Wir danken Moustafa Saleh und Jay Tourigny für die kritische Lektüre des Manuskripts und Steven Hahn und Steven Henikoff für Mentoring und Unterstützung bei der Entwicklung von ChEC-seq und deren Anwendung beim Mediator-Komplex. SG wird unterstützt von NIH Zuschüsse R01GM053451 und R01GM075114 und GEZ wird von Indiana University Startup Fonds unterstützt.

1. Erzeugung von Hefe-Stämmen <ol><li> Generieren Sie einen Hefe-Stamm mit dem Faktor von Interesse mit MNase getaggt. <ol><li> PCR amplifizieren die MNase-Tagging-Kassette aus dem gewünschten Vektor ( Tabelle 1 ) unter Verwendung des spezifizierten Reaktionsgemisches ( Tabelle 2 ) und der Zyklusbedingungen ( Tabelle 3 ). Mischen Sie 5 μl der PCR-Reaktion und 1 μl 6X DNA-Beladungsfarbstoff. Führen Sie jedes PCR-Aliquot auf einem 0,8% Agarosegel bei 120 V für 40 min. Die erwartete Produktgröße beträgt ~ 2,3 kb. </li><li> Verwandeln Sie die verstärkte Markierungskassette mit der Standard-Lithiumacetattransformation 22 in die Dehnung der Wahl und führen Sie die Auswahl durch. </li><li> Überprüfen Sie die korrekte Integration der Tagging-Kassette mit der Kolonie-PCR. <ol><li> Bereiten Sie das angegebene Reaktionsgemisch ( Tabelle 4 ) für die Anzahl der zu untersuchenden Kolonien vor. Halten Sie auf Eis, bis nötig. </li><li> Wählen Sie einen Teil jeder Kolonie, um tes zu seinIn den Boden eines PCR-Röhrchens mit einem sterilen Zahnstocher oder Pipettenspitze. </li><li> Mikrowelle die gepflückten Kolonien bei hoher Leistung für 1 min. </li><li> Füge 50 μl PCR-Mischung ( Tabelle 4 ) zu jeder mikrowellengewundenen Kolonie hinzu und pipet auf und ab, um zu mischen. Durchführen der PCR unter Verwendung der angegebenen Zyklusbedingungen ( Tabelle 5 ). </li><li> Mischen Sie die 50 &amp; mgr; l PCR-Reaktion und 10 &amp; mgr; l 6X DNA-Beladungsfarbstoff direkt in jedem PCR-Röhrchen. Führen Sie 10 &amp; mgr; l jeder Probe auf einem 1% Agarosegel bei 120 V für 40 min. Die erwartete Produktgröße beträgt ~ 700 bp. HINWEIS: Wenn gewünscht, vergewissern Sie sich die entsprechende Expression des MNase-Fusionsproteins über Western-Blotting. Eine ~ 20,6 Kilodalton-Verschiebung im Molekulargewicht des markierten Proteins wird erwartet. </li></ol></li></ol></li><li> Generieren Sie einen freien MNase-Stamm durch Homologie-basierte Klonierung des Promotors des Gens von Interesse in pGZ136 (Tabelle 1) und Transformation und Selektion wie in Schritt 1.1.2. <ol><li> AlternatiUm den Promotor des Gens von Interesse und 3xFLAG-MNase-SV40 NLS in einen Plasmidvektor zu versetzen, zu transformieren und wie in Schritt 1.1.2 auszuwählen und den Stamm in der geeigneten selektiven Bedingung für die Aufrechterhaltung des Plasmids zu wachsen. </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> Am Nachmittag / Abend des Tages vor dem ChEC-Experiment inokulieren 3 ml Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) oder ein geeignetes selektives Medium mit einer einzigen Kolonie des Stammes, der den MNase-markierten Faktor trägt. Inkubieren Sie diese Kultur über Nacht (180 RPM Schütteln, 30 ° C). </li><li> Am Morgen des Tages des ChEC-Experiments verdünnen Sie die Übernachtkultur in 50 ml Medium auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) von 0,2 - 0,3. Inkubieren Sie diese Kultur (180 RPM Schütteln, 30 ° C), bis sie eine OD 600 von 0,5-0,7 erreicht. Wenn sich die Kultur der entsprechenden OD 600 nähert, setzen Sie den Wärmeblock oder das Wasserbad auf 30 ° C und beginnen mit dem Auftauen von Puffer A-Additiven ( Ta6). </li><li> 5 ml Puffer A plus Additive ( Tabelle 6 ) pro Kultur vorbereiten. Halten Sie den Puffer A bei RT während des Vorgangs. </li><li> Bereiten Sie Mikrofugenröhrchen vor, die 90 μl Stopplösung ( Tabelle 7 ) und 10 μl 10% SDS für jeden zu sammelnden Zeitpunkt enthalten. Für jeden neuen Faktor analysiert, nehmen Sie Proben bei 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min und 10 min. </li><li> Dekantische Kultur in ein 50 ml konisches Röhrchen geben und bei 1.500 xg und Raumtemperatur (RT) für 1 min zentrifugieren. </li><li> Die Zellen in 1 ml Puffer A sorgfältig resuspendieren und die resuspendierten Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Pellet resuspendierte Zellen in einer Mikrofuge bei 1.500 xg und RT für 30 s. </li><li> Absaugen des Überstandes und sorgfältige Resuspendierung der Zellen in 1 ml Puffer A durch Pipettieren auf und ab. Pellet resuspendierte Zellen in einer Mikrofuge bei 1.500 xg und RT für 30 s. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. </li><li> Die Zellen in 570 μl Puffer A sorgfältig resuspendieren. 30 μl 2% Digitonin geben(0,1% Endkonzentration), um die Permeabilisierung der Zellen zu erleichtern und zu mischen. </li><li> Permeabilisieren von Zellen in Hitzeblock oder Wasserbad bei 30 ° C für 5 min. </li><li> Pipet die Reaktion auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Entfernen Sie ein 100 &amp; mgr; l Aliquot von permeabilisierten Zellen als Negativkontrolle zu einem Mikrofugenröhrchen, der Stopplösung und SDS enthält (Schritt 2.4) und vortexen, um kurz zu mischen. </li><li> Füge 1,1 μl 1 M CaCl 2 (2 mM Endkonzentration) zu permeabilisierten Zellen hinzu, um MNase zu aktivieren und mehrmals schnell umzukehren oder kurz zu mischen. Sofort die gemischte Reaktion bei 30 ° C zurückgeben und einen Timer starten. </li><li> Zu jedem Zeitpunkt, der gesammelt werden soll, pipettieren Sie die Reaktion nach oben und unten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, und entfernen Sie dann ein 100 &amp; mgr; l Aliquot von permeabilisierten Zellen zu einem Mikrofugenröhrchen, der Stopplösung und SDS enthält, und kurz vor dem Mischen vorwischen. Für jeden neuen Faktor analysiert, nehmen Sie 0 s (kein CaCl 2 hinzugefügt), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min und 10 min zeitpunkte. HINWEIS: ChEC-Experimente mit Faktoren, die schnell DNA bei 30 ° C spalten, können bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt werden, um die MNase-Spaltkinetik zu verlangsamen. </li><li> Sobald alle Zeitpunkte gesammelt wurden, fügen Sie 4 μl 20 mg / ml Proteinase K zu jeder Probe hinzu, werden vor kurzem zu mischen und bei 55 ° C für 30 min inkubieren. </li><li> 200 μl 25: 24: 1 Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol zu jeder Probe geben, kräftig mischen und mit maximaler Geschwindigkeit und RT in einer Mikrofuge 5 min zentrifugieren. </li><li> Entfernen Sie jede wässrige Phase (~ 150 μL) in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 30 μg Glykogen und 500 μl 100% Ethanol hinzu. Vortex kräftig zum Mischen und Ausfällen auf Trockeneis für 10 min oder bis die Lösung viskos ist. </li><li> Pellet präzipitierte DNA mit maximaler Geschwindigkeit und 4 ° C in einer Mikrofuge für 10 min. </li><li> Dekantierte Überstände und Waschpellets mit 1 ml RT 70% Ethanol. </li><li> Dekantisches Ethanol, Entfernen des Restes durch Invertieren einesIch schlage die Röhren auf ein Papiertuch. Die Proben mit einer Tischzentrifuge kurzspülen und eine Pipette verwenden, um restliches Ethanol zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird. Lufttrockenpellets bei RT für 5 min. </li><li> Während die Pellets trocknen, machen Sie eine Mastermischung, um die getrockneten Pellets in 29 &amp; mgr; l Tris, pH 8,0 + 1 &amp; mgr; l von 10 mg / ml RNase A, erneut zu resuspendieren. Digit RNA bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Mischen Sie 1 &amp; mgr; l 6X DNA-Beladungsfarbstoff mit 5 &amp; mgr; l jeder Probe und laufen auf einem 1,5% Agarosegel bei 120 V für 40 min. </li></ol> 3. Größenauswahl ANMERKUNG: Das Ziel der Größenauswahl besteht darin, Multi-Kilobase-Fragmente von genomischer DNA aus der zu sequenzierenden Probe zu entfernen und Fragmente von ~ 150 bp (etwa die Größe der nukleosomalen DNA) oder kleiner zu bereichern. Bei Sequenzierungsdaten werden Fragmente &lt;400 bp angereichert, mit einem bemerkenswerten Peak um die Größe der nukleosomalen DNA (~ 150 bp) und einer Peak- oder breiten Verteilung von subnukleosomalen Fragmenten. &lt;Ol&gt; <li> Zu jeder Probe werden 75 μl Festphasen-Reversible Immobilisierungs- (SPRI) Perlen in einer Polyethylenglykol (PEG) -Lösung 23 gegeben und 10-fach pipettiert. Inkubieren der Perle: DNA-Mischung bei RT für 5 min. </li><li> Während der SPRI-Perleninkubation werden Mikrofugenröhrchen, die 96 μl 10 mM Tris, pH 8,0 und 4 &amp; mgr; l 5 M NaCl für jede Probe enthalten, hergestellt. </li><li> Legen Sie die Röhrchen in eine magnetische Zahnstange, um Perlen auf der Seite des Rohres zu sammeln. Lassen Sie die Perlen auf der Seite des Tubus für 2 min zu sammeln. </li><li> Übertragen Sie jeden Überstand in ein neues Röhrchen, das Tris und NaCl enthält (Schritt 3.2). </li><li> Zugabe von 200 &amp; mgr; l 25: 24: 1 Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol zu jeder Probe, Vortex zum Mischen und Zentrifugieren mit maximaler Geschwindigkeit und RT in einer Mikrofuge für 5 min. </li><li> Entfernen Sie jede wässrige Phase zu einem neuen Röhrchen. Fügen Sie 30 μg Glykogen und 500 μl 100% Ethanol hinzu. 2 Minuten auf Trockeneis abfließen lassen oder bis die Lösung viskos ist. </li><li> Pellet präzPitierte DNA mit maximaler Geschwindigkeit und 4 ° C in einer Mikrofuge für 10 min. </li><li> Dekantüberstand und Waschpellets mit 1 mL 70% igem Ethanol. </li><li> Dekantes Ethanol, Entfernen des Restes durch Umkehren und sanftes Klopfen der Rohre auf ein Papiertuch. Die Proben mit einer Tischzentrifuge kurzspülen und eine Pipette verwenden, um restliches Ethanol zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird. Lufttrockenpellets bei RT für 5 min. </li><li> Restenzen der getrockneten Pellets in 25 μl Tris, pH 8,0. Bestimmen Sie die Probenkonzentration mit einem hochempfindlichen Assay. Für TF-ChEC-Experimente werden 10-100 ng DNA nach der Größenauswahl routinemäßig gewonnen. </li><li> Bereiten Sie Sequenzierungsbibliotheken vor. Bibliotheksvorbereitungsprotokolle, die nicht auf die Größenauswahl angewiesen sind, wie zuvor beschrieben, sind wünschenswert, um eine Sequenzierung eines großen Bereichs von Fragmentgrößen (25-500 bp) zu ermöglichen. </li><li> Sequenzbibliotheken im gepaarten Endmodus. Mindestens 25 Basen der Sequenz auf jedem Ende wird für eine hohe Qualität gelesenKartierung. Zwischen 1 und 2 Millionen Lesungen bietet eine ausreichende Deckung für eine ChEC-Probe. HINWEIS: Die Analyse von ChEC-seq Daten ist ein komplexes Verfahren und über den Rahmen dieses Artikels hinaus. Detaillierte Informationen zur Datenanalyse finden Sie in den vorherigen Publikationen 1 , 21 und die für die Analyse verwendeten benutzerdefinierten Skripte sind auf GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq) verfügbar. HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kann auch für die Befehlszeilenanalyse von ChEC-seq-Daten verwendet werden. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila.">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li><li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells.">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben gezeigt, dass ChEC verschiedene Klassen von Hefeproteinen auf Chromatin abbilden kann und antizipieren, dass es breit auf verschiedene Familien von TFs und anderen chromatinbindenden Faktoren in Hefe anwendbar sein wird. ChEC-seq ist insofern vorteilhaft, als es keine Vernetzung, Chromatin-Solubilisierung oder Antikörper erfordert. So vermeidet ChEC Artefakte, die potentiell in X-ChIP-seq vorhanden sind, wie das hyper-ChIPable Artefakt 3 , 4 und nativ...

Die Abbildung der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren (TFs), Chromatin-Remodelern und anderen chromatin-assoziierten regulatorischen Faktoren ist der Schlüssel zum Verständnis aller chromatinbasierten Prozesse. Während Chromatin-Immunpräzipitation und High-Throughput-Sequenzierung (ChIP-seq) Ansätze verwendet wurden, um viele wichtige Einblicke in die Genom-Biologie zu gewinnen, haben sie bemerkenswerte Einschränkungen. Wir haben vor kurzem eine alternative Methode eingeführt, die als Chromatin-endogene Spaltung und High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) 1 bezeichnet wird, um diese Nachteile zu umgehen. ChIP-seq wird am häufigsten mit einem anfänglichen Formaldehyd-Vernetzungsschritt (X-ChIP-seq) durchgeführt, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erhalten. Eine Reihe neuerer Studien haben jedoch gezeigt, dass X-ChIP-seq transiente oder unspezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen 2 , 3 , 4 , 5 &lt;einfängtSup&gt;, 6 , 7 , 8 , was zu falsch-positiven Bindungsstellen führt. Darüber hinaus schützt die Beschallung, die gewöhnlich verwendet wird, um Chromatin in X-ChIP-seq-Experimenten zu zersplittern, vorzugsweise Regionen von offenem Chromatin, was zu einer voreingenommenen Rückgewinnung von Fragmenten aus diesen Regionen 9 , 10 führt . Sonate liefert auch eine heterogene Mischung von Fragmentlängen, die letztlich die Bindungsstellenauflösung begrenzt, obwohl die Zugabe eines Exonuklease-Verdauungsschrittes die Auflösung 11 , 12 stark verbessern kann . Native ChIP-Verfahren wie besetzte Regionen von Genomen aus affinitätsgereinigtem natürlich isoliertem Chromatin (ORGANIC) 13 verwenden keine Vernetzung und Fragmentchromatin mit Mikrokokken-Nuklease (MNase), wodurch die mit der Formaldehydvernetzung und der Ultraschallbehandlung verbundenen potentiellen Biasen vermieden werden. Aber,Die Löslichkeit vieler chromatingebundener Proteine ​​unter den relativ milden Bedingungen, die für die native Chromatinextraktion erforderlich sind, ist schlecht, was möglicherweise zu einem verminderten Dynamikbereich und / oder falschen Negativen führt 14 . Während verschiedene Iterationen von ChIP-seq am häufigsten für die genomweite Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen verwendet werden, wurden auch mehrere Mapping-Techniken, die auf der Fusion von Proteinen interessiert sind, die für verschiedene DNA-modifizierende Enzyme von Interesse sind, implementiert. Ein solcher Ansatz ist die DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifizierung (DamID) 15 , wobei ein interessantes chromatinbindendes Protein genetisch an Dam verdünnt ist und diese Fusion in Zellen oder Tieren exprimiert wird, was zu einer Methylierung von GATC-Sequenzen proximal zu Bindungsstellen für das Protein führt. DamID ist insofern vorteilhaft, als sie sich nicht auf Immunpräzipitation beruft und so Vernetzungsmittel, Antikörper oder Chromatin-Solubilisierung vermeidet. Es wird auch in vivo durchgeführt. aberIst die Auflösung von DamID auf die Kilobase-Skala beschränkt und die Methylierungsaktivität des Dam-Fusionsproteins ist konstitutiv. Eine zweite Methode, die auf einer enzymatischen Fusion basiert, ist die Calling Card-Seq 16 , die eine Fusion von einem Faktor von Interesse für eine Transposase einsetzt und die ortsspezifische Integration von Transposonen leitet. Wie DamID, Calling Card-Seq ist nicht auf Immunpräzipitation basiert und hat somit ähnliche Vorteile, mit dem zusätzlichen Vorteil einer erhöhten Auflösung. Jedoch kann Calling Card-seq durch Sequenzvorspannungen von Transposasen begrenzt werden und ist auch auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen in der Nähe von Transposon-Insertionsstellen angewiesen. Eine dritte enzymatische Fusionsmethode, die im Laemmli-Labor entwickelt wurde, ist die Chromatin-endogene Spaltung (ChEC) 17 . In ChEC wird eine Fusion zwischen einem Chromatin-assoziierten Protein und MNase in Zellen exprimiert, und bei der Calciumzugabe zur Aktivierung von MNase wird die DNA proximal zu den Bindungsstellen für die markierten markiertFaktor ( Abbildung 1 ). In Verbindung mit dem Southern-Blotting wurde ChEC verwendet, um die Chromatinstruktur und die Proteinbindung an einer Anzahl von einzelnen Loci in Hefe 17 , 18 zu charakterisieren, und wurde mit einer niederauflösenden Mikroarrayanalyse kombiniert, um die Wechselwirkung von Kernporenkomponenten mit der Hefe zu untersuchen Genom 19 ChEC bietet Vorteile wie DamID und Calling Card-seq, und seine Auflösung ist fast ein-Basis-Paar, wenn durch die Primer-Erweiterung 19 analysiert. ChEC ist auch kontrollierbar: Die robuste DNA-Spaltung durch MNase hängt von der Zugabe von millimolarem Calcium ab, wobei sichergestellt wird, dass MNase bei den niedrigen freien Calciumkonzentrationen, die in lebenden Hefezellen beobachtet werden, inaktiv ist. Bisher haben wir postuliert, dass die Kombination von ChEC mit High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) hochauflösende Karten von TF-Bindungsstellen bereitstellen würde. In der Tat, ChEC-seq erzeugte hochauflösende Karten der angehenden Hefe allgemeine regulatorische Faktoren (GRFs) Abf1, Rap1 und Reb1 über das Genom 1 . Wir haben auch ChEC-seq auf den modularen Mediator-Komplex angewendet, einen konservierten, essentiellen globalen Transkriptions-Coaktivator 21 , der die Anwendbarkeit von ChEC-seq auf Megadalton-Komplexe erweitert, die nicht direkt mit DNA in Berührung kommen und durch ChIP- Basierte Methoden. ChEC-seq ist eine leistungsstarke Methode sowohl für die unabhängige Validierung von ChIP-seq-Ergebnissen als auch für die Erstellung neuer Einblicke in die Regulierung von Chromatin-residenten Prozessen. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Umsetzung dieser Methode in knospende Hefe vor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">dNTPs</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0447</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0491L</td>
			<td>Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10488085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td style="width:159px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0273L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:307px;">cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11836170001</td>
			<td>It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">PMSF</td>
			<td style="width:159px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC215740010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Digitonin, High Purity</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">300410-250MG</td>
			<td>Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Proteinase K, 20 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">RNase A, 10 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Ampure XP beads</td>
			<td style="width:159px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">MagneSphere magnetic rack</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide mapping of protein-dna interactions with chec-seq in saccharomyces cerevisiae

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ist entscheidend für das Verständnis der Genregulation, des Chromatin-Remodelings und anderer Chromatin-residenten Prozesse. Die Formaldehydvernetzung, gefolgt von Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (X-ChIP-Seq), wurde verwendet, um viele wertvolle Einblicke in die Genombiologie zu gewinnen. Allerdings hat X-ChIP-seq bemerkenswerte Einschränkungen im Zusammenhang mit Vernetzung und Beschallung. Native ChIP vermeidet diese Nachteile durch Weglassen der Vernetzung, führt aber oft zu einer schlechten Wiederherstellung von chromatingebundenen Proteinen. Darüber hinaus unterliegen alle ChIP-basierten Methoden Antikörperqualitätsüberlegungen. Enzymatische Methoden zur Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen, die die Fusion eines Proteins von Interesse für ein DNA-modifizierendes Enzym beinhalten, wurden ebenfalls verwendet, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zuzuordnen. Wir haben vor kurzem eine solche Methode kombiniert, Chromatin endogene Spaltung (ChEC), mit High-Throughput-Sequenzierung als ChEC-seq. ChEC-seq beruht auf der Verschmelzung eines Chromatin-Assors(MNase), um eine zielgerichtete DNA-Spaltung in Gegenwart von Calcium in lebenden Zellen zu erzeugen. ChEC-seq basiert nicht auf Immunpräzipitation und umgibt damit potenzielle Bedenken bei der Vernetzung, Beschallung, Chromatin-Solubilisierung und Antikörperqualität bei gleichzeitiger hochauflösender Zuordnung mit minimalem Hintergrundsignal. Wir stellen uns vor, dass ChEC-seq ein mächtiges Gegenstück zu ChIP sein wird, das ein unabhängiges Mittel bietet, um sowohl ChIP-seq-Befunde zu validieren als auch neue Einblicke in die genomische Regulierung zu entdecken.

Im Falle eines erfolgreichen ChEC-Experiments zeigt die Analyse von DNA durch Agarose-Gelelektrophorese eine Calcium-abhängige Zunahme der DNA-Fragmentierung über die Zeit, wie durch Verschmieren und eventuelle vollständige Verdauung der genomischen DNA angezeigt wird. In einigen Fällen wird eine Leiter von Bändern ähnlich wie bei einer traditionellen MNase-Verdauung nach längerer Verdauung beobachtet. Dies ist der Fall für die ChEC-Analyse von Reb1, einem allgemeinen regulatoris...

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Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

11.0K Aufrufe.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen. 

Serie: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Forschung

Genetik

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...