Diese Publikation möglich wurde durch die Finanzierung von Grant T32ES019851 (zu C. Fritsch), gewähren, R01AG054641 und AFAR junge Ermittler (M. Vermulst).

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance.">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li><li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für die Vorbereitung der C-Seq-Bibliotheken für den Nachweis von Übertragungsfehler in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans. Dieses Protokoll hat zahlreiche Vorteile gegenüber bestehenden Protokolle sowie alternative Verfahren.
In den letzten 15 Jahren wurden zahlreiche Reporter-Systeme entwickelt, die auf Luciferase7,8 oder Cre Lox Rekombination3,4,15,21 , Transkription zu erkennen Fehler. Dieser Reporter-Systeme wurden von unschätzbarem Wert für Forscher Verständnis der transkriptionellen Treue, weil sie erlaubt, Gene, Allele und molekularen Mechanismen identifiziert werden, die direkt die Treue der Transkription regulieren. Allerdings melden sie sich nur auf Fehler in künstlich beschädigte Vorlagen oder in sehr spezifischen genetischen zusammenhängen, welche Grenzen der wissenschaftlichen Fragen, die sie beantworten können. Ein wichtiger Vorteil des C-Seq-Protokolls ist, dass er überwacht die Treue der Transkription während der gesamten Transkriptom5, stark expandierenden die wissenschaftliche Erkenntnisse der Genauigkeit mit der genetischer Information zum Ausdruck kommt. Zweitens, weil die C-Seq-Assay RNA als seine Quellen nutzt, ist es wahrscheinlich, dass jeder Organismus Wahl, vermieden die Notwendigkeit, komplizierte Reporter Konstrukte für jedes transgenen Modell generieren dieser Assay angepasst werden kann. Dieses Protokoll hat auch Vorteile gegenüber bestehenden massiv parallelen Sequenzierung Ansätze17,22. Vor allem machen die meisten dieser Ansätze von Schwermetallen, Fragment RNA-Bibliotheken verwenden. Jedoch stellen diese Fragmentierung Methoden Artefakte in der RNA, die von wahren Transkription Fehler5nisht zu unterscheidend sind. Um dieses Problem zu lösen, dieses Protokoll Fragmente RNA enzymatisch mit RNase III, die den zusätzlichen Vorteil hat, dass es kompatibel Enden für selbständige Ligatur Blätter, stark vereinfacht RNA Circularization und Erhöhung der Empfindlichkeit des Assays ~ 10-divisibel.
Zur gleichen Zeit hat die C-Seq-Assay seinen eigenen Anteil an Grenzen. Erstens, obwohl der Test Übertragungsfehler während der gesamten Genoms misst, tendenziell eine große Komponente der Daten abgeleitet werden Gene, die stark zum Ausdruck kommen, wie Abschriften von diesen Genen sind in der Regel die meisten RNA-Bibliotheken zu dominieren. Ein weiterer Faktor, der die Analyse in Richtung stark exprimierten Genen verzerrt ist die Schwelle, gebaut in der Bio-Informatik Pipeline, die genetischen Mutationen und RNA Bearbeitung Veranstaltungen von Störfaktoren die endgültigen Maße verhindert. Diese Schwelle schreibt vor, dass nur die Grundlagen, die 20 Mal oder öfter sequenziert wurden für die endgültige Analyse verwendet werden können. Eine zweite Einschränkung betrifft Bibliothek Vielfalt. Wie die meisten Kits für die RNA-Extraktion verwendet reinigt das Kit hier nicht effizient kleine RNA-Moleküle, die begrenzt die Anzahl der Lesevorgänge Moleküle synthetisiert durch RNAP III abgeleitet. Die Vielfalt der endgültigen Sequenzierung Bibliothek wird weiter durch die mRNA Reinigungsstufe hier beschäftigt begrenzt. Auch wenn Moleküle erzeugt durch RNAP ich effizient sein kann, die meisten der restlichen mitochondriale RNAs sequenziert sind tRNAs und nicht-kodierende RNAs verloren bei diesem Schritt. Diese Moleküle mehr häufig ein anderes Set, das speziell kleine RNA-Moleküle reinigt sollte verwendet werden, oder Zelltypen sollten gezielt erfassen, die für diese Moleküle angereichert sind. Bitte beachten Sie aber, dass die meisten dieser Probleme durch Sequenzierung tiefer als üblich oder gleichzeitig Sequenzierung der DNS aus den gleichen Zellen gelöst werden können, obwohl beide diese Lösungen eine größere finanzielle Investition von den Ermittlern erfordern.
