Hao, S., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+of+mRNA+influences+the+temporal+order+of+the+induction+of+genes+encoding+inflammatory+molecules.">The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules.</a> Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).</li><li>Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+description+of+cellular+quiescence.">A new description of cellular quiescence.</a> PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).</li><li>Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cap-to-tail+guide+to+mRNA+turnover.">The cap-to-tail guide to mRNA turnover.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).</li><li>Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highways+and+byways+of+mRNA+decay.">The highways and byways of mRNA decay.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).</li><li>Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+network+regulates+proliferative+timing+and+extracellular+matrix+synthesis+during+cellular+quiescence+in+fibroblasts.">A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts.</a> Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).</li><li>Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+degradation+controls+differentiation+state-dependent+differences+in+transcript+and+splice+variant+abundance.">mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance.</a> Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).</li><li>Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+changes+in+mRNA+stability+contribute+to+quiescence-specific+gene+expression+patterns+in+a+fibroblast+model+of+quiescence.">Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence.</a> BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).</li><li>Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=let-7+Overexpression+leads+to+an+increased+fraction+of+cells+in+G2/M,+direct+down-regulation+of+Cdc34,+and+stabilization+of+Wee1+kinase+in+primary+fibroblasts.">let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts.</a> J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).</li><li>Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+spike-in+standards+for+RNA-seq+experiments.">Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments.</a> Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).</li><li>Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gene+expression+measurements+from+commercial+microarray+platforms.">Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms.</a> Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Wong, M. L., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+for+mRNA+quantitation.">Real-time PCR for mRNA quantitation.</a> Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+splice+variants+using+real-time+PCR.">Quantification of splice variants using real-time PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).</li><li>Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+mammalian+gene+expression.">The kinetics of mammalian gene expression.</a> Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+false+discovery+rate:+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing.">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).</li><li>Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+globally+activates+microRNA+biogenesis.">Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).</li><li>Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+principles+of+mammalian+transcriptional+regulation+revealed+by+RNA+half-life.">Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).</li><li>Soeiro, R., Amos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+half-life+measured+by+use+of+actinomycin+D+in+animal+cells+-+A+caution.">mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).</li><li>Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+mRNA+decay:+methodologies,+pathways,+and+links+to+other+stages+of+gene+expression.">Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression.</a> J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+half-life+measurements+in+mammalian+cells.">Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).</li><li>Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+diversifies+post-transcriptional+regulation+by+selective+RNA-protein+interactions.">Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).</li><li>Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+isoform+half-lives+reveals+stabilizing+and+destabilizing+elements+in+yeast.">Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast.</a> Cell. 156 (4), 812-824 (2014).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+dynamics+of+microRNAs+revealed+by+a+novel+pulse-chase+approach.">Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach.</a> Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Stille kann durch externe Signale einschließlich Rücknahme Mitogene oder Serum, mangelnde Zelladhäsion und Kontakt Hemmung induziert werden. Kontakt-Hemmung, einer von mehreren möglichen Methoden zur Induktion der Ruhe, ist ein höchst evolutionär konservierte Prozess in dem Zellen der proliferativen Zellzyklus in Reaktion auf Zell-Zell-Kontakt beenden. Wir konzentrieren uns hier auf Kontakt Hemmung als Beispiel für eine Methode, um Ruhe zu induzieren. Frühere Studien haben berichtet, dass Zell-Zell-Kontakt MicroRNA Biogenese25beeinflussen kann, so die Ergebnisse Auskunft über eine Ruhe-Methode geben und weitere Studien erforderlich sind, um festzustellen, welche Änderungen mit Ruhe verbunden sind per se.
Wir verwendeten primären menschliche diploide Fibroblasten, die wir von Neugeborenen Haut isoliert. Wir initiierten diese Experimente mit Fibroblasten, die weniger als 10 mal passagiert wurden. Wir später-Passage Fibroblasten verworfen, weil sie Senesce. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf proliferierende und ruhende dermalen Fibroblasten, können die beschriebenen Verfahren verwendet werden, um Verfall Tarife in verschiedenen Arten von Zellen und unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen.
