La preparazione di questo manoscritto è stata sostenuta attraverso fondi di start-up dell&#39;Università del Colorado Denver (JMRE). AF desidera riconoscere il sostegno da un premio per la ricerca e la creazione di attività creative (RaCAS, CU Denver). Finanziamenti presso l&#39;Ufficio dei servizi di ricerca, University of Colorado Denver per coprire le spese di pubblicazione è riconosciuto. Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio, Sig.ra Cassandra Herbert e Yannick K. Dzowo per i loro contributi nella porzione video.

1. Sintesi di fase solida di oligonucleotidi RNA <ol><li> Preparazione di soluzioni contenenti ciascuna fosforamidite (Tabella 1). <ol><li> Conte il numero di nucleotidi e rientrare nell&#39;equazione n + 1 (dove n = numero di nucleotidi) corrispondenti a ciascuna base e riempire la tabella con i valori mancanti. Volume = 0,15 mL per nucleotide ad una concentrazione di 0,1 M, disciolto in acetonitrile anidro. </li><li> Pesare ciascun fosforamidite in bottiglie ambrate da 10 ml essiccate a forno (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) e posizionare immediatamente sotto vuoto usando un esiccatore contenente un agente essiccante. </li><li> Riempire l&#39;esiccatore con argon secco, rimuovere la bottiglia e diluire immediatamente con la corrispondente quantità di acetonitrile (anidra) prima di fissare lo strumento. NOTA: Assicurarsi di utilizzare siringhe a tenuta stagna e mantenere sempre un&#39;atmosfera anidra. </li><li> Rimuovere la septa dalla bottiglia e mettere sul mAchine, tramite una funzione di cambio di bottiglia. NOTA: Questo processo richiede ulteriori 0.15 mL (quindi il volume in eccesso nell&#39;equazione n + 1 sopra) di ciascuna soluzione per preparare la linea prima della sintesi. </li></ol></li><li> Impostazione della sintesi di sequenza e fase solida usando il software ( Figura 3 ). <ol><li> Fai clic sull&#39;icona del software ( ad esempio , OligoNet 1.0.1) e seleziona Nome strumento&gt; OK . Crea una nuova sintesi da File&gt; Nuova sintesi&gt; Ordine . </li><li> Riempimento: Data; RunID; Selezionare strumento; Nome della sequenza; Sequenza (fine 5&#39;-a-3 &#39;). Sotto | ciclo, assegnare il metodo creato in precedenza ( Figura 3 ). Scegli la procedura finale, ( lascia oligonucleotide legata alla resina CPG)&gt; manuale. </li><li> Selezionare DMT Off&gt; (trattamento TCA nell&#39;ultimo passaggio per ottenere un gruppo 5&#39;-OH alla fine della sintesi) ; Salvare File&gt; Salva comeE fornire un nome per l&#39;esperimento. </li><li> Inviare il file per iniziare la sintesi Ordine&gt; Invia ordine al sintetizzatore e selezionare colonna 1-4 . Apri la finestra del sintetizzatore e seleziona il monitor trityl | scegli la funzione | trity&gt; controlla ogni passo . </li><li> Ripetere i passaggi secondo necessità a seconda del numero di oligonucleotidi da sintetizzare contemporaneamente (notare che tutti gli ordini devono avere lo stesso metodo, cioè gli stessi tempi di accoppiamento e la sequenza di eventi). </li><li> Iniziare la sintesi Sintetizzatore&gt; Preparare per iniziare . Posizionare le colonne con il desiderato 3&#39;-end sulle posizioni indicate nello strumento. Sullo strumento fare clic su Start&gt; No (per la preparazione ABI). </li><li> Una volta completata la sintesi, rimuovere la colonna dallo strumento e posizionarla in una tazza di fondo rotonda seguita dall&#39;essiccamento a pressione ridotta per circa 0,5 h. NOTA: Si raccomanda di verificare che un colore arancione profondo sia osservato in randOm (punti 1.2.4 - 1.2.7) per evitare errori potenziali dalla funzione di monitoraggio trityl. </li></ol></li><li> Deprotezione e purificazione di oligonucleotidi RNA. <ol><li> Aprire la colonna torsione del tappo nero e trasferire tutto (o metà, a seconda della necessità o della finalità) della resina bianca in un tubo da centrifuga da 1,6 ml. Aggiungere 0,5 mL di una metilammina (40% in acqua) / ammoniaca (40% in acqua) a 1: 1. </li><li> Fissare il tappo della tubazione centrifuga con il parafilm e, usando un blocco termico, scaldare a 60 ° C per 1,5 ore. NOTA: un oggetto pesante può essere posto sulla parte superiore del tubo per assicurare che la concentrazione di ammoniaca rimanga costante all&#39;interno del tubo di reazione. </li><li> Rimuovere dal blocco termico e raffreddare lentamente fino a temperatura ambiente. Centrifugare brevemente il campione per far girare i contenuti, quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo di centrifuga. </li><li> Fermare i campioni sommersando tubi in azoto liquido (o ghiaccio a secco / bagno di etanolo) e concentrarsi a secchezza mentre spinnIn una centrifuga a pressione ridotta. </li><li> Riposizionare i solidi in 0,4 mL di una soluzione trietilammina / N-metilpirrolidinone / trietilammina-triidrofluoruro (rapporto 2: 2: 3). Scaldare a 60 ° C per 1,5 ore seguita da lento raffreddamento a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 0,04 ml di una soluzione NaOAc (3M, pH 5,5 - regolata con HCl) seguita da una miscelazione dolce con una punta di pipetta. Aggiungere etanolo (1 mL) e raffreddare a ca. -70 ° C (ghiaccio secco / bagno di etanolo) per 15 min. </li><li> Centrifugare a 15.000 giri / min e 4 ° C per 10 