Darüber hinaus werden zukünftige technologische Entwicklungen balanciert, um C-Seq-Assay auf einer grundlegenden Ebene zu verbessern. Beispielsweise wird durch Verlängerung der Lese-Länge des bestehenden Sequenzierungstechnologie, Sequenz längere Moleküle, möglich, d.h. mehr Wiederholungen verwendet werden, um die Treue der Transkription zu ermitteln. Solche Verbesserungen führt automatisch eine größere Tiefe der Sequenzierung und eine Erhöhung des Anteils der Lesevorgänge, die für die nachgelagerte Analyse verwendet werden können. Ein ähnliches Argument kann für jede Sequenzierungstechnologie erfolgen, die für mehr Moleküle parallel sequenziert werden können. Darüber hinaus müssen noch zahlreiche Komponenten des C-Seq-Assays optimiert werden, einschließlich die Effizienz der RNA-Circularization, die Stringenz der Größenauswahl und zeitraubende Natur des Tests selbst. Zu guter Letzt ist es dringend empfohlen, alle Benutzer Zugang zu einem engagierten, hoch empfindliche Tool für Nukleinsäure-Analyse und mögliche Fehlerbehebung erhalten (siehe Tabelle der Materialien). Ohne dieses Tool kann es äußerst schwierig zu bestimmen, zu welchem Zeitpunkt potentielle Probleme entstehen, wodurch es ihnen unmöglich, zu beheben.
Obwohl das gesamte Protokoll ziemlich nachtragend ist (kleine Fehler sind in der Regel erhebliche Konsequenzen haben), gibt es mehrere Schritte, die absolut entscheidend für den Erfolg des C-Seq-Assays sind. Eine der wichtigsten Voraussetzungen ist, dass die isolierte RNA so schonend wie möglich behandelt wird. Die meisten Methoden der RNA-Extraktion und downstream-Processing-Kits kümmern sich wenig um die chemische Zusammensetzung von der RNA über grundlegende Industriestandards, was für die meisten Molekulare Analysen ausreichend ist. Jedoch ist die C-Seq-Assay beauftragt, bei der Ermittlung eines einzigen Transkription Fehlers unter Hunderten von Tausenden von WT Basen, erhöht die Notwendigkeit zur molekularen Stressreduktion. Auch Stress, der sich nur 1 in 10.000 Basen auswirkt kann Artefakte einzuführen, die die Ergebnisse vollständig ungültig. Zum Beispiel Benutzer müssen nie vermeiden/Expose der RNA zu jeder Temperatur über 65 ° c limit Zweitens muss jeder Benutzer den Zeitaufwand für die RNA-Fragmentierung mit RNase III sorgfältig optimieren. Es ist absolut entscheidend für den Erfolg des Tests, dass die endgültige Moleküle ca. 60 – 80 Basen in der Länge sind. Kürzere Moleküle können schwierig sein, das Genom zuordnen, und längere Moleküle werden nicht zulassen, für 3 unabhängige Wiederholungen innerhalb eines 250 bp lesen sequenziert werden. Zu guter Letzt empfiehlt es sich nicht zum Einfrieren und Auftauen der RNS mehr als einmal während des gesamten Protokolls. Stattdessen die RNA zu isolieren und die cDNA an einem einzigen Tag zu synthetisieren. Wegen der Zeit und Aufwand mit dieser Verpflichtung, die Komplexität des Kyoto-Protokolls und die Anzahl der Samples, die häufig gleichzeitig verarbeitet werden, empfiehlt es sich, dass zwei Ermittlern zusammenarbeiten, um diese Bibliotheken zu generieren.
Wenn erfolgreich, werden diese Experimente genau Übertragungsfehler in jedem Organismus unter allen experimentellen Bedingungen erkennen ermöglichen. Zum Beispiel durch Kontrolle und erkrankten Personen miteinander vergleichen, so kann es sein möglich festzustellen, ob bestimmte Krankheiten Übertragungsfehler, zugeordnet sind, die eine neue Komponente der Ätiologie von zahlreichen menschlichen Krankheiten aufdecken kann. Andere Parameter, die sondiert werden könnten, sind organismal Altern, Ernährung, Genotyp und Umweltfaktoren wie Belastung durch giftige Chemikalien. Darüber hinaus da dieser Test Übertragungsfehler während das Transkriptom erkennt, ermöglicht es Forschern, die verschiedenen Mechanismen, die die Treue der RNA-Polymerase ich, II und III sowie die mitochondriale RNA-Polymerase beitragen, zu zergliedern. Dementsprechend erwarten wir, dass dieses Protokoll sich ein neues Feld der Mutagenese, weit verbreitete experimentieren öffnet, zeichnet sich durch das Studium der Mutationen in RNA und nicht in der DNA.