Wir überwachen mRNA Decay Preise genomweite mit einem Transkription Abschaltzeit Kurs. Abschaltzeit Kurse sind die am weitesten verbreitete Methode zur Entkopplung von mRNA Zerfall von mRNA-Transkription um mRNA Halbwertszeiten1,26zu berechnen. In der Methode beschriebenen ActD, ein Medikament, dass komplexe mit der B-Form der DNA zu blockieren, Dehnung der RNA-Polymerase II, wird verwendet, um die Transkription von mRNAs27zu verhaften. Die Rate, die Transkripte in Hülle und Fülle über einen 8-Stunden-Zeitraum verringern kann als das Transkript Zerfallsrate ermittelt werden.
Eine wichtige Einschränkung des ActD-basierte Ansätze für die Überwachung der Abschrift Verfall ist, dass ActD globale Transkription wird verhindert, dass die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken wird. Dies sollte im Auge behalten werden, bei der Interpretation ActD-basierte Daten, wie Zerfall Preise in Zellen festgelegt werden, die mehr als ihren Heimatstaat gestresst sind. Ein weiteres wichtiges Anliegen ist, dass die Auswirkungen des ActD für Zellen in verschiedenen Staaten, einschließlich der wuchernden versus Kontakt gehemmt Fibroblasten abweichen können. Ein Ansatz zur Minimierung der Nebenwirkungen des ActD-Behandlung ist Zeit Kurse kurzer Dauer zu halten. Aus diesem Grund haben wir einen 8 h Zeit Kurs ausgewählt.
Für die Überwachung der Abschrift Verfall Preise28,29gibt es alternative Ansätze ActD. Hefestämme mit temperaturempfindlichen RNA Polymerase II Allele wurden zur Abschrift Decay Rate30zu überwachen. Eine Abwandlung dieser Ansatz namens "Anker-away" wurde in der Hefe zur bedingten Abbau der RNA-Polymerase II als Reaktion auf Rapamycin Behandlung31,32zu erreichen. Es ist auch möglich, Zerfall in den Zellen mit aktive Transkription zu überwachen. Zum Beispiel Thio ersetzt Uracil Nukleotide können in Zellen eingebracht werden, mRNA eingearbeitet und anschließend erkannt33,34,35. Mit diesem Ansatz kann die Rate, an der verschiedene Transkripte synthetisiert werden, in Zellen ermittelt werden, die weiterhin mRNA synthetisieren. Solche Ansätze haben einen deutlichen Vorteil gegenüber ActD-Behandlung, weil sie nicht giftig sind. In unserer Erfahrung kann es jedoch Variabilität bei der Wiedergewinnung der Transkripte mit diesen Methoden. ActD-Behandlung ist eine einfache und reproduzierbare Ansatz für die Überwachung der Abschrift Verfall.
Ein paar Schritte in das Protokoll zur Verfügung gestellt sind entscheidend für ihren Erfolg. Ein wichtiges Thema ist RNA-Abbau während RNA Isolierung verhindert. Bei Schritt 4.1 sollte für den Abbau die RNA überwacht werden. Wenn die RNA nicht zwei klare Spitzen für 18 s und 28 s rRNAs (Abbildung 4) enthält, ist dies ein Zeichen, dass die Abschrift Verschlechterung eingetreten ist. Einige Geräte bieten RNA Integrität Anzahl (RIN) Noten von 1 bis 10. Proben mit RIN Noten im Bereich von 7 bis 10 sind akzeptabel für die weitere Analyse. Wenn die RNA abgebaut wird, ist es wichtig, weitere Vorkehrungen treffen, um zu verhindern, dass RNA-Abbau, wie sichergestellt wird, die Lösungen und Sterileware RNase-frei sind, und die Handschuhe sind beim Umgang mit RNA Pipetten. Wasser kann mit 0,1 % Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) für mindestens 2 h bei 37 ° C inkubiert vorbehandelt und autoklaviert für mindestens 15 min. beachten Sie nicht, dass DEPC mit Tris-basierte Puffer verwendet werden. RNase dekontaminierende Lösungen auch verwendet werden, können zu entfernen RNase von Arbeitsflächen, Zentrifugen, Pipetten und Reagenzien, die RNases hemmen kann Proben hinzugefügt werden.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Trennung der Phasen der Phenol-Guanidin-Herstellung-Lösung. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass nur die obere Phase für RNA gesammelt werden verarbeitet. Enthält die resultierende RNA residual Phenol, das Verhältnis der Extinktion bei 230, 260 und 280 nm werden nicht im Verhältnis 1:2:1 wie erwartet. Höher als erwarteten Extinktion bei 230 nm kann zeigen Phenol Belastung. In diesem Fall kann die RNA Ethanol wieder ausgefällt und zusätzliche mehrmals um jede verbleibende Phenol zu entfernen gewaschen.
Schließlich kann wenn die RNA pelleted und der Überstand wird entfernt, das Pellet klebrig, dünn und leicht gestört werden. An dieser Stelle ist es wichtig, besonders vorsichtig in die Flüssigkeit ausziehen. Es kann wichtig sein, visualisieren Sie das Rohr mit guter Beleuchtung zu lokalisieren das Pellet und stellen Sie sicher, dass sie nicht gestört wird. Zusätzliche Glykogen kann helfen, um sicherzustellen, dass die Pellets an dieser Stelle sichtbar ist.
Die Auswahl der Zeitpunkte für den zeitlichen Verlauf des Zerfalls ist auch ein wichtiges Thema zu berücksichtigen. Während der vier Zeitpunkte von die uns ausgewählten Decay für mehr als 10.000 Gene Kontrolle erlaubt, einige Gene nicht erheblich im Laufe 8 h Zeit zerfallen. Wenn kurzlebige Transkripte eine hohe Priorität sind, können die Ermittler weitere Musterkollektionen vor 120 min, zum Beispiel bei 30 min hinzufügen möchten. Für bessere Beurteilung der langlebigen Transkripte können die Ermittler weitere Musterkollektionen an späteren Zeitpunkten hinzufügen möchten.
Ein weiteres potenzielles Problem könnte wenn die Karies-Preise nicht die zu erwartende Verteilung folgen. Zum Beispiel gibt es möglicherweise zu viele oder zu wenige Gene zeigt einen Log-lineare Zerfall bewerten über 8 h. In diesem Fall ist es hilfreich, den Verfall Tarife von Genen zu überwachen, die bekannt sind, zu kurze oder langlebig sein, um festzustellen, ob sie das erwartete Muster folgen.Wenn Gene im Laufe der Zeit eine eher positive als negative Neigung aufweisen, können sie von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden, da sie keine Log-lineare Zerfallsrate erkennen lassen. Ein letztes Problem könnte auftreten, wenn die Zellen in den beiden verglichenen sehr unterschiedliche Antworten auf die ActD haben so, dass viele Gene schneller in einen Zustand verfallen. In diesem Fall kann es hilfreich sein, bezieht sich nicht nur auf die Differenz in Zerfallsrate zwischen den beiden Staaten, sondern auch auf die Spike-Steuerelemente, die wir vorschlagen, auch vor RNA-Isolierung, über absolute Verfall Preise in den beiden Staaten zu informieren.
Die Fähigkeit, Transkript Verfall Tarife proliferierende und ruhende Zellen oder irgendwelche zwei ähnliche Zustände zu überwachen hat das Potenzial, weiter Einblick in die Bedeutung der Niederschrift Verfall bei der Regulierung der physiologischer Veränderungen. Einsatzgebiete sind Zellen mit und ohne Onkogene Aktivierung, vor und nach der Seneszenz oder virale Infektion, mit und ohne Zuschlag eines bestimmten Gens oder in zwei verschiedenen Zuständen der Differenzierung. Die Ergebnisse können mit RNA-Seq, Informationen über Isoform-spezifische Steuersatzänderungen Transkript Verfall, die Einblick in die Veränderungen in Isoform Expression beobachtet, wie Zellen physiologischen Übergänge durchlaufen bieten können gekoppelt werden.

Steady-State widerspiegeln Protokolle den Beitrag der Abschrift Synthese und Transkript Verfall. Reguliert und koordiniert Transkript Zerfall ist ein wichtiger Mechanismus zur Steuerung von biologischen Prozessen1,2,3,4. Zum Beispiel wurden Transkript Verfall Preise gezeigt beizutragen, die zeitliche Abfolge der Ereignisse, die nach Aktivierung durch inflammatorische Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor5.
Wir haben bisher gezeigt, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe im primären menschlichen Fibroblasten mit Veränderungen in der Abschrift von vielen Genen6verbunden ist. Einige dieser Änderungen spiegeln Unterschiede in der Aktivität von Transkriptionsfaktoren zwischen diesen beiden Zuständen.
Änderungen in eine Abschrift Zerfallsrate können auch zu Änderungen bei der Ausdruck eine Abschrift in zwei verschiedenen Staaten7,8beitragen. Basierend auf unserer früheren Feststellungen, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe verbunden mit Veränderungen in der Höhe von mehreren RNAs9wir gefragt, ob es auch ein Beitrag von differenziellen Transkript Verfall in der Veränderung ist Genexpression in versus Ruhestrom Fibroblasten vermehren.
Um die Abschrift Stabilität zu überwachen, haben wir die Rate des Zerfalls der Transkripte genomweite in versus ruhenden Zellen wuchern festgestellt. Um dies zu erreichen, überwachen wir Verfall Preise im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten durch die Einführung eines Inhibitors der neue Transkription und Überwachung die Rate an die einzelnen Protokolle im Laufe der Zeit verschwunden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass im Vergleich zu Methoden, die einfach insgesamt Genexpression, überwachen, indem Sie neue Transkript-Synthese hemmen, werden wir in der Lage die Zerfallsrate für diese Protokolle getrennt von der Rate, mit der sie bestimmen transkribiert.
ActD Behandlung neue Transkription hemmen und Transkript Verfall Preise bestimmen wurde erfolgreich in mehreren früheren Studien angewendet. ActD wurde zur sezieren der Bedeutungdes der RNA-Stabilität in die Änderungen in Hülle und Fülle der Niederschrift, die von einer Behandlung mit Pro-inflammatorischen Zytokinen5ergeben. Ein ähnlicher Ansatz hat auch zur sezieren die Unterschiede im Transkript Zerfallsrate in versus differenzierten C2C12 Zellen wuchern, wie sie eine differenzierte Muskel Phänotyp10annehmen. Als weiteres Beispiel globale mRNA Halbwertszeiten auch in pluripotente erkannt wurden und differenzierte Maus embryonale Stammzellen-11. In diesen Beispielen nachweislich die mRNA Decay für die Regulierung der Abschrift Fülle und für den Übergang von Zellen in andere Zelle Staaten von Bedeutung sein.
Die nachfolgend beschriebenen Methoden anwenden, entdeckten wir Steuersatzänderungen Transkript Zerfall in ungefähr 500 Gene beim Vergleich von Fibroblasten in proliferierende und ruhende Staaten12. Insbesondere, entdeckten wir, dass die Ziele der MicroRNA MiR-29, die in ruhenden Zellen herunterreguliert, stabilisiert werden, wenn Zellen in Ruhe übergehen. Wir beschreiben hier die Methode verwendeten wir Zerfall in proliferierende und ruhende Zellen zu bestimmen. Diese Methode eignet sich für Zinsprodukten mRNA Zerfall in zwei unterschiedliche, aber ähnliche Bedingungen zu vergleichen, wenn Informationen über rasch verfallenden Genen gesucht wird. Es könnte auch verwendet werden, andere Fragen wie die Wirkung der Zelle Kulturbedingungen auf Transkript Zerfall, zum Beispiel in zweidimensional im Vergleich zu drei dimensionale Kulturen anzusprechen. Decay Rate können bestimmt genomweite mit Methoden wie Microarrays oder RNA-FF alternativ in Echtzeit qPCR oder Nordbeflecken kann verwendet werden, um Verfall auf gen-durch-gen oder Isoform von Isoform Basis zu bestimmen. Diese Sätze können dann verwendet werden, um die Halbwertszeit von jedem überwachten gen zu berechnen und Gene mit Verfall zu identifizieren, die in zwei Bedingungen unterschiedlich sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4&#176;C</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Equipment for running agarose gels</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Sterile tissue culture plates and conical tubes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-118</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">35-010-CV</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:291px;">Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td style="width:237px;">For decontaminating work surfaces from RNase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">2.0 ml eppendorf tubes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Trypsin-EDTA&#160; Solution 10X</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002-07-07</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:291px;">Sterile PBS</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-250</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Trizol</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15596018</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1410-2 mg</td>
			<td style="width:237px;">inhibits transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Sterile DMSO</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31-761-00ML</td>
			<td style="width:237px;">solvent for actinomycin D</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN19400225</td>
			<td style="width:237px;">MP Biomedicals, Inc product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2618500</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP28184</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0551</td>
			<td style="width:237px;">carrier for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:291px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1907</td>
			<td style="width:237px;">removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,&#160; inactivates DNA and removes divalent cations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Agarose</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN820721</td>
			<td style="width:237px;">MP Biomedicals, Inc product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Loading dye for RNA gel</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0641</td>
			<td style="width:237px;">suitable even for denaturing electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Millenium RNA markers</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
			<td style="width:237px;">RNA ladder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">One-color RNA Spike-in Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technology</td>
			<td style="width:119px;">5188-5282</td>
			<td style="width:237px;">Example spike-in control for Agient microarray analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Tris base</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade, for TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A38-500</td>
			<td style="width:237px;">for TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">EDTA</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td style="width:237px;">electrophoresis grade, for gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td style="width:237px;">for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4456740</td>
			<td style="width:237px;">Spike-in control for RNA Seq</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">RS-122-2101</td>
			<td style="width:237px;">for RNA Seq</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">96-well 0.3 ml PCR plate</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-0600</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Microseal B adhesive seals</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89094-662</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM12230</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SuperScript Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18090010</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining genome-wide transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts

Ruhe ist eine temporäre, reversibel in die Zellen Zellteilung aufgehört haben, aber weiterhin in der Lage zu vermehren. Mehrere Studien, einschließlich der unsrigen, haben gezeigt, dass Ruhe weitverbreitete Änderungen in der Genexpression zugeordnet ist. Einige dieser Veränderungen entstehen durch Veränderungen in der Ebene oder die Aktivität der Verbreitung-assoziierten Transkriptionsfaktoren, wie E2F und MYC. Wir haben bewiesen, dass mRNA Zerfall auch auf Veränderungen in der Genexpression zwischen proliferierende und ruhende Zellen beitragen kann. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren für die wuchernde und ruhende Kulturen der menschliche Vorhaut dermalen Fibroblasten. Wir beschreiben die Verfahren zur Hemmung der neue Transkription in proliferierende und ruhende Zellen mit Actinomycin D (ActD). ActD-Behandlung stellt einen einfache und reproduzierbaren Ansatz zu Wehre neue Transkription von Transkript Verfall dar. Ein Nachteil des ActD-Behandlung ist, dass der zeitliche Verlauf auf einem kurzen Zeitrahmen beschränkt sein muss, da ActD Zellviabilität auswirkt. Transkript-Spiegel sind im Laufe der Zeit zur Abschrift Zerfall bestimmen überwacht. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifikation von Genen und Isoformen, die differenzielle Zerfall im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten aufweisen.

Zuvor haben wir die Ergebnisse der Microarray Analysen der Abschrift Zerfall Sätze in wuchernden und Kontakt gehemmt primären menschlichen Fibroblasten über einen 8-Stunden-Kurs12berichtet. Eine Liste von Genen mit eine signifikante Veränderung im Transkript Stabilität Vergleich wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten dient in ergänzenden Tabelle1. Die Fluoreszenz-Intensitäten zum Zeitpunkt Null und über einen zeitlichen Verlauf nach ActD Behandlung stehen zur Verfügung. Gene wurden in die Liste aufgenommen, durch die Bestimmung der Gene, die deutlich unterschiedliche Steigungen im wuchernden und Kontakt gehemmt Bedingungen mit einem ANOVA F-Test haben. Beispiele von Genen mit unterschiedlichen Zerfall in proliferierende und ruhende Fibroblasten sind in Abbildung 5dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56423/56423fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Schaltplan des Protokolls für die Festlegung der wuchernden und Kontakt gehemmt Platten für Kurs Zeitanalysen ActD. Tag für Tag ist die erforderlichen Maßnahmen, um die Kulturen der Zellen für ActD Behandlung zu etablieren beschrieben unter der Annahme, dass vier Zeitpunkte für den zeitlichen Verlauf verwendet werden. Der Einfachheit halber eine Platte ist pro Timepoint gezeigt, aber Zusatzplatten zugesetzt werden, um biologische Wiederholungen zu erzeugen. Das Protokoll kann auch eingestellt werden, um mehr Platten Zellen hinzuzufügen, wenn mehr als vier Zeitpunkte gewünscht werden. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56423/56423fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56423/56423fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Schematische Darstellung des ActD zeitlichen Verlauf und Verfall bewerten Berechnungen in ruhenden im Vergleich zu den wuchernden menschlichen Fibroblasten. Der erwartete Anteil der mRNAs bleiben im Laufe der Zeit für eine hypothetische Abschrift nach Behandlung mit einem transkriptionelle Inhibitor angezeigt wird. Unten, Probeflächen des Bruchs der mRNA verbleibenden im Laufe der Zeit sind Gene, die stabiler sind vorgesehenen Ruhestrom als wuchernden Zellen und Gene, die stabiler im wuchernden als ruhende Zellen sind. Für jeden Datenpunkt wird aus Gründen der Übersichtlichkeit nur ein einzelner Wert angezeigt. In das eigentliche Protokoll werden drei Datenpunkte für jedes Timepoint. Diese Zahl wurde von Elizabeth Pender Johnsons Dissertation mit ihrer Zustimmung geändert. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56423/56423fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56423/56423fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Fotos von Phenol-Guanidin-Herstellung-Reagenz und Chloroform mischen vor und nach der Zentrifugierung. Die Mischung wird angezeigt wenn die Phenol-Guanidin-Herstellung-Reagenz und Chloroform zunächst, nach dem Mischen und nach Zentrifugation kombiniert werden. Nachdem die Mischung zentrifugiert wird, ist die untere Phase, die rot ist, die organische Phase. Die Interphase in der Mitte ist weiß und trübe. Die obere Phase ist die wässrige Phase und es ist klar. Die RNA ist in der wässrigen Phase, die mit einer Pipette zur Fällung gesammelt werden sollten. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56423/56423fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56423/56423fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Probe RNA Gel, RNS-Qualität zu überwachen. Eine Abbildung von einer RNA-Gel Proben mit intakten RNA zeigt. Intakte RNA hat prominente Bands für die 28 s und 18 s rRNAs. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56423/56423fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56423/56423fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : Beispiele von Genen mit unterschiedlichen Verfall Raten im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten. Fluoreszenz-Intensitäten (Genexpression) im Laufe der Zeit sind für vier Gene angezeigt, die anders in proliferierenden versus Ruhestrom Fibroblasten zerfallen. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56423/56423fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Tabelle1: Gen-spezifischen Fluoreszenz-Intensität im wuchernden und ruhenden Fibroblasten. Daten sind Kontakt gehemmt und zur Verfügung gestellt für Zeitlosigkeit und über einen zeitlichen Verlauf nach ActD Behandlung in proliferierenden Fibroblasten. P-Werte, Q-Werte und falsche Entdeckung Preise stehen zur Verfügung. Tabelle wird aus seiner ursprünglichen Veröffentlichung im BMC Genomics12abgedruckt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56423/Supplementary_Table_S1_080317.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts at JoVE.com

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Wir beschreiben ein Protokoll für die Generierung von wuchernden und ruhenden primären menschlichen dermalen Fibroblasten, Überwachung Transkript Verfall Preise und differentiell verfallenden Gene zu identifizieren.

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

determining-genome-wide-transcript-decay-rates-proliferating

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.1K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Wir beschreiben ein Protokoll für die Generierung von wuchernden und ruhenden primären menschlichen dermalen Fibroblasten, Überwachung Transkript Verfall Preise und differentiell verfallenden Gene zu identifizieren.

Serie: Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...