min. Utilizzare una pipetta per estrarre l&#39;aliquota e asciugare il pellet risultante sotto pressione ridotta. </li><li> Ricalassare il solido ottenuto nel tampone di caricamento (0,2 mL, formamide di 90%, 1 mM EDTA) e mescolare fino a quando la miscela è omogenea. </li><li> Sospendere la carica su un gel di poliacrilammide preparato in precedenza (denaturazione del 20%, dimensioni del pozzetto: 30 cm x 1 mm) 22 . </li><li> Applicare una corrente attraverso il gel fino a quando il marcatore blu bromofenolo si trova tra 1 / 2-2 / 3Giù il gel (dimensioni del gel: ~ 21,5 cm x 30 cm). </li><li> Togliere il gel dal supporto e trasferire il contenuto di gel dal vetro al involucro di plastica (coperto da entrambi i lati) e collocare su una lastra di cromatografia a strato sottile (TLC) ricoperta di silice (contenente colorante fluorescente a 254 nm) per visualizzare le bande Utilizzando una lampada UV (λ max = 254 nm). </li><li> Utilizzare un marcatore per delineare la posizione in cui si trova la fascia superiore e tagliarla usando una nuova lama del rasoio. Posizionare il gel contenente l&#39;RNA (senza involucro in plastica) in un tubo conico da 50 ml e schiacciare a piccoli pezzi utilizzando una barra di vetro. </li><li> Sospendere i residui di gel in un NaCl aq. (2 mM ed 1 mM EDTA) e agitano la sospensione a 37 ° C per 12 ore. Centrifugare il tubo conico per 10 min. </li><li> Desaltare usando una cartuccia C18 a inversione di fase. <ol><li> Preparare la cartuccia usando una siringa da 10 ml lavando con: Acetonitrile (10 mL) H 2 O (due volte, 10 mL) 5 mM NH4 Cl aq. Soluzione (3 mL) Soluzione contenente RNA, facendo attenzione a non versare alcun residuo di gel. </li><li> Lavare con H 2 O (tre volte, 10 mL). </li><li> Eluire dalla colonna usando un 60% aq. Soluzione metanolo (3 mL) </li></ol></li><li> Concentrare sotto pressione ridotta e ristabilire in acqua libera da RNasi (0,3 mL) </li><li> Preparare una soluzione diluita (10 μL) e depositare 1 μL sullo strumento UV ( ad es . Nanodrop) per misurare lo spettro UV-vis (200-450 nm). </li><li> Utilizzare la legge di Birra Lambert per determinare la concentrazione della soluzione ottenuta: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> Dove A = assorbanza ottenuta; Ε = coefficiente di estinzione molare calcolato; C = concentrazione, e l = 0,1 per una lunghezza del percorso di 1 mm. </li><li> Calcolare i coefficienti di estinzione molari per gli oligonucleotidi; Calcolato qui con un calcolatore on-lineChe utilizza il software DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23 </li></ol></li><li> Determinazione e caratterizzazione della concentrazione tramite MALDI-TOF. <ol><li> Caricare i campioni su una piastra MALDI usando una punta pipetta caricata con una punta C18 per desaltare e individuare ogni oligonucleotide. <ol><li> Lavare la punta con acetonitrile al 50% (10 μL x 2). Equilibrare la punta con l&#39;acido trifluoroacetico 0,1% (TFA; 10 μL x 2). Caricare la punta con il campione (tipicamente 100-150 pmol). </li><li> Lavare la punta con 0,1% TFA (10 μL x 2) e poi con acqua (10 μL x 2). </li><li> Eluire il campione in una soluzione contenente la matrice desiderata; Abbiamo utilizzato una soluzione di: 10 μL di 25 mM-2,4,6-triidro-acetofenone monohidrato (THAP), 10 mM di ammonio citrato e 300 mM di ammonio fluoruro in acetonitrile al 50%. </li><li> Collocare direttamente sulla piastra MALDI depositare 0,9 μL (seguito da essiccazione ad aria) e ripetere la procedura se necessario. NOTA: Tutti gli spettri sono stati ottenuti sulla modalità positiva del riflettore. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. RNA Struttura Analisi via CD <ol><li> Preparazione di soluzioni per CD. <ol><li> Preparare 0,25 mL contenenti l&#39;RNA modificato [3 pM], NaCl [10 mM], tampone sodio fosfato [10 mM, pH 7,2], e MgCl 2 [5 mM]. Il campione è pronto per l&#39;analisi come è, in particolare se rappresenta una transizione unimolecolare. </li><li> Se l&#39;obiettivo è quello di analizzare le strutture duplex o le transizioni bimolecolari, aggiungere in questo momento il complemento (1 equivalente molare, se applicabile), oppure continuare con il passo successivo. </li><li> Posizionare il campione su un blocco termico, pre-riscaldato a 90 ° C, e spegnere il calore per controllare il raffreddamento lento a temperatura ambiente (tipicamente 2-4 h). </li></ol></li><li> Acquisizione Spectra <ol><li> Preparare una soluzione in bianco (NaCl 10 mM, fosfato di sodio 10 mM pH 7,3, MgCl 2 5 mM), trasferimento tUna micro-cuvetta (lunghezza del percorso di 1 cm, volume minimo di 250 μL) e posizionare su una posizione di supporto del cambiacampione all&#39;interno dello strumento. </li><li> Trasferire il campione contenente RNA in un&#39;altra micro-cuvetta e una posizione nel cambia- re del campione. Se si misura una transizione di denaturazione termica, aggiungere con attenzione un letto di olio senza interrompere lo strato acquoso e fissare il tappo di cuvetta utilizzando un nastro di teflon. </li><li> Aprire il serbatoio dell&#39;azoto per fornire un flusso che sposta il flottante dell&#39;aria situato nello strumento a ca. 40. Accendere il dispositivo di raffreddamento. </li><li> Accendere lo strumento e aprire l&#39;icona del software Spectra Manager , quindi aprire la finestra di acquisizione Spectra Measurement . </li><li> Spurgare lo strumento con azoto per 5 minuti prima dell&#39;acquisizione. </li><li> Acquisire gli spettri utilizzando i seguenti parametri Misura&gt; Parametri e regolare i parametri come segue: <ol><li> In Generale , selezionare: Scan 200-350 nm; Canali CD e HT: datiPitch a 0,1 nm; Velocità di scansione a 100 nm / min; Larghezza di banda a 1 nm; Numero di accumulazioni a 5. </li><li> Sotto l&#39;unità cellulare , scegliere 20 ° C. Sotto controllo , seleziona l&#39;otturatore viene aperto e chiuso automaticamente. Sotto le informazioni , scegliere il nome, la concentrazione, l&#39;operatore. </li><li> Sotto i dati , accedere alla cartella desiderata. Fare clic su OK . </li></ol></li><li> Acquisire lo spettro Misura&gt; Misura campione , individuare le posizioni delle cuvette nel cambia- mento del campione 1-6 , quindi fare clic su OK . </li></ol></li><li> Se prende una transizione di denaturazione termica: <ol><li> Chiudi File software di acquisizione &gt; Chiudere e aprire un nuovo programma Misurazione della temperatura variabile&gt; Misura&gt; Parametri . </li><li> Applicare i seguenti parametri per registrare una transizione termica, che può essere regolata come desiderato: <ol><li> Sotto Temperatura , selezionare temperatura di avvio: 4 ° C; Intervallo: 0,2; taR: 90 ° C; Gradiente: 1 ° C / min; Attendere 0 s. In Start / End , selezionare Avvia condizione e condizioni finali come desiderato. </li><li> In Generale , selezionare 3 canali, CD / HT / Abs; Larghezza di banda: 1 nm; Lunghezza d&#39;onda: 270 nm (o come desiderato). In Controllo , seleziona nessuno. In Informazioni , selezionare nome, concentrazione, operatore. </li><li> Sotto i dati , accedere alla cartella desiderata. Fare clic su OK . </li></ol></li><li> Far raffreddare i campioni a 4 ° C e aspettare 5 min a questa temperatura prima di ottenere una misurazione dello spettro. </li></ol></li><li> Elaborazione dei dati per gli spettri. <ol><li> Utilizzando la funzione del software, sottrarre lo spettro vuoto dall&#39;acquisizione di target per tenere conto dei segnali di sfondo derivanti dal sistema di buffer in uso: Spectra Analysis&gt; File&gt; Open . </li><li> Una volta aperti un file vuoto e un file di spettri, trascinate View 2 sotto View 1 (sul lato sinistro della schermata). </li><li> Fare clic su PrOcessing&gt; sottrazione&gt; OK o scambia dati&gt; OK . </li><li> Estrarre i dati come un file ASCII: File&gt; Esporta e selezionare ASCII . </li><li> Utilizzare il software per tracciare lo spettro corrispondente. Lo smorzamento dei dati è opzionale nei casi in cui il rapporto segnale / rumore è inferiore a quello previsto. Questa trasformazione può essere applicata applicando l&#39;opzione di regolazione dei dati. </li></ol></li><li> Elaborazione dei dati per le transizioni di denaturazione termica. <ol><li> Estrarre i dati dal file JASCO come file ASCII. </li><li> Tracciare i punti di ellitticità in funzione della temperatura. In genere, è necessario uniformare i dati a seconda della lunghezza d&#39;onda in esame. In alcuni casi, l&#39;utilizzo della lunghezza d&#39;onda a 210 nm ha mostrato variazioni più grandi tra le tracce che richiedevano lo smorzamento. Tuttavia, a seconda del campione e delle concentrazioni, sono stati eseguiti diversi calcoli utilizzando i dati grezzi. </li><li> Per calcolare la tana termicaTransizioni di atura (T m ), ottenere un primo derivato della curva. I valori massimi o minimi erano un&#39;indicazione di questo parametro. Come nel passaggio precedente, alcuni casi hanno richiesto lo snellimento dei dati per ottenere il valore più accurato. NOTA: Gli esperimenti sono stati tipicamente eseguiti in triplice copia, che hanno determinato la corrispondente deviazione media e standard per la misurazione. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39;intento di questo manoscritto è quello di servire da guida ai ricercatori del campo, principianti o esperti, per raggiungere o migliorare la sintesi di oligonucleotidi di DNA o RNA. La metodologia descritta mette a fuoco sull&#39;utilizzo di sintesi a fase solida utilizzando un sintetizzatore automatizzato DNA / RNA tramite la chimica standard di fosforamidite. Il rapporto descrive una rappresentazione passo-passo della sintesi, della purificazione e della caratterizzazione di dodecameri RNA. Inoltre, l&#39;uso del CD è utilizzato per identificare i motivi strutturali secondari e le transizioni di denaturazione termica. È importante notare che questo lavoro può essere adattabile ad altre circostanze, vale a dire diverse marche di apparecchiature, modifiche, gruppi protettivi e / o reagenti nella sintesi a fase solida. Pertanto, può essere ottenuto un miglioramento quando si modifica uno o più dei molti parametri che sono coinvolti in questo processo o mediante aggiustamenti nelle condizioni di reazione. ioInoltre, l&#39;analisi strutturale dettagliata fornita in questo documento (via CD) dovrebbe fornire un approccio alternativo ai ricercatori in questo campo, tipicamente effettuando analisi analoghe tramite UV-vis. I calcoli per determinare le masse dei fosforamiditi per la sintesi a fase solida sono basate sulle sequenze mostrate di seguito ei quattro oligonucleotidi sono stati preparati e purificati nello stesso ciclo (le posizioni sottolineate indicano la presenza di una modifica 2&#39;- O- tiofenilmetile) . Tutti i calcoli ei valori sono inclusi nella tabella 1 1 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; 2 5 &#39;- [CUA CGG A AU CAU] -3&#39; 3 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; 4 5 &#39;- [AUG UU CCG UAG] -3&#39; Forse l&#39;aspetto più importante nella gestione dell&#39;RNA è la sua suscettibilità verso il degrado delle ribonucleasi e la sua eDa sottoporre ad idrolisi in soluzioni acquose e in presenza di ioni metallici 24 . Pertanto, le condizioni prive di RNasi devono essere attuate in tutte le volte 25 come segue: 1) tutta l&#39;acqua è stata autoclavata in presenza di pirocarbonato dietilico (0,1% w / v, DEPC); 2) tutti gli articoli in vetro sono stati autoclavati, cotti in forno (150 ° C, durante la notte) e sciacquati con acqua trattata con DEPC; 3) tutti i tubi e le pipette sono stati acquistati dai produttori nella loro forma senza RNase; 4) i guanti sono stati utilizzati in ogni momento e il lavoro è stato effettuato in un cappuccio designato; E 5) tutte le superfici e le apparecchiature sono state asciugate costantemente con soluzioni di decontaminazione RNase disponibili per l&#39;acquisto da vari produttori. Tutti gli RNA purificati sono stati divisi in piccole porzioni e conservati a -20 ° C o -80 ° C, a seconda della frequenza di utilizzo, mentre le resine non simmetrate o non purificate sono state conservate a 20 ° C. Come abbiamo già sottolineato 16 , oligonucleotiDes ottenuti secondo le modalità qui descritte e in dimensioni comprese tra 10 e 34 nucleotidi, presentano una stabilità superiore rispetto ad altri rapporti 26 . Di conseguenza, il lettore è riferito ad altre procedure di archiviazione durante la gestione di RNA più lunghi 27 . Le rese graduali (calcolate tramite la fase di detritilazione) nella sintesi automatizzata sono state tra il 97 e il 100% e sono un&#39;indicazione di una buona efficienza di accoppiamento, in particolare di quelli che sono stati modificati. Le rese complessive del 30-75% sono state ottenute dopo la scissione della resina, la deprotezione e la purificazione ( tramite elettroforesi a gel), che corrispondono a ~ 300 - 750 nmol di oligonucleotidi isolati. Abbastanza, l&#39;incorporazione delle modifiche non ha influenzato la resa complessiva dei fili RNA. Tuttavia, mentre queste gamme possono essere considerate come quantità accettabili, la sintesi di oligonucleotidi superiori a ~ 50 nucleotidi (precedenti dati non pubblicati nel nostro laboratorio) Può essere sensibilmente influenzato da rese graduali inferiori al 98%. Pertanto, è necessario adottare alcune precauzioni se si desidera un filamento di più di 50 nucleotidi, ad esempio modificare la sorgente dell&#39;acetonitrile in una qualità superiore, minimizzare il tempo di esposizione dei fosforamiditi all&#39;atmosfera, programmare lo strumento per diluire le fosforamidite ad un set Valore durante l&#39;utilizzo di nuove bottiglie di fosforamiditi canoniche ogni volta, utilizzare la depurazione di HPLC al posto dell&#39;analisi elettroforetica e / o utilizzare condizioni di deprotezione più lieve. Gli spettri di massa (MALDI-TOF MS) per tutti gli oligonucleotidi sono stati eseguiti su un spettrometro di massa ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF in modalità positiva. Tutti i campioni sono stati preparati usando la procedura qui descritta ed esempi di spettri per ON 1 - 3 sono mostrati in Figura 5 . Tutti gli esperimenti vengono tipicamente eseguiti in triplicocato. Tutti gli spettri e la configurazione sperimentale sono stati eseguiti su uno spettropolarimetro dotato di un supporto rettangolare a 6 celle. Tutti gli oggetti di vetro sono stati lavati con una soluzione di rimozione di RNasi e sciacquati accuratamente con acqua senza RNase. Tutti i campioni sono stati scartati dopo ogni misurazione. È importante sottolineare che la tensione ad alta tensione deve essere prestata con attenzione (HT è un parametro misurato dallo strumento). Ciò può essere un&#39;indicazione della saturazione del segnale e quindi costituisce una minaccia per l&#39;accuratezza e la validità dei dati. Questo parametro dipende dal campione e deve essere mantenuto in modo tale che il segnale non superi i 500 mV in un dato momento. Esempi di spettri CD ottenuti prima e dopo l&#39;ibridazione di ON 1 - 3 sono mostrati in Figura 6 . Inoltre, aumentando la concentrazione nei sali di sodio (e altri sistemi di tampone), o utilizzando altri sistemi di tampone, Ad esempio , HEPES o MOPS, ha un rumore maggiore di 220 nm. Pertanto, dato che la banda a 210 nm è particolarmente importante per seguire la formazione di un duplex a forma di A, la concentrazione massima negli ioni di sodio è stata mantenuta a ~ 10 mM. Mostriamo anche che l&#39;uso del CD fornisce gli stessi parametri di quelli ottenuti dalla spettroscopia ultravioletta. In conclusione, descriviamo e illustriamo la procedura per sintetizzare, purificare e caratterizzare oligonucleotidi RNA modificati e non modificati.

La sintesi in fase solida per ottenere gli oligonucleotidi del DNA / RNA è un potente strumento che ha servito parecchie applicazioni in vari campi sin dagli anni &#39;70 1 , 2 , 3 usando i blocchi di costruzione di fosforamidite 4 . Esempi della sua vasta influenza includono: il suo impatto sull&#39;etichettatura ( tramite reazioni di chimica clicca) 5 , la sonda strutturale 6 e le tecnologie antisenso 7 , nonché la sua spiegazione dei meccanismi biologici 8 , 9 , fonte di materiale genetico 10 e lo studio di Varie modificazioni naturali e / o chimiche 11 , 12 , tra molti altri. La modifica che usiamo qui rappresenta il primo passo nei nostri sforzi per ottenere oligonucleotidi RNA che contengonoSonde fotoattive per consentire il controllo temporale della struttura e della funzione di questo importante biopolimero. La sintesi di RNA con sequenze dodecameri: 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [agosto AUU CCG UAG] -3&#39; (posizioni sottolineate rappresentano l&#39;incorporazione di una modifica -thiophenylmethyl C2&#39;- O ) Costituisce l&#39;oggetto di questo studio. Le sequenze sono state scelte per consentire la quantificazione e la misurazione dei fili RNA come singoli fili, o come corrispondenti strutture duplex (nessuna altra struttura secondaria è stata predetta come stabile termodinamica). CD è stato utilizzato per stabilire i parametri strutturali, cioè la formazione di duplex e le transizioni di denaturazione termica. Sintesi La procedura complessiva per ottenere questi oligonucleotidi è illustrata nella figura 1 e segue il processo stepwise: Sintesi solida automatica → DeprOzione → purificazione → quantificazione → caratterizzazione. La Figura 2 mostra le unità monomeriche necessarie in questa procedura. La sintesi in fase solida di RNA è simile a quella del DNA che si basa su fosforammidito chimica (Figura 2, sinistra) e l&#39;uso di gruppi protettivi di base-labile per le ammine esociclici nucleofile in G, A e C, ad esempio, Acetil, benzoile, fenossiacetil, t- butile o N , N- dimetilformamide ( figura 2 , a destra). Un altro aspetto da considerare in RNA, dovuto alla presenza del gruppo C2&#39;-OH (che non presenta i biopolimeri deoxyoligonucleotidi), è la fase supplementare che deve essere incorporata per la protezione e la successiva deprotezione di questa posizione nucleofila. A questo proposito, i gruppi di protezione a base di silicio sono diventati una strategia attraente per il loro potenziale come parti biortogonali (specificamenteSi è deprotected in presenza di fluoruro), con gruppi di terz- butilidimetilsilil (TBDMS) e triisopropilsililossimetil (TOM) come scelte popolari ( Figura 2 , in basso a sinistra). In questo lavoro, la sintesi automatizzata è stata effettuata su un sintetizzatore DNA / RNA che utilizza la chimica standard di fosforamidite. Le impostazioni del produttore sullo strumento includono una fase di diluizione automatica quando si utilizzano le versioni commerciali dei fosforamiditi per il DNA o l&#39;opzione di diluire a volumi impostati dall&#39;utente. Tuttavia, abbiamo deciso di pesare l&#39;fosforamidite di RNA e diluire manualmente in quanto: 1) il prezzo delle fosforamiditi canoniche dell&#39;RNA è maggiore (in alcuni casi fino a 50 volte più costoso); 2) i fosforamiditi modificati vengono spesso ottenuti in piccole quantità; E 3) la quantità di materiale sprecato dopo l&#39;utilizzo di una fase di diluizione automatica (impostata dal produttore) è grande. Inoltre, abbiamo usato: 1) supporti solidi disponibili in commercio(Ad esempio , CPG) contenente una nucleobase protetta per funzionare come 3&#39;-end; E 2) fosforamiditi commerciali (nucleobasi canonici) protetti con un gruppo TBDMS alla posizione C2&#39;- O . L&#39;elenco dettagliato delle fasi di sintesi è fornito in Figura 3 e Tabella 1 , insieme ad ulteriori descrizioni e commenti per i passi che sono stati regolati per la sintesi di RNA. Inoltre, la Figura 4 illustra le rese graduali osservate per ogni passo dopo aver selezionato l&#39;opzione &#39;Trityl Monitor&#39;, che quantifica il tritio cation rilasciato da ogni fase di detritilazione. Vale la pena notare che tipicamente, nella nostra esperienza, il fattore limitante stava ottenendo il fosforamidite contenente la modifica desiderata. Cioè lo sviluppo di una metodologia sintetica che consente l&#39;inserimento di modifiche in siti selezionati. In questa relazione, ci concentriamo sulIncorporazione di un nucleotide modificato per il quale abbiamo stabilito la corrispondente metodologia sintetica, il gruppo C2&#39;- O- tiofenilmetile. Questo gruppo è di taglia piccola e non influenza la sintesi a fase solida in alcun modo. Dal momento che è stata riportata l&#39;incorporazione di questo gruppo in oligonucleotidi di RNA, insieme ai parametri strutturali e termodinamici 4 , non saranno descritti aspetti della sintesi organica che conduce alle modificate fosforamidite. Deprotezione, depurazione e caratterizzazione La deprotezione delle amine esociclici e dei gruppi ß-cianoetil si verifica nello stesso passo di quello della scissione della resina CPG. Abbiamo applicato le condizioni comunemente utilizzate per riscaldare la resina ottenuta in presenza di una soluzione acquosa di AMA, seguita dalla scissione dei gruppi C2&#39;- O- sililici in presenza di ioni di fluoruro e quindi di purificazione mediante gelelettroforesi. Mentre questi sono diventati condizioni standard in molti casi, modifiche che sono labili a condizioni di base o ioni fluoruro può richiedere condizioni più blande 13, 14, ad esempio, carbonato di metanolo / potassio (MeOH / K 2 CO 3), o butilammina. Pertanto, è necessario un diverso insieme di gruppi protettivi sui corrispondenti fosforamiditi. Inoltre, abbiamo scelto l&#39;elettroforesi come alternativa preferita per purificare gli oligomeri deprotected dato la nostra precedente esperienza con questo metodo e la mancanza di altre strumentazioni. Tuttavia, la HPLC può essere utilizzata alternativamente come un metodo efficace 15 . La caratterizzazione degli oligonucleotidi purificati è stata effettuata mediante spettrometria di massa, desorbimento / ionizzazione-tempo di volo (MALDI-TOF) assistita dalla matrice, utilizzando una procedura riportata dal nostro gruppo 16 . Caratterizzazione strutturale e ther<html> La stabilità stabile dei duplex ottenuti è stata effettuata tramite CD. In particolare, facciamo uso di CD per determinare le transizioni di denaturazione termica di oligonucleotidi modificati e non modificati di RNA seguendo la diminuzione dell&#39;elettricità della banda a ca. 270 nm, come pure la scomparsa della banda (con ellitticità negativa) con un λ max a 210 nm. Un confronto di spettri prima e dopo l&#39;ibridazione viene fornito per illustrare le loro differenze e fornire la convalida della metodologia impiegata. L&#39;uso del CD è ampiamente accettato nella determinazione di motivi strutturali negli acidi nucleici e negli aminoacidi 17 e può quindi essere impiegato come strumento per determinare diversi parametri strutturali e termodinamici 18 ; Tuttavia, non esistono molti esempi in cui la tecnica viene utilizzata per valutare le transizioni di denaturazione termica. Alcuni casi includono la determinazione di stabilità termica su DNA contenente G-quadruplexesAss = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 o in duplex e hairpins di RNA 21 . Questo rapporto intende fornire al lettore o al visualizzatore non esperti un insieme di strumenti che consentono un inizio regolare di questo tipo di ricerca. Sarà utile migliorare e confrontare con metodologie e tecniche in altri laboratori di ricerca che sono coinvolti in questo eccitante ramo della scienza. Il contenuto di questa relazione aggiunge i protocolli esistenti di questa tecnologia da varie fonti e arricchisce e facilita l&#39;esperienza con un aiuto visivo per ogni passaggio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="778">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:445px;">AbsolveTM</td>
			<td style="width:152px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:117px;">6NE9711</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylamide, 99+%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>164850025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride 98+%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Fluoride&#160; 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>1444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Argon-ultra high purity</td>
			<td>&#160;Airgas</td>
			<td>7440-37-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bis-acrylamide Ultra pure</td>
			<td>VWR-Amresco</td>
			<td>172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A73-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, anhydrous, histological grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formamide&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-12-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol, 99.9%,&#160; HPLC Grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methylamine 40% in water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>872-50-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&#160;</td>
			<td>MDS SCIEX</td>
			<td>1020157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13472-35-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2&#8217;,4&#8217; Triethylamine, 99+%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>121-44-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEMED</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>73602-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid, 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urea</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents for the RNA synthesis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>&#160;40-4140-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4110-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4120-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>&#160;30-3140-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>40-4330-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-RNA-CPG</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>20-3330-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-G-RNA-CPG&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>20-3324-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-G-CE Phosphoramidite&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3025-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U-CE Phosphoramidite</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3030-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ac-C-CE Phosphoramidite</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3015-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bz-A-CE Phosphoramidite&#160;</td>
			<td>Glen Research</td>
			<td>10-3003-xx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of rna containing a 2'-o-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism

La sintesi a fase solida è stata utilizzata per ottenere polimeri canonici e modificati di acidi nucleici, in particolare di DNA o RNA, che lo ha reso una metodologia popolare per applicazioni in vari settori e per scopi diversi di ricerca. La procedura qui descritta si concentra sulla sintesi, la purificazione e la caratterizzazione di dodecameri di RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; contenenti zero, una o due modifiche situate alla posizione C2&#39;- O . Le sonde sono basate sui gruppi 2-tiofenilmetilici, incorporati in nucleotidi RNA tramite la sintesi organica standard e introdotti nei corrispondenti oligonucleotidi attraverso i loro rispettivi fosforamiditi. Questo rapporto si avvale di fosforammidite chimica attraverso i quattro basi azotate canoniche (uridina (U), citosina (C), guanosina (G), l&#39;adenosina (A)), nonché 2-thiophenylmethyl nucleotidi modificati funzionalizzati al 2&#39;- O - posizione; Tuttavia, la metodologia è amenable per un grande varLe modifiche che sono state sviluppate nel corso degli anni. Gli oligonucleotidi sono stati sintetizzati su un supporto a vetrino controllato (CPG) seguito da scissione dalla resina e deprotezione in condizioni standard, vale a dire una miscela di ammoniaca e metilammina (AMA) seguita da idrogeno fluoruro / trietilammina / N-metilpirrolidinone. I corrispondenti oligonucleotidi sono stati purificati mediante elettroforesi in poliacrilammide (denaturazione del 20%) seguita da eluizione, disidratazione e isolamento mediante cromatografia a fase inversa (Sep-pak, C 18- colonna). Quantificazione e parametri strutturali sono stati valutati, rispettivamente, mediante l&#39;analisi fotometrica a raggi ultravioletti (UV-vis) e circolare dichroismo (CD). Questo rapporto mira a servire come risorsa e guida per i principianti e per i ricercatori esperti interessati ad intraprendere questo settore. Si prevede di essere un lavoro in corso, in quanto si sviluppano nuove tecnologie e metodologie. La descrizione delle metodologie e delle tecniche in essoS corrispondono a un DNA / RNA sintetizzatore (rinnovato e acquistato nel 2013) che utilizza la chimica di fosforamidite.

Viene descritta la sintesi di dodecameri RNA contenenti zero, uno o due modificazioni 2-tiofenilmetilico alla posizione C2&#39;- O, insieme alla sua corrispondente purificazione e caratterizzazione. Inoltre, è inclusa una descrizione dettagliata dell&#39;analisi strutturale eseguita tramite CD. I quattro fili di RNA (incluso uno strato con una sequenza complementare) sono stati ottenuti mediante sintesi a fase solida, seguito da una resa di purificazione tra 300 e 700 nmol di ciascun oligonucleotide. La spettrometria di massa è stata effettuata desalinando ~ 150 pmol di ciascun campione e quindi deposto su una piastra per l&#39;analisi MALDI-TOF ( Figura 5 ). La quantificazione è stata effettuata mediante l&#39;analisi fotometrica ultravioletta di ciascuna soluzione, mentre il CD è stato utilizzato per identificare la formazione di strutture duplex e registrare i loro corrispondenti T m. Non si osserva alcuna differenza chiara tra oligonucleotidi canonici e modificati, mediante spettroscopia UV-vis, sia che si confrontino campioni monotubo o strutture duplex. Tuttavia, sono osservati piccoli cambiamenti quando si misura la loro spettro dei CD ( Figura 6 ). Inoltre, T m misure delle tre strutture duplex visualizzati un valore distinto che è indicativo della destabilizzazione indotta dalla incorporazione del 2&#39;-O-thiophenylmethyl modifica su uno dei fili. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig1.jpg" /> Figura 1 : Procedura per ottenere fili RNA. Ciclo a fase solida utilizzando CPG come supporto solido e 5-etiltiotetrazolo come attivatore: ( i ) detritilazione; Ii ) accoppiamento; ( Iii ) ossidazione; ( Iv ) la copertura e il nuovo ciclo; Per produrre il corresponOligonucleotide ( v ) supportato sulla resina CPG e contenente tutti i gruppi protettivi; E la successiva deprotezione in presenza di base e fluoro ( vi ) per ottenere l&#39;oligonucleotide finale di RNA per ulteriori analisi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig2.jpg" /> Figura 2 : Strutture di fosforamiditi e gruppi protettivi. La struttura chimica dei gruppi C2&#39;- O a base di sililato e gruppi labili di base sulle ammine esociclici di A, G e C. Il gruppo O- TBDMS è stato utilizzato in questo studio. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande</a>N di questa figura. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig3.jpg" /> Figura 3 : Sintesi stepwise degli oligonucleotidi corrispondenti. Il ciclo è stato modificato come mostrato e una destra per i codici e le portate utilizzati. La sintesi graduale è stata incollata dal software fornito. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig4.jpg" /> Figura 4 : Rappresentazione dei rendimenti ottenuti e monitoraggio dei giunti individuali. L&#39;esempio mostrato è stato adattato dalla sintesi del complemento per mostrare una tipica sintesi di oligonucleotidiè. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig5.jpg" /> Figura 5 : MS di oligonucleotidi (ON) 1-3. MALDI-TOF di ON 1 - 3 (dall&#39;alto verso il basso). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56189/56189fig6.jpg" /> Figura 6 : Spettri CD di RNA singolo e doppio filamento, Canonical e modificati. Spettri CD di campioni contenenti zero ( 1 , A), uno ( 2 , B) o due ( <stroNg&gt; 3, C) prima (blu) e dopo (ibridi) ibridazione. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56189/56189fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189table1.jpg" /> Tabella 1: Calcolo della soluzione di fosforamidite.

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Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Questo articolo fornisce una procedura dettagliata sulla sintesi a fase solida, la purificazione e la caratterizzazione di dodecameri di RNA modificati nella posizione C2&#39;- O . Le analisi fotometriche UV-vis e dicroismo circolare sono utilizzate per quantificare e caratterizzare gli aspetti strutturali, cioè singoli fili o doppioni.

Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl Modifica e caratterizzazione attraverso il Dicroroo circolare

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

18.8K Views.  University of Colorado Denver.  Questo articolo fornisce una procedura dettagliata sulla sintesi a fase solida, la purificazione e la caratterizzazione di dodecameri di RNA modificati nella posizione C2'- O . Le analisi fotometriche UV-vis e dicroismo circolare sono utilizzate per quantificare e caratterizzare gli aspetti strutturali, cioè singoli fili o doppioni. 

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Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Ricerca

Chimica

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Sintesi e caratterizzazione di funzionalizzato metallo-organici quadri

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. The most common techniques utilized are imaging modalities such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emission Topography (PET), and Computed Topography (CT) and are optimal for understanding the physical structure of the disease but can only be performed once every four to six weeks due to the use of imaging agents and overall cost. With this in mind, the development of &#8220;point of care&#8221; techniques, such as biosensors, which evaluate the stage of disease and/or efficacy of treatment in the clinician&#8217;s office and do so in a timely manner, would revolutionize treatment protocols.1 As a means to exploring ferrocene based biosensors for the detection of biologically relevant molecules2, methods were developed to produce ferrocene-biotin bio-conjugates described herein. This report will focus on a biotin-ferrocene-cysteine system that can be immobilized on a gold surface.

The synthesis of asymmetric species of ferrocene is challenging using solution techniques. This report focuses on the methods carried out to produce a ferrocene-biotin bioconjugate using facile and clean reactions accomplished via solid-phase synthesis. Incorporation of a thiolate moiety is shown to impart the ability for immobilization on gold surfaces.

Metodologia sintetico per Asymmetric Ferrocene derivati ​​sistemi bio-coniugati attraverso Solid Metodologia Resina a base di fase

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the hydroxylmethylene phosphine precursor with ammonia in methanol under a nitrogen atmosphere. The N-triphosPh ligand precipitates from the solution after approximately 1 hr of reflux and can be isolated analytically pure via simple cannula filtration procedure under nitrogen. Reaction of the N-triphosPh ligand with [Ru3(CO)12] under reflux affords a deep red solution that show evolution of CO gas on ligand complexation. Orange crystals of the complex [Ru(CO)2{N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (2) were isolated on cooling to RT. The 31P{1H} NMR spectrum showed a characteristic single peak at lower frequency compared to the free ligand. Reaction of a toluene solution of complex 2 with oxygen resulted in the instantaneous precipitation of the carbonate complex [Ru(CO3)(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (3) as an air stable orange solid. Subsequent hydrogenation of 3 under 15 bar of hydrogen in a high-pressure reactor gave the dihydride complex [RuH2(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P] (4), which was fully characterized by X-ray crystallography and NMR spectroscopy. Complexes 3 and 4 are potentially useful catalyst precursors for a range of hydrogenation reactions, including biomass-derived products such as levulinic acid (LA). Complex 4 was found to cleanly react with LA in the presence of the proton source additive NH4PF6 to give [Ru(CO){N(CH2PPh2)3}-&#954;3P{CH3CO(CH2)2CO2H}-&#954;2O](PF6) (6).

The Synthesis, Characterization and Reactivity of a Series of Ruthenium N-triphosPh Complexes

Ruthenium phosphine complexes are widely used for homogeneous catalytic reactions such as hydrogenations. The synthesis of a series of novel tridentate ruthenium complexes bearing the N-triphos ligand N(CH2PPh2)3 is reported. Additionally, the stoichiometric reaction of a dihydride Ru&#8211;N-triphos complex with levulinic acid is described.

La sintesi, caratterizzazione e reattività di una serie di rutenio<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Complessi

Herein we report the synthesis of a tridentate phosphine ligand N(CH2PPh2)3 (N-triphosPh) (1) via a phosphorus based Mannich reaction of the ...

A Direct, Early Stage Guanidinylation Protocol for the Synthesis of Complex Aminoguanidine-containing Natural Products

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important structural element found in many complex natural products and pharmaceuticals. Owing to the continual discovery of new guanidine-containing natural products and designed small molecules, rapid and efficient guanidinylation methods are of keen interest to synthetic and medicinal organic chemists. Because the nucleophilicity and basicity of guanidines can affect subsequent chemical transformations, traditional, indirect guanidinylation is typically pursued. Indirect methods commonly employ multiple protection steps involving a latent amine precursor, such as an azide, phthalimide, or carbamate. By circumventing these circuitous methods and employing a direct guanidinylation reaction early in the synthetic sequence, it was possible to forge the linear terminal guanidine containing backbone of clavatadine A to realize a short and streamlined synthesis of this potent factor XIa inhibitor. In practice, guanidine hydrochloride is elaborated with a carefully constructed protecting array that is optimized to survive the synthetic steps to come. In the preparation of clavatadine A, direct guanidinylation of a commercially available diamine eliminated two unnecessary steps from its synthesis. Coupled with the wide variety of known guanidine protecting groups, direct guanidinylation evinces a succinct and efficient practicality inherent to methods that find a home in a synthetic chemist&#39;s toolbox.

Here, we present a protocol for direct, early stage guanidinylation that enables rapid total synthesis of aminoguanidine-containing small organic molecules. An advanced synthetic intermediate used in the synthesis of a blood coagulation factor XIa inhibitor was prepared using this protocol.

Un diretto, Early Stage Guanidinylation protocollo per la sintesi di complessi Aminoguanidine contenenti prodotti naturali

The guanidine functional group, displayed most prominently in the amino acid arginine, one of the fundamental building blocks of life, is an important ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

Protocollo per la sintesi di<em&gt; Ortho</em&gt; Derivati ​​all&#39;anilina -trifluoromethoxylated

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Sintesi e caratterizzazione di supramolecolari colloidi

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

A secco microfluidic-spinning e caratterizzazione delle fibre rigenerate seta Fibroin

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.