Reconocemos el apoyo brindado por los talleres y la instalación de animales del Instituto de Neurofisiología. Este trabajo fue apoyado por Walter und Marga Boll- Stiftung, Köln Fortune y Deutsche Stiftung für Herzforschung.

La manipulación de los animales debe ajustarse a las directrices del Comité local del bienestar de los animales ya la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo. 1. Preparar soluciones <ol><li> Preparar la solución de Tyrode sin Ca 2+ (composición en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucosa 10, HEPES 5, 2,3-butanodiona monóxima (BDM) 30. Ajustar el pH a 7,4 Con NaOH a 4ºC. </li><li> Preparar la solución de Tyrode con Ca 2+ (composición en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucosa 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH a 4 ° C. </li><li> Preparar 4% de agarosa de bajo punto de fusión: Poner 0,6 g de agarosa de bajo punto de fusión en 15 ml de solución de Tyrode sin Ca 2+ . Calentar la mezcla en un horno de microondas dos veces a 750 W durante 10-15 s hasta que la agarosa se disuelva. Mantener la solución a una temperatura constante de 37 &amp;# 176; C y agitar continuamente. </li><li> Mantener el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin suero a 37 ° C burbujeado con carbógeno (5% de CO $ ₂ $ , 95% de O $ ₂ $ ). </li></ol> 2. Preparar el micrótomo <ol><li> Encienda el micrótomo. </li><li> Llenar la cámara externa del microtome con hielo. </li><li> Llenar la cámara del microtomo interior con solución de Tyrode helada sin Ca2 + y oxigenar continuamente la solución con 100% de O2. </li><li> Coloque una hoja de acero en el porta-cuchilla del micrótomo. </li></ol> 3. Aislamiento del corazón del ratón <ol><li> Inyectar 2.500 U de heparina por vía subcutánea. Esperar 15 min. </li><li> Sacrificar al animal por dislocación cervical. </li><li> Abra el pecho por esternotomía. </li><li> Cuidadosamente disecar el pericardio con tijeras pequeñas y una pinza # 5. </li><li> Insertar una cánula en la aorta ascendente y perfundir las arterias coronarias in situ con hielo frío TyrodeSin Ca 2 + hasta que se retire la sangre restante. </li><li> Retirar suavemente el corazón con una pinza y unas tijeras y transferir el corazón en hielo frío solución de Tyrode montado sin Ca 2 + . </li><li> Separar las aurículas de los ventrículos con un bisturí o unas tijeras. </li></ol> 4. Incorporación de los ventrículos en 4% de Agarosa de bajo punto de fusión <ol><li> Coloque los ventrículos con el ápice hacia arriba en el molde de agarosa ( Figura 1 ). Coloque el pasador en el centro del molde en la cámara ventricular izquierda. </li><li> Llenar el molde con 4% de agarosa de bajo punto de fusión a 37 ° C, hasta que el corazón está completamente cubierto. </li><li> Coloque el molde sobre hielo para un endurecimiento más rápido de la agarosa evitando la flotación del tejido. </li><li> Retire el bloque de agarosa que contiene los ventrículos del molde con un bisturí. </li><li> Gire el bloque boca abajo y llene las cámaras ventriculares y el hueco en la parte posterior del bloque de agarosa, que iS dejada por el pasador de la muda, con 4% de agarosa de bajo punto de fusión usando una jeringa con una aguja de 20 G. </li><li> Corte el bloque de agarosa con un bisturí para lograr un fondo plano del bloque y la posición vertical del ápice cardíaco. </li></ol> 5. Rebanado del tejido ventricular <ol><li> Fijar el bloque en el soporte del espécimen del micrótomo con una gota de pegamento de cianoacrilato. Hacer frente al vértice cardiaco hacia arriba. </li><li> Coloque el porta-espécimen en la cámara del espécimen interno del microtomo, que se llena de Tyrode helado sin Ca 2+ . Cubra completamente el bloque de agarosa con la solución de Tyrode. </li><li> Prepare rebanadas de eje corto con un espesor de 150-400 μm, dependiendo de la aplicación adicional (para grabaciones de electrodos puntiagudos de 150-200 μm), mantenga la frecuencia de vibración de la cuchilla a 60-70 Hz y mueva la hoja hacia adelante lo más lentamente posible . </li><li> Utilice un cepillo fino para quitar cuidadosamente la agarosa restante de las rebanadas. </li><li> Suavemente transfeR con una pipeta Pasteur en la solución de Tyrode con Ca2 + 0,9 mM aireado con 100% de O2 y almacenarlos durante al menos 30 minutos sobre hielo para recuperarse del procedimiento de corte. </li><li> Después, mantener las rebanadas durante 30 min en DMEM a 37 ° C, aireadas con carbógeno, para lavar el BDM antes de su uso posterior. </li></ol> 6. Preparación de la configuración del electrodo afilado <ol><li> Para el precalentamiento, encienda todos los dispositivos eléctricos 30 minutos antes de que empiecen las grabaciones. </li><li> Colocar un plato de cultivo celular de 3 cm sobre la placa de calentamiento colocada en el microscopio invertido. </li><li> Coloque el electrodo de anillo personalizado ( Figura 2 ) en el plato y conecte los cables de conexión a tierra del preamplificador y el electrodo de estimulación. </li><li> Conecte los tubos flexibles del sistema de perfusión al plato. </li><li> Llenar el depósito del sistema de perfusión con DMEM, aireado con carbógeno. </li><li> Encienda la bomba de perfusión y ajuste la perfusiónTe a 2-3 ml / min. </li><li> Ajuste la temperatura del DMEM en el plato a 37 ° C mediante la regulación del calentador de flujo y la placa calefactora. </li></ol> 7. Grabaciones Potenciales de Acción <ol><li> Coloque una rebanada ventricular en el plato lleno DMEM. </li><li> Compruebe la integridad estructural y la viabilidad (basada en la función contráctil) del tejido con el microscopio invertido. </li><li> Llene un electrodo de vidrio de registro con KCL de 3 M. </li><li> Llene un electrodo de estimulación con DMEM. </li><li> Coloque el electrodo de registro y el electrodo de estimulación en los portaelectrodos. </li><li> Coloque el electrodo de estimulación cuidadosamente en la rebanada y encienda el estimulador eléctrico. Comience con una frecuencia de estimulación de 1-2 Hz. </li><li> Mueva el electrodo de grabación con el micromanipulador sobre la posición de grabación deseada. </li><li> Baje lentamente el electrodo de registro hasta que la punta toque el tejido. </li><li> Aplique un pulso eléctrico rectangular corto a través delElectrodo de registro para penetrar en la membrana celular. </li><li> Reposicione cuidadosamente el electrodo de registro hasta que se asegure una señal estable. </li><li> Inicie la grabación de los potenciales de acción. </li></ol>

<ol>
	<li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro.">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+tissue+slices+as+a+tool+to+predict+metabolism+of+novel+drugs.">Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiopulmonary+toxicity+of+peat+wildfire+particulate+matter+and+the+predictive+utility+of+precision+cut+lung+slices.">Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices.</a> Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).</li><li>Nembo, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+(Fabaceae)+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li><li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing.">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li><li>Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recordings+on+rat+cardiac+muscle+slices.">Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices.</a> Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).</li><li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation.">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).</li><li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+murine+heart+slices.+A+robust+model+to+study+ventricular+isometric+contractions.">Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies.">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation.">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes.">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages.">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li><li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li><li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2,3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes.">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li><li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development.">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li><li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage:+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

Las rodajas ventriculares permiten estudios electrofisiológicos, farmacológicos y mecánicos con una estructura de tejido conservada in vivo como y el acceso directo de la tecnología de medición a todas las regiones del corazón. Las propiedades potenciales de la acción fisiológica se han demostrado en rodajas embrionarias, neonatales y adultas 9 , 10 , 11 . La vitalidad de las rodajas, con la excepción de las capas superficiales directamente dañadas por el procedimiento de corte, ha sido confirmada por tinción de vitalidad 9 . Pueden usarse grabaciones de potencial de acción dentro de los cortes usando electrodos de vidrio afilados para investigar la integración y maduración de cardiomiocitos trasplantados como se describe aquí, o para estudios farmacológicos después de añadir compuestos cardioactivos. Son posibles grabaciones a largo plazo con una duración de una hora o más en una celda individual. Esta duración de grabación es suficiente paraEl impacto de diferentes compuestos farmacológicos en una célula por perfusión secuencial y lavado. Pasos de preparación crítica Para optimizar la calidad del corte, se debe evitar el daño isquémico del tejido. Por lo tanto, la perfusión del corazón in situ con la solución de Tyrode, la resección rápida del corazón y la preservación inmediata en la solución de Tyrode oxigenada y helada se consideran cruciales. La inmovilización del corazón que late con la 2,3-butanodiona monóxima puede reducir aún más la susceptibilidad a la isquemia y es necesaria para un encapsulado sólido en agarosa de bajo punto de fusión. La incorporación en agarosa de bajo punto de fusión puede dificultar el suministro de tejido al limitar la difusión, pero es esencial para estabilizar el tejido del corazón blando antes de cortar. Las cavidades pequeñas dentro del bloque de muestra, por ejemplo , cámaras ventriculares no llenadas completamente con agarosa o burbujas de aire remanentes, podrían obstaculizar la estabilización del tejido. El tejido miocárdico no estabilizado no ofrece suficiente resisLa cuchilla vibrante, lo que provoca graves alteraciones en los tejidos y daños. Para asegurar un corte claro y minimizar el daño de los tejidos, las cuchillas deben ser afiladas ( es decir, no reutilizadas más de tres veces), y el movimiento hacia adelante de la cuchilla a través del bloque de muestra debe ser lo más lento posible, ya que las cuchillas opacas o la velocidad excesiva pueden aflojar el Ventrículos incrustados o lacerar el tejido. Para asegurar resultados confiables y reproducibles, la calidad de los cortