Wir erkennen die Unterstützung der Workshops und der Tierfazilität des Instituts für Neurophysiologie an. Diese Arbeit wurde von der Walter und Marga Boll- Stiftung, Köln Fortune und der Deutschen Stiftung für Herzforschung unterstützt.

Die Tierhaltung muss den Richtlinien des örtlichen Tierschutzausschusses und der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments entsprechen. 1. Lösungen vorbereiten <ol><li> Die Lösung von Tyrode ohne Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, 2,3-Butandionmonoxim (BDM) 30. pH-Wert auf 7,4 einstellen Mit NaOH bei 4 ° C. </li><li> Die Lösung von Tyrode mit Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH bei 4 ° C einstellen. </li><li> 4% niedrigschmelzende Agarose vorbereiten: 0,6 g Schmelzklebstoff in 15 ml Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ geben . Die Mischung in einem Mikrowellenofen zweimal bei 750 W für 10-15 s erhitzen, bis die Agarose aufgelöst ist. Halten Sie die Lösung bei einer konstanten Temperatur von 37 &amp;# 176, C und rühren kontinuierlich. </li><li> Halten Sie Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Serum bei 37 ° C mit Carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ) geblasen. </li></ol> 2. Bereiten Sie das Mikrotom vor <ol><li> Schalte das Mikrotom ein. </li><li> Füllen Sie die äußere Mikrotomkammer mit Eis. </li><li> Füllen Sie die innere Mikrotomkammer mit eiskalter Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ und kontinuierlich die Lösung mit 100% O 2 an . </li><li> Legen Sie eine Stahlklinge in den Messerhalter des Mikrotoms. </li></ol> 3. Maus Herzisolation <ol><li> 2500 U Heparin subkutan injizieren Warte 15 min. </li><li> Das Tier durch zervikale Versetzung opfern </li><li> Öffne die truhe durch sternotomie. </li><li> Sorgfältig das Perikard mit einer kleinen Schere und einer Pinzette # 5 sezieren. </li><li> Setzen Sie eine Kanüle in die aufsteigende Aorta ein und benennen Sie die Koronararterien in situ mit eiskaltem TyrodeLösung ohne Ca 2+ bis das übrige Blut entfernt wird. </li><li> Vorspeisen Sie das Herz mit einer Pinzette und einer Schere und überträgt das Herz in eiskaltes Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ . </li><li> Trennen Sie die Vorhöfe von den Ventrikeln mit einem Skalpell oder einer Schere. </li></ol> 4. Einbettung der Ventrikel in 4% niedrigschmelzende Agarose <ol><li> Legen Sie die Ventrikel mit der Spitze nach oben in die Agarose-Form (Abbildung 1 ). Legen Sie den Stift in die Mitte der Form in die linke Kammerkammer. </li><li> Füllen Sie die Form mit 4% niedrigschmelzender Agarose bei 37 ° C, bis das Herz vollständig bedeckt ist. </li><li> Legen Sie die Form auf Eis für eine schnellere Aushärtung der Agarose, die das Schwimmen des Gewebes verhindert. </li><li> Entfernen Sie den Agaroseblock, der die Ventrikel enthält, aus der Form mit einem Skalpell. </li><li> Drehen Sie den Block umgedreht und füllen Sie die ventrikulären Kammern und die Lücke auf der Rückseite des Agarose-Blocks, die iS durch den Stift der Molte, mit 4% niedrigschmelzender Agarose unter Verwendung einer Spritze mit einer 20 G-Nadel. </li><li> Trimmen Sie den Agaroseblock mit einem Skalpell, um einen flachen Boden des Blocks und die aufrechte Position des Herzscheitels zu erreichen. </li></ol> 5. Das ventrikuläre Gewebe schneiden <ol><li> Fixieren Sie den Block auf dem Probenhalter des Mikrotoms mit einem Tropfen Cyanacrylat-Leim. Gesicht der Herzschärfe nach oben. </li><li> Legen Sie den Probenhalter in die innere Probenkammer des Mikrotoms, die mit eiskaltem Tiroler ohne Ca 2+ gefüllt ist. Den Agaroseblock vollständig mit der Tyrode-Lösung abdecken. </li><li> Kleine Achsenscheiben in einer Dicke von 150-400 μm vorbereiten, abhängig von der weiteren Anwendung (bei scharfen Elektrodenaufnahmen 150-200 μm), die Vibrationsfrequenz der Klinge bei 60-70 Hz halten und die Klinge so langsam wie möglich nach vorne bewegen . </li><li> Verwenden Sie eine feine Bürste, um die verbleibende Agarose vorsichtig aus den Scheiben zu entfernen. </li><li> Sanft transfR Scheiben mit einer Pasteurpipette in die Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca 2+ belüftet mit 100% O 2 und lagern sie für mindestens 30 min auf Eis, um sich aus dem Schneidvorgang zu erholen. </li><li> Danach 30 Minuten in DMEM bei 37 ° C aufbewahren, mit Carbogen belüftet, BDM vor der weiteren Verwendung abwaschen. </li></ol> 6. Vorbereitung der Sharp Electrode Setup <ol><li> Zum Vorheizen alle elektrischen Geräte 30 min einschalten, bevor die Aufnahmen beginnen. </li><li> Setzen Sie eine 3 cm Zellkulturschale auf die Heizplatte, die auf dem invertierten Mikroskop platziert ist. </li><li> Legen Sie die maßgeschneiderte Ringelektrode (Abbildung 2 ) in die Schale und verbinden Sie die Erdungsdrähte des Vorverstärkers und der Stimulationselektrode. </li><li> Verbinden Sie die flexiblen Rohre des Perfusionssystems mit der Schale. </li><li> Füllen Sie das Reservoir des Perfusionssystems mit DMEM, belüftet mit Carbogen. </li><li> Schalte die Perfusionspumpe ein und setze die Perfusion raTe bis 2-3 mL / min. </li><li> Stellen Sie die Temperatur von DMEM in der Schale auf 37 ° C ein, indem Sie den Durchlauferhitzer und die Heizplatte regeln. </li></ol> 7. Aktion Potenzielle Aufnahmen <ol><li> Legen Sie eine ventrikuläre Scheibe in die DMEM gefüllte Schale. </li><li> Überprüfen Sie die strukturelle Integrität und Lebensfähigkeit (auf der Grundlage der kontraktilen Funktion) des Gewebes mit dem invertierten Mikroskop. </li><li> Füllen Sie eine Aufzeichnungsglaselektrode mit 3 M KCL. </li><li> Füllen Sie eine Stimulationselektrode mit DMEM. </li><li> Legen Sie die Aufzeichnungselektrode und die Stimulationselektrode auf die Elektrodenhalter. </li><li> Legen Sie die Stimulationselektrode sorgfältig auf die Scheibe und schalten Sie den elektrischen Stimulator ein. Beginnen Sie mit einer Stimulationsfrequenz von 1-2 Hz. </li><li> Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode mit dem Mikromanipulator über die vorgesehene Aufnahmeposition. </li><li> Langsam die Aufzeichnungselektrode absenken, bis die Spitze das Gewebe berührt. </li><li> Tragen Sie einen kurzen rechteckigen elektrischen Puls durch dieAufzeichnungselektrode, um die Zellmembran zu durchdringen. </li><li> Setzen Sie die Aufzeichnungselektrode sorgfältig ein, bis ein stabiles Signal gewährleistet ist. </li><li> Starten Sie die Aufnahme von Aktionspotentialen. </li></ol>

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	<li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro.">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. 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Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li><li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2,3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes.">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li><li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development.">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li><li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage:+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Ventrikuläre Scheiben ermöglichen elektrophysiologische, pharmakologische und mechanische Untersuchungen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und einem direkten Zugang der Messtechnik zu allen Regionen des Herzens. Physiologische Wirkungspotentialeigenschaften wurden in embryonalen, neonatalen und erwachsenen Scheiben 9 , 10 , 11 nachgewiesen. Die Vitalität der Scheiben, mit Ausnahme der Oberflächenschichten, die durch das Schneidverfahren direkt beschädigt wurden, wurde durch Vitalfärbung bestätigt 9 . Aktionspotentialaufnahmen innerhalb der Scheiben unter Verwendung von scharfen Glaselektroden können verwendet werden, um die Integration und Reifung von transplantierten Kardiomyozyten, wie hier beschrieben, oder für pharmakologische Untersuchungen nach der Zugabe von kardioaktiven Verbindungen zu untersuchen. Langzeitaufnahmen mit einer Dauer von einer Stunde oder mehr in einer einzelnen Zelle sind möglich. Diese Aufnahmedauer reicht aus, um zu testenDie Auswirkung verschiedener pharmakologischer Verbindungen auf eine Zelle durch sequentielle Perfusion und Auswaschung. Kritische Vorbereitungsschritte Zur Optimierung der Scheibenqualität sollte ischämische Gewebeschädigung vermieden werden. Daher werden die Perfusion des Herzens in situ mit Tyrode-Lösung, schnelle Herzresektion und sofortige Konservierung in eiskalter, mit Sauerstoff angereicherter Tyrode-Lösung als entscheidend angesehen. Die Immobilisierung des schlagenden Herzens unter Verwendung von 2,3-Butandionmonoxim kann die Anfälligkeit für Ischämie weiter verringern und ist für eine feste Einbettung in niedrigschmelzende Agarose erforderlich. Einbetten in niedrigschmelzende Agarose könnte die Gewebeversorgung durch Begrenzung der Diffusion behindern, ist aber wichtig, um das weiche Herzgewebe vor dem Schneiden zu stabilisieren. Kleine Hohlräume innerhalb des Probenblocks, z. B. ventrikuläre Kammern, die nicht vollständig mit Agarose oder verbleibenden Luftblasen gefüllt sind, könnten die Gewebestabilisierung behindern. Unstabilisiertes Myokardgewebe bietet keine ausreichende ResisTanzen zum Vibrationsmesser, was zu schweren Gewebeunterbrechungen und Schäden führt. Um einen klaren Schnitt zu gewährleisten und die Gewebeschädigung zu minimieren, sollten die Klingen scharf sein ( dh nicht mehr als dreimal wiederverwendet werden), und die Vorwärtsbewegung der Klinge durch den Probenblock sollte so langsam wie möglich sein, da stumpfe Klingen oder Überdrehungen das lösen können Eingebettete Ventrikel oder lacerieren das Gewebe. Um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, sollte die Qualität der Scheiben spezifische Kriterien erfüllen, einschließlich der strukturellen Integrität des Gewebes, die durch Mikroskopie bestätigt werden kann, und die Reaktion auf elektrische Stimulation bei physiologischen Schläge bis zu 10 Hz. Scheiben können je nach Anwendungsfall mit einer Dicke von 150-400 μm geschnitten werden. Während dünnere Scheiben hypoxische Zustände im Gewebekern verhindern und einen leichteren Nachweis von transplantierten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop sowie eine präzisere Positionierung ermöglichen könnenAufzeichnungselektroden 15 können dickere Scheiben eine bessere Integrität der Gewebestruktur und eine höhere Stabilität des Gewebes bereitstellen, was für Kraftmessungen 10 und eine weitere histologische Verarbeitung nach Aufnahmen vorteilhaft sein wird. Um mögliche Einflüsse hoher BDM-Konzentrationen auf Ionenkanälen und Ca 2+ -Handhabungsproteinen 16 , 17 zu vermeiden, wird eine BDM-Auswaschung durch Inkubation von Scheiben in BDM-freiem DMEM für mindestens 30 min vor der weiteren Verwendung empfohlen. Überraschenderweise beeinträchtigen die Kontraktion und die anschließende Bewegung des Gewebes nach dem BDM-Auswaschen keine scharfen Elektrodenaufnahmen. Einschränkungen Im Gegensatz zu herkömmlichen Zellkulturmodellen liefern Scheiben eine intakte Gewebestruktur, einschließlich konservierter elektrischer und mechanischer Zelle zu Zellverbindungen, extrazelluläre Matrix und Verteilung von KardiomyocyTes und non-myozyten innerhalb des nativen Gewebes 6 . Allerdings entsprechen Herzgewebescheiben nicht exakt der in vivo- Situation, da sie nur 150 - 400 μm dick sind und von künstlichem Medium geliefert werden und während des Herstellungsprozesses beschädigt werden können. Trypan-Blau-Färbung und immunhistologische Auswertung von aktivem Caspase-3 und PARP-p85-Fragment zeigten, dass Zellen innerhalb embryonaler Scheiben, mit Ausnahme derjenigen in den Oberflächenschichten, nach dem Aufschneiden lebensfähig waren 9 . Das Leitungssystem ist nicht in ventrikulären Scheiben erhalten, und die Erregungsstrecke ist zweidimensional und nicht dreidimensional in den flachen Scheiben. Scheiben aus embryonalen Herzen zeigen spontanes Schlagen für bis zu zwei Wochen in Kultur 9 . Spontane Kontraktionen von erwachsenen Scheiben können auch auftreten, und es ist unklar, ob sie durch Zellen des Leitungssystems induziert werden oder auf Zellschäden und Ca 2+ Overl hindeuten könnenOad 18 Zukünftige Anwendungen Neben elektrophysiologischen Untersuchungen mit scharfen Elektroden und Mikroelektroden-Arrays, die für pharmakologische Experimente zur Analyse des Einflusses von Arzneimitteln auf Aktionspotentialeigenschaften und Anregungsspanne 11 , Entwicklungsstudien 19 oder Charakterisierung von transplantierten Kardiomyozyten 15 , wie oben gezeigt, ventrikuläre Neonatalscheiben verwendet werden können Herzen wurden für Kraftkontraktionsmessungen 10 verwendet, die auch auf erwachsene Scheiben angewendet werden könnten. Weitere mögliche zukünftige Anwendungen sind (I) Langzeitmikroskopie-Studien in kultivierten Scheiben, z. B. zur Beurteilung der strukturellen Integration von injizierten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, (II) Injektion von Spaltübergang permeablen Farbstoffen zu untersuchten interzellulären Kopplung oder (III) Studien von Endothel Und vaskuläre Funktion der KoronaRy Schiffe innerhalb der Scheiben. Abschließend sind ventrikuläre Scheiben ein wertvolles multizellulares Gewebemodell mit konservierter in vivoähnlicher Struktur, die dazu beitragen können, Beschränkungen von gemeinsamen Zellkulturmodellen zu überwinden und auf eine breite Palette pharmakologischer, physiologischer, entwicklungs- und zelltherapeutischer Studien anwendbar zu sein.

Dünngewebescheiben wurden in der Grundwissenschaft häufig verwendet, da Yamamot und Mcllwain 1966 zeigten, dass die elektrische Aktivität von Hirnschnitten in vitro 1 aufrechterhalten wird . Seither wurden elektrophysiologische und pharmakologische Studien an Scheiben aus Gehirn 2 , Leber 3 , Lunge 4 und Myokardgewebe 5 , 6 , 7 durchgeführt. Erste Patch-Clamp-Aufnahmen in ventrikulären Scheiben aus neonatalen Rattenherzen wurden im Jahre 1990 beschrieben 8 , aber diese Technik fiel für einige Zeit in Vergessenheit. Mehr als ein Jahrzehnt später, unsere Gruppe eine neue Methode zur Vorbereitung murine embryonalen 9 , neonatale 10 und erwachsenen 11 Herz-Scheiben. Diese lebensfähigen Gewebeschnitte können für akute Experimente (erwachsene Scheibe) verwendet werdenS kann für mehrere Stunden kultiviert werden) oder kurzfristige Kulturversuche (embryonale und neonatale Scheiben können für einige Tage kultiviert werden). Die Scheiben zeigen in vivo wie elektrophysiologische Eigenschaften und eine homogene Anregungsspanne, wie sie durch scharfe Elektrodenwirkungspotentiale und Mikroelektrodenanordnungen aufgezeichnet wird 11 . Aufgrund ihrer &quot;zweidimensionalen&quot; Morphologie erlauben sie den direkten Zugang von Aufzeichnungselektroden zu allen Bereichen des Ventrikels, was sie zu einem interessanten Werkzeug für elektrophysiologische Untersuchungen macht und im Vergleich zu Langendorff-perfundierten Herzen ganz neue experimentelle Möglichkeiten aufwirft. Arzneimittelreaktion der Scheiben auf Ionenkanalblocker wie Verapamil (L-Typ Ca 2+ -Kanalblocker), Lidocain (Na + -Kanalblocker), 4-Aminopyridin (unselektivspannungsabhängiger K + -Kanalblocker) und Linopirdin (KCNQ K + -Kanal-Blocker) 9 , 11 </suP&gt; entsprach den bekannten Wirkungen auf dissoziierten Kardiomyozyten. Isometrische Kraftmessungen zeigten eine positive Kraftfrequenzbeziehung und drängten eine intakte kontraktile Funktion 10 . Diese Ergebnisse zeigten, dass murine ventrikuläre Scheiben als in vitro Gewebemodell für physiologische und pharmakologische Studien geeignet sind. Darüber hinaus haben sich die ventrikulären Scheiben der Empfängerherzen in Kombination mit scharfen Elektrodenaufnahmen als sehr hilfreiches Werkzeug erwiesen, um die elektrische und mechanische Integration sowie die Reifung der transplantierten fetalen 12 , 13 , 14 und der Stammzellen-abgeleiteten 15 Kardiomyozyten zu charakterisieren. Zusammenfassend sind ventrikuläre Scheiben ein wertvolles und gut etabliertes multizellulares Gewebemodell und sollten als komplementär zu dissoziierten Kardiomyozyten und Langendorff-perfundierten Herzen betrachtet werdenIn der Herz-Kreislauf-Forschung mit dem großen Vorteil der Bereitstellung einer in vivoähnlichen Gewebestruktur (im Gegensatz zu dissoziierten Zellen) sowie direkten Zugang von Messtechniken wie scharfe Elektrodenaufnahmen zu allen Regionen des Herzens (im Gegensatz zu ganzen Herzpräparaten).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Leica VT 1000s</td>
			<td style="width:340px;">Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;">Microtome with vibrating blade.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Stainless Steel Blades</td>
			<td style="width:340px;">Campden Instruments, Loughborough, England</td>
			<td>7550-1-SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td>Z627992&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Fine brush, e.g. size 6 (4/32&#34;)</td>
			<td style="width:340px;">VWR, International, Radnor, USA</td>
			<td>149-2125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Preparation table</td>
			<td style="width:340px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;">self made</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Molt for embedding ventricles in agarose</td>
			<td style="width:340px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;">self made</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:248px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:340px;">Becton, Dickinson;&#160; Franklin Lakes, USA</td>
			<td>300013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">27Gx3/4`` Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:340px;">Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4657705</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">20G 11/2`` Needles</td>
			<td>4657519</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Small scissor</td>
			<td style="width:340px;">WPI, Sarasota, USA</td>
			<td>501263</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td>
			<td style="width:340px;">WPI, Sarasota, USA</td>
			<td>500342</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Oxygen gas (medical grade O2)</td>
			<td style="width:340px;">Linde, Munich, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2)&#160;</td>
			<td style="width:340px;">Linde, Munich, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">NaCL</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">KCL</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">746436</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:248px;">CaCl2</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">746495</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:248px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">NIST200B&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">HEPES</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">51558</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:248px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">S5761&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">D(+)-Glucose</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">G8270&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:248px;">MgSO4</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">M7506&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">NaOH</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">S8045&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:340px;">Henkel, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Low-melt Agarose&#160;</td>
			<td style="width:340px;">Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:140px;">6351.2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Heparin-sodium-25000 I.E./5mL</td>
			<td style="width:340px;">Ratiopharm, Ulm, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td>
			<td style="width:340px;">ThermoScientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:140px;">10566016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">SEC-10LX Amplifier</td>
			<td style="width:340px;">npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td>
			<td>SEC-10LX</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">EPC 9</td>
			<td style="width:340px;">HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Zeiss Axiovert 200</td>
			<td style="width:340px;">Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">&#160;Low magnification Micromanipulator</td>
			<td style="width:340px;">Narashige, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:140px;">Nm-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">High magnification, three-axis micromanipulator</td>
			<td style="width:340px;">Narashige, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:140px;">MHW-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Peristaltic perfusion pump</td>
			<td style="width:340px;">Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td>
			<td style="width:140px;">PPS2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">2-channel temperature controller</td>
			<td style="width:340px;">Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td>
			<td style="width:140px;">TCO02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Square pulse stimulator</td>
			<td style="width:340px;">Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td>
			<td style="width:140px;">Grass SD9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:340px;">WPI, Sarasota, USA</td>
			<td style="width:140px;">1B150F-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies

Murine Kardiomyozyten wurden weitgehend für In-vitro- Studien der Herzphysiologie und neue therapeutische Strategien verwendet. Allerdings sind multizelluläre Präparate von dissoziierten Kardiomyozyten nicht repräsentativ für die komplexe in vivo- Struktur von Kardiomyozyten, Nicht-Myozyten und extrazellulärer Matrix, die sowohl mechanische als auch elektrophysiologische Eigenschaften des Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine Technik zur Vorbereitung lebensfähiger ventrikulärer Scheiben von erwachsenen Mausherzen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und zeigen ihre Eignung für elektrophysiologische Aufnahmen. Nach der Exzision des Herzens werden Ventrikel von den Vorhöfen abgetrennt, mit einer Ca 2+ -freien Lösung, die 2,3-Butandionmonoxim enthält, perfundiert und in einen 4% niederschmelzenden Agaroseblock eingebettet. Der Block wird auf ein Mikrotom mit einer Vibrationsklinge gelegt und Gewebeschnitte mit einer Dicke von 150-400 μm werden vorbereitet, wobei die Vibration frei bleibtQuency der Klinge bei 60-70 Hz und bewegt die Klinge so langsam wie möglich nach vorne. Die Dicke der Scheiben hängt von der weiteren Anwendung ab. Die Scheiben werden in eiskalter Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca 2+ und 2,3-Butandionmonoxim (BDM) für 30 min gelagert. Danach werden die Scheiben für 30 min auf 37 ° C DMEM übertragen, um das BDM zu waschen. Scheiben können für elektrophysiologische Untersuchungen mit scharfen Elektroden oder Mikroelektroden-Arrays verwendet werden, um Kraftmessungen zu analysieren, um die kontraktile Funktion zu analysieren oder die Wechselwirkung von transplantierten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten und Wirtsgewebe zu untersuchen. Für scharfe Elektrodenaufnahmen wird eine Scheibe in eine 3 cm Zellkulturschale auf der Heizplatte eines invertierten Mikroskops gegeben. Die Scheibe wird mit einer unipolaren Elektrode stimuliert und intrazelluläre Aktionspotentiale von Kardiomyozyten innerhalb der Scheibe werden mit einer scharfen Glaselektrode aufgezeichnet.

Myokardinfarkt führt zu einem nahezu irreversiblen Verlust von Kardiomyozyten. Zell-Ersatz-Therapie mit Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten für exogene Herzregeneration ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Die elektrische Integration und Reifung der transplantierten Zellen ist entscheidend für die Sicherheit und Effizienz der Zellersatztherapie. Zur Beurteilung der Integration und Reifung wurden die von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSCM; 2 Injektionen von 0,5 x 10 6 iPSCM / 10 μl), die ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) in gesunde Herzen erwachsener Mäuse exprimieren (vgl. Peinkofer et al. Für eine detaillierte Beschreibung der Methoden 15 ). Sechs Tage nach der Transplantation wurden ventrikuläre Scheiben von Empfängerherzen unter Verwendung des beschriebenen Protokolls hergestellt. Eine repräsentative Aufnahme ist inAbbildung 3 Eine Scheibe, die transplantiertes iPSCM enthielt, wurde in DMEM bei 37 ° C platziert und durch eine unipolare Elektrode, die in Wirtsgewebe platziert wurde, fokal stimuliert ( Fig. 3A , links). Intrazelluläre Aktionspotentiale wurden mit scharfen Glasmikroelektroden aufgezeichnet, die mit 3 M KCl in eGFP-positiv transplantiertem iPSCM und benachbartem Wirtsgewebe innerhalb der Scheiben gefüllt wurden (Abbildung 3A , rechts). Die Persistenz und die elektrische Integration von transplantiertem iPSCM in Empfängerherzen konnten nachgewiesen werden. IPSCM wurden als elektrisch integriert betrachtet, wenn eine zeitliche Interdependenz von Stimulationsartefakten und Aktionspotentialen, die intrazellulär in transplantierten Kardiomyozyten aufgezeichnet wurden, vorhanden war (Abbildung 3B ). Die Qualität der elektrischen Integration könnte durch die Verzögerung der elektrischen Aktivierung, dh die Verzögerung zwischen Stimulus und Beginn von th, quantifiziert werdenE-Aktionspotential-Aufschlag und die maximale Stimulationsfrequenz ohne Leitungsblöcke, dh die maximale Stimulationsfrequenz, die nach jedem Stimulus zu einer 1: 1-Erzeugung von Aktionspotentialen führt. Transplantiertes iPSCM in diesem repräsentativen Experiment wurden elektrisch integriert, wie durch eine maximale Stimulationsfrequenz ohne Leitungsblöcke von etwa 5 Hz (Abbildung 3B , rechts) angezeigt, aber die Qualität der Kopplung war nicht so gut wie im Wirtsgewebe, wie durch die längere angegeben Verzögerung zwischen Stimulations-Artefakt und Aktionspotential Aufstieg (Wirtsgewebe: 8 ms, iPSCM: 20 ms). Die Aktivierungspotentiale von Wirts-Kardiomyozyten hatten eine Amplitude von 84 mV, -74 mV maximales diastolisches Potential, 11 ms Dauer bei 50% Repolarisation, 108 ms Dauer bei 90% Repolarisation und eine Aufwärtsgeschwindigkeit von 114 V / s. Die Erhöhung der Stimulationsfrequenz von 1 bis 5 Hz führt zu einer Abnahme des AktionspotentialsIon bei 90% Repolarisation (86 ms). Transplantiertes iPSCM zeigte signifikante Unterschiede in den Aktionspotentialeigenschaften. Im Vergleich zu den Wirtszellen war die Amplitude kleiner (53 mV), maximales diastolisches Potential weniger negativ (-54 mV), Dauer bei 50% Repolarisation erhöht (14 ms), Dauer bei 90% Repolarisierung kürzer (90 ms) und Aufwärtsgeschwindigkeit Langsamer (57 V / s). Eine Erhöhung der Stimulationsfrequenz von 1 bis 5 Hz führte zu einer Abnahme der Aktionspotentialdauer bei 90% Repolarisation (67 ms). Schlussfolgerung, in diesem repräsentativen Beispiel bei 6 Tagen nach der Transplantation zeigte das analysierte iPSCM typische Merkmale von unreifen Kardiomyozyten. Dieser anekdotische Befund steht im Einklang mit Messungen in einer statistisch ausreichenden Anzahl von Zellen und Präparaten, die vor 15 berichtet wurden. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig1.jpg" /> Abbildung 1: </Stark&gt; Maßanfertigung für Einbettung von Ventrikeln in Agarose. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig2.jpg" /> Abbildung 2: Maßgeschneiderte Ringelektrode (geschliffen) für scharfe Elektrodenaufnahmen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig3.jpg" /> Abbildung 3: Elektrische Integration von transplantiertem iPSCM . ( A ) Ventrikuläres Herzstück (links) mit eGFP positivem iPSCM (rechts). SE:Stimulationselektrode Rote Punkte markieren den Ort der Aufnahmen. ( B ) Aktionspotentialaufnahmen im gesunden Wirtsgewebe (obere Spuren) und transplantiertes iPSCM (untere Spuren). Die Scheibe wurde fokal stimuliert mit einer Stimulationselektrode, die in Wirtsgewebe bei etwa 2 Hz (linke Spuren) und 5 Hz (rechte Spuren) platziert wurde. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte in vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht .

Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

murine-short-axis-ventricular-heart-slices-for-electrophysiological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.3K Aufrufe.  University of Cologne.  Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte in vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht . 

Serie: Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Reduktion der linksventrikulären Wandspannung und Verbesserung der Funktion in Failing Herzen mit Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Forschung

Medizin

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Mausmodell der Wundheilung

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murine Heterotope Heart Transplant-Technik

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Use of Two Intracorporeal Ventricular Assist Devices As a Total Artificial Heart

Mechanical circulatory support (MCS) has been introduced as a viable alternative to heart transplantation primarily through the use of intracorporeal ventricular assist devices (VADs) for support of the left ventricle. However, certain clinical scenarios warrant biventricular mechanical support. One strategy for some patients is the excision of both ventricles and the implantation of two VAD pumps as a total artificial heart (TAH). This has recently been made possible by the improvements in device design and the small profile of centrifugal devices. This TAH approach remains experimental with many important challenges such as the device settings to balance the right and left circulation, the orientation of the devices and the outflow graft with their influence on hemolysis and stability, and the outcome of chronic support using such an orientation. This protocol aims to provide a reproducible approach for total artificial heart replacement with two intracorporeal centrifugal VADs in a cow model.

Here, we present a protocol using two centrifugal pumps as a total artificial heart replacement.

Verwendung von zwei intrakorporalen Ventricular Assist Geräte als eine totale Kunstherz

Mechanical circulatory support (MCS) has been introduced as a viable alternative to heart transplantation primarily through the use of intracorporeal ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Optokardiographie und Elektrophysiologie Studien an Ex Vivo Langendorff-perfundierten Herzen

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter of investigation in the pathophysiology of ventricular arrhythmias (VA). Neurons in the stellate ganglia (SG)&#160;&#8211;&#160;bilateral star-shaped structures of the sympathetic chain &#8211;&#160;are an important component of the sympathetic infrastructure. The SG are a recognized target for&#160;treatment via cardiac sympathetic denervation in patients with therapy-refractory VA. While neuronal remodeling and glial activation in the SG have been described in patients with VA, the underlying cellular and molecular processes that potentially precede the onset of arrhythmia are only insufficiently understood and should be elucidated to improve autonomic modulation. Mouse models allow us to study sympathetic neuronal remodeling, but identification of the murine SG is challenging for the inexperienced investigator. Thus, in-depth cellular and molecular biological studies of the murine SG are lacking for many common cardiac diseases. Here, we describe a basic repertoire for dissecting and studying the SG in adult mice for analyses at RNA level (RNA isolation for gene expression analyses, in situ hybridization), protein level (immunofluorescent whole mount staining), and cellular level (basic morphology, cell size measurement). We present potential solutions to overcome challenges in the preparation technique, and how to improve staining via quenching of autofluorescence. This allows for the visualization of neurons as well as glial cells via established markers in order to determine cell composition and remodeling processes. The methods presented here allow characterizing the SG to gain further information on autonomic dysfunction in mice prone to VA and can be complemented by additional techniques investigating neuronal and glial components of the autonomic nervous system in the heart.

Pathophysiological changes in the cardiac autonomic nervous system, especially in its sympathetic branch, contribute to the onset and maintenance of ventricular arrhythmias. In the present protocol, we show how to characterize murine stellate ganglia to improve the understanding of the underlying molecular and cellular processes.

Lage, Dissektion und Analyse des Murin-Stellat-Ganglions

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

Use of a Percutaneous Ventricular Assist Device/Left Atrium to Femoral Artery Bypass System for Cardiogenic Shock

The left atrial to femoral artery bypass (LAFAB) system is a mechanical circulatory support (MCS) device used in cardiogenic shock (CS) that bypasses the left ventricle by draining blood from the left atrium (LA) and returning it to the systemic arterial circulation via the femoral artery. It can provide flows ranging from 2.5-5 L/min depending on the size of the cannula. Here, we discuss the mechanism of action of LAFAB, available clinical data, indications for its use in cardiogenic shock, steps of implantation, post-procedural care, and complications associated with the use of this device and their management.
We also provide a brief video of the procedural component of device therapy, including the pre-placement preparation, percutaneous placement of the device via transseptal puncture under echocardiographic guidance and the post-operative management of device parameters.

The following article describes the stepwise procedure for placement of a device (e.g., Tandemheart) in cardiogenic shock (CS) that is a percutaneous left ventricular assist device (pLVAD) and a left atrial to femoral artery bypass (LAFAB) system that bypasses and supports the left ventricle (LV) in CS.

Verwendung eines perkutanen ventrikulären Unterstützungsgeräts / linker Vorhof zu Femurarterien-Bypass-System für kardiogenen Schock

The left atrial to femoral artery bypass (LAFAB) system is a mechanical circulatory support (MCS) device used in cardiogenic shock (CS) that bypasses the ...