Das Genom enthält eine genaue biologische Bauplan des Lebens. Um dieses Konzept richtig zu implementieren, ist es wichtig, dass das Genom mit großer Präzision transkribiert werden. Transkription ist jedoch unwahrscheinlich, fehlerfrei zu sein. Z. B. RNA-Polymerasen sind seit langem bekannt, fehleranfällige in-vitro-1,2, und es wurde kürzlich gezeigt, dass sie Fehler in Vivo begehen sowie3,5,6, besonders bei der Konfrontation mit DNA-Schaden7,8,9,10. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass Übertragungsfehler auftreten kontinuierlich in allen lebenden Zellen, was darauf hindeutet, dass sie eine potente Quelle für mutierte Proteine sein könnte.
Dabei bezeichnet transkriptionelle Mutagenese, unterscheidet sich von klassischen Mutagenese in zweierlei Hinsicht. Erstens im Gegensatz zu genetischen Mutationen, Übertragungsfehler mitotische und Post-mitotische Zellen beeinflussen, wie sie DNA-Replikation nicht abhängen. Die Mechanismen, die die Treue der Transkription auswirken wird, daher wertvolle Einblicke in die Mutation Last der mitotischen und Post-mitotischen Zellen bereitstellen. Interessanterweise, Übertragungsfehler haben vor kurzem bei der Förderung von Protein Aggregation11,12,13 in Verbindung gebracht und haben beide Karzinogenese10 Beitrag zur vermutet worden und die Entwicklung der Antibiotika-Resistenz bei Bakterien14.
Zweitens sind im Gegensatz zu genetischen Mutationen, Übertragungsfehler vorübergehend in der Natur. Ihre temporäre Existenz ist besonders anspruchsvoll, da dadurch Übertragungsfehler überaus schwer zu erkennen. Zum Beispiel während verschiedenen Laboren wertvolle Reporter Assays für die Untersuchung der transkriptionellen Mutagenese geplant haben, können diese Tests nur Übertragungsfehler in einer begrenzten Anzahl von Kontexten und Modell Organismen4,15messen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben viele Forscher RNA Sequenzierung Technik (RNA-Seq) verwandelt, die theoretisch Übertragungsfehler während das Transkriptom Art aufgezeichnet werden können. Diese Studien sind jedoch leicht durch Bibliothek Bau Artefakte, z. B. reverse Transkriptionsfehler, PCR-Amplifikation Fehler und die fehleranfällige Art der Sequenzierung selbst verwechselt. Z. B. begehen Reverse Transcriptases etwa ein Fehler jeden ~ 20.000 Basen, während RNA-Polymerasen (RNAPs) nur ein Fehler alle 300.000 Basen5,6machen sollen. Da die Fehlerquote der reversen Transkription allein die Fehlerquote der RNA-Polymerasen in den Zellen Zwerge, ist es praktisch unmöglich, wahre Übertragungsfehler von Artefakten, verursacht durch die Bibliothek Vorbereitung mit traditionellen RNA-Seq-Daten ( zu unterscheiden Abbildung 1a).
Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir eine optimierte Version des Kreis-Sequenzierung (Cirseq oder C-Seq fortan) Assay5,16. Dieser Test ermöglicht dem Benutzer, Übertragungsfehler und andere seltene Varianten in der RNA in die Transkriptom-5zu erkennen. Rundschreiben-Sequenzierung Assay trägt diesen Namen, weil ein wichtiger Schritt in diesem Assay dreht sich um RNA Circularization. Sobald die RNA Ziele circularized sind, sind sie reverse transkribiert in einer rollenden Kreis Mode, lineare DNA-Moleküle zu produzieren, die zahlreiche Kopien der gleichen RNA-Vorlage enthalten. Wenn ein Fehler in einer dieser Vorlagen vorhanden war, würde dieser Fehler auch in jeder einzelnen Wiederholung das DNA-Molekül enthaltenen vorhanden sein. Im Gegensatz dazu Fehler eingeführt durch reverse Transkription, PCR-Amplifikation und Sequenzierung neigen dazu, die zufällig entstehen und werden somit in nur ein oder zwei Wiederholungen. Durch Erzeugung einer Konsensussequenz für jedes DNA-Molekül, und zufällige Fehler von allen wiederholt auftretenden Fehler zu unterscheiden, können so effektiv von wahren Übertragungsfehler (Abbildung 1 b) Bibliothek Bau Artefakte getrennt werden.
Richtig eingesetzt, kann C-Seq-Assay verwendet werden, um genau die Rate der Basis Substitutionen, Einfügungen und Löschungen in RNA in das Transkriptom aller Arten zu erfassen (siehe z. B. Traverse und Ochman17). Beispielsweise haben wir die C-Seq-Assay verwendet, um eine einheitliche Basis Abwicklung5 genomweite Messungen der Fehlerquote der Transkription in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans ermöglichen (unveröffentlichte Beobachtungen). Ursprünglich verwendet, um präzise RNA-Virus Populationen sequenzieren, wurde diese optimierte Version des C-Seq-Assays modernisiert, um zu harte Bedingungen bei der Bibliothek-Vorbereitung zu minimieren, die Bibliothek Bau Artefakte beitragen. Darüber hinaus wird mithilfe einer Anzahl von im Handel erhältlichen Kits der Durchsatz des Assays, sowie die Benutzerfreundlichkeit verbessert. Wenn Sie richtig eingesetzt, kann dieser Assay genau Tausender Übertragungsfehler pro replizieren, dadurch erheblich zu verbessern, auf früheren Studien6erkennen. Insgesamt ist diese Methode bietet ein mächtiges Werkzeug um transkriptioneller Mutagenese studieren und ermöglicht es dem Benutzer, neue Einblicke in die Mechanismen, die die Treue der Transkription in einer Vielzahl von Organismen zu steuern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RiboPure RNA purification kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1926</td>
			<td>Total RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genelute mRNA purification kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MRN70-1KT</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>Elution and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNase III</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM2290</td>
			<td>RNA fragmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204S</td>
			<td>RNA circularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribolock</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18080044</td>
			<td>Rolling circle reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18427013</td>
			<td>Rolling circle reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamers (50 ng/&#181;l)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N8080127</td>
			<td>Rolling circle reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Second Strand Synthesis Module</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6111S</td>
			<td>Second Strand Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7370S</td>
			<td>cDNA library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Next index primers</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7335S</td>
			<td>Multiplex PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061</td>
			<td>Clean up of RNA and DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic bead purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic bead purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 Microcentrifuge</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>05-403-93</td>
			<td>centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCU-Shaker 10L</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H1010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Medium to High temperature cycling conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-200 Thermal Cycler</td>
			<td>GMI</td>
			<td>8252-30-0001&#160;</td>
			<td>Low temperature cycling conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular Bioproducts</td>
			<td>700S-11</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td>Nuclease-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td>Nuclease-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Nuclease-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 Tapestation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity RNA Screen Tape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5579</td>
			<td>Quality control of RNA and single stranded DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA ScreenTape Sample Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5577</td>
			<td>Quality control of RNA and single stranded DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA ScreenTape Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5578</td>
			<td>Quality control of RNA and single stranded DNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Double stranded DNA quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Quality control for double stranded cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0244</td>
			<td>Incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>Determination of RNA concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide surveillance of transcription errors in eukaryotic organisms

Genaue Transkription ist erforderlich für den treuen Ausdruck der genetischen Information. Überraschend allerdings wenig über die Mechanismen, die die Treue der Transkription zu steuern bekannt ist. Um diese Lücke in den wissenschaftlichen Erkenntnissen optimiert wir vor kurzem die Kreis-Sequenzierung Assay um Übertragungsfehler während das Transkriptom des Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis erkennen Elegans. Dieses Protokoll erhalten Forscher mit ein leistungsfähiges neues Tool um die Landschaft der Übertragungsfehler in eukaryontischen Zellen zuzuordnen, so dass die Mechanismen, die die Treue der Transkription Steuern noch nie da gewesenen detailliert aufgeklärt werden können.

Wie alle massiv parallelen Sequenzierung Ansätze produziert jedes C-Seq-Experiment eine sperrige, große Datasets. Für Erstanwender kann es schwierig zu handhaben diese Datasets sein; Daher empfiehlt es sich, dass alle Benutzer wenden Sie sich an einen erfahrenen Bio-Informatician vor dem experimentieren. Im Durchschnitt ist die Erwartung, dass Benutzer ca. 55 – 70 Giga Basen (Gbases) pro Durchlauf auf den meisten massiv parallelen Sequenzierung Plattformen generieren werden. Für dieses Protokoll wurden in der Regel 12 – 30 Proben pro Lauf gemultiplext, so dass für jede Probe ca. 2 – 6 Gbases erworben wurden. Nach dem Stutzen die Adapter-Sequenzen und minderwertige Basis Anrufe (< 20) aus diesem Dataset, blieb ~ 70 % der Größe der ursprünglichen Daten.
Diese Basen sind dann weiter untersucht, um die Effizienz der RNA Fragmentierung und Circularization zu untersuchen, durch die Bestimmung der Größe der Wiederholungen, die erzeugt wurden. Die meisten sind in der Regel 45 – 80 Basen in der Länge (Abb. 4A) und ca. 50 % der Basen, die sequenziert wurden gehören zu diesen Wiederholungen (Abbildung 4 b) wiederholt. Da die meisten dieser Basen in liest vorhanden sind, die enthalten ist 3 Wiederholungen oder mehr, die Zahl der einzigartigen Basen, die sequenziert werden etwa ein Drittel der Gesamtzahl der Basen sequenziert. Im Durchschnitt > 75 % von diesen Konsensus-Sequenzen zurück zu den Referenz-Genom abgebildet werden können. Zu guter Letzt fallen etwa 25 % dieser Basen unter 20 liest oder mehr, was letztlich bedeutet, dass etwa 10 % der Daten zur Fehlererkennung verwendet werden kann. Ein Beispiel für diese Analyse ist in Abbildung 4, gegeben die sequenzierungsinformationen darstellt, die beim Aufbau dieses Protokolls für 1 Wiederholung einer einzigen C-Seq-Bibliothek erworben wurde, die sequenziert wurde relativ flach und stellt die untere Grenze der Daten, die Nutzer erwarten können, zu erwerben.
Ca. 5.000-25.000 Fehler pro Durchlauf tendenziell identifiziert werden, obwohl diese Zahlen je nach Fehlerquote selbst erheblich variieren können (je höher die Fehlerquote, desto mehr Fehler werden erkannt), die Größe des transkriptoms (je größer die Transkriptom, die weniger Basen fallen Sie unter 20 liest, Begrenzung der Sequenzierungsdaten, die zur Fehlererkennung verwendet werden können), und die Tiefe, an dem es sequenziert (tiefer Sequenzierung machen es wahrscheinlicher, dass eine bestimmte Basis 20 mal gelesen oder mehr gedeckt werden). Diese Fehler sind in der Regel über das gesamte Genom verteilt werden soll, dass im Durchschnitt ~ 47 % der Fehler in mRNA befinden, die Moleküle durch RNA-Polymerase II (RNAP II), ~ 49 % erzeugt in rRNA Moleküle erzeugt durch RNAP ich, und die restlichen ~ 3 % sich in RNAs befinden befinden erstellt von RNAP III und die mitochondriale RNA-Polymerase. Diese Verhältnisse können jedoch je nach Zelltyp oder Organismus untersucht (Abbildung 4) unterschiedlich. Beispielsweise enthalten Zelltypen, die stark auf mitochondriale Funktion, z. B. Kardiomyozyten, deutlich mehr mitochondriale RNA als andere Zelltypen, die Anzahl der mitochondriale RNA-Moleküle, die sequenziert werden und somit die Anzahl erhöht der Fehler erkannt.
Sobald eine Liste von Fehlern zusammengestellt, und ihre Standorte über das Genom bekannt sind, können diese Fehler verwendet werden, um die Parameter zu identifizieren, die die Fehlerquote der Transkription in jedem Organismus steuern. Beispielsweise kann die Lage dieser Transkription Fehler mit zahlreichen Features des Genoms, korreliert werden, wie z. B. das Vorhandensein von DNA wiederholt, spezifische genetische Zusammenhänge, oder den Ausdruck, zu verstehen, wie diese Funktionen verändern die Treue Transkription-5. Es wird erwartet, dass in der Zukunft jedoch Benutzer feststellen, wie unzählige Zusatzfunktionen transkriptionelle Treue werden, einschließlich epigenetischen Markern, die 3-d-Organisation des Genoms, nährstoffverfügbarkeit, Alter oder Exposition gegenüber toxischen Auswirkungen auf Verbindungen, um den Beitrag der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die die Treue der Transkription zu erhellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57731/57731fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der RNA-Seq im Vergleich zu C-f (A) traditionelle RNA-Seq Experimente isolieren RNA aus einer Stichprobe von Interesse, fragment der RNS, und umgekehrt Transkribieren sie vor der endgültigen Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung. Jedoch stellen diese Vorbereitung Verfahren zahlreiche technische Artefakte in der Bibliothek in Form von reversen Transkriptionsfehler, Fehler PCR-Amplifikation und Sequenzierung Fehler. (B) Diese optimierten C-Seq-Assay ermöglicht die Korrektur dieser technische Artefakte durch zirkularisierung der fragmentierten RNA-Moleküle vor der reversen Transkription, zurückentwickelt werden können in einer rollenden Kreis Mode, lineare produzieren transkribiert Wiederholen Sie die cDNA-Moleküle, die mehrere Kopien der ursprünglichen RNA-Vorlage im Tandem enthalten. Diese tandemwiederholungen können dann verwendet werden, wahre Übertragungsfehler von Artefakten, unterscheiden wie wahre Übertragungsfehler (Stern) in allen Wiederholungen an der gleichen Stelle, anwesend sein werden, während Artefakte wie Übertragungsfehler (Quadrat) und PCR reverse Verstärkung-Fehler (Kreis) sind nur in ein oder zwei Wiederholungen einer bestimmten cDNA-Moleküls. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57731/57731fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57731/57731fig2.jpg"> Abbildung 2: Vertreter ergibt sich für die Bibliothek Vorbereitung. Diese Tafeln zeigen ein Electrophoretogram für (A) eine hohe Empfindlichkeit RNA Bildschirm Klebeband ladder (siehe Tabelle der Materialien), (B) die Gesamt-RNA von Saccharomyces Cerevisiaegereinigt, (C) RNase III fragmentiert RNA und) D) rollenden Kreis rückwärts transkribiert cDNA. (E) die endgültige Bildgröße cDNA-Bibliothek läuft auf eine hohe Empfindlichkeit doppelsträngige DNA Analyse chip (siehe Tabelle der Materialien). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57731/57731fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57731/57731fig3.jpg"> Abbildung 3: Schematische der Bio-Informatik-Pipeline zum Analysieren der Sequenzierung Kreisdaten. Nach dem Trimmen der Sequenzierung liest, Wiederholungen identifiziert werden und eine Konsensussequenz wird anhand des wahrscheinlichsten Basis Aufrufs an einer angegebenen Position erstellt. Dann der Ligatur-Punkt der ursprünglichen RNA-Vorlage identifiziert und der Konsensussequenz orientiert sich an der Referenz-Genom, damit mögliche Übertragungsfehler identifiziert werden können. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57731/57731fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57731/57731fig4.jpg"> Abbildung 4: Beispiel für Ergebnisse für C-Seq Pipeline. (A) dieses Panel zeigt die Größenverteilung der Konsensus-Sequenzen aus einem typischen C-Seq-Experiment zu erhalten. (B) dieses Panel zeigt die Anzahl der Stützpunkte, Lese- und Prozentsatz der Lesevorgänge in jedem Schritt der C-Seq-Bioinformatik-Pipeline sequenziert. (C) dieser Bereich zeigt die Anzahl der Übertragungsfehler erkannt und der Prozentsatz der Fehler zugeschrieben RNA-Polymerase I, RNA-Polymerase II, RNA-Polymerase III und mitochondriale RNA-Polymerase. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57731/57731fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

genome-wide-surveillance-transcription-errors-eukaryotic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K Aufrufe.  Children's Hospital of Philadelphia. Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.

Serie: Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Forschung

Genetik

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative transcriptomics. It also serves as a primer for biologists to develop data scientist computational skills, e.g. executing bash commands, visualization and management of large data sets. All command line code and further explanations of each command or step can be found on the wiki (<a href="https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ">https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ</a>). The Discovery Environment and Atmosphere platforms are connected together through the CyVerse Data Store. As such, once the initial raw sequencing data has been uploaded there is no more need to transfer large data files over an Internet connection, minimizing the amount of time needed to conduct analyses. This protocol is designed to analyze only two experimental treatments or conditions. Differential gene expression analysis is conducted through pairwise comparisons, and will not be suitable to test multiple factors. This workflow is also designed to be manual rather than automated. Each step must be executed and investigated by the user, yielding a better understanding of data and analytical outputs, and therefore better results for the user. Once complete, this protocol will yield de novo assembled transcriptome(s) for underserved (non-model) organisms without the need to map to previously assembled reference genomes (which are usually not available in underserved organism). These de novo transcriptomes are further used in pairwise differential gene expression analysis to investigate genes differing between two experimental conditions. Differentially expressed genes are then functionally annotated to understand the genetic response organisms have to experimental conditions. In total, the data derived from this protocol is used to test hypotheses about biological responses of underserved organisms.

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

This protocol outlines a comparative de novo transcriptome assembly and annotation workflow for novice bioinformaticians. The workflow is available for free entirely through CyVerse and connected by the Data Store. Command line and graphical user interfaces are used, but all code needed is available to copy and paste.

Nutzung von CyVerse Resources für<em&gt; De Novo</em&gt; Vergleichende Transkriptomik von unversicherten (Nicht-Modell-) Organismen

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here is a powerful experimental approach for analyzing the transcription termination defect under physiological conditions. Like the traditional TRO assay, it relies on the presence of a transcriptionally active polymerase beyond the 3&#8242; end of the gene as an indicator of a transcription termination defect1. It overcomes two major problems encountered with the traditional TRO assay. First, it can detect if the polymerase reading through the termination signal is the one that initiated transcription from the promoter-proximal region, or if it is simply representing a pervasively transcribing polymerase that initiated non-specifically from somewhere in the body or the 3&#8242; end of the gene. Secondly, it can distinguish if the transcriptionally active polymerase signal beyond the terminator region is truly the readthrough sense mRNA transcribing polymerase or a terminator-initiated non-coding anti-sense RNA signal. Briefly, the protocol involves permeabilizing the exponentially growing yeast cells, allowing the transcripts that initiated in vivo to elongate in the presence of the BrUTP nucleotide, purifying BrUTP-labelled RNA by the affinity approach, reverse transcribing the purified nascent RNA and amplifying the cDNA using strand-specific primers flanking the promoter and the terminator regions of the gene2.

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.

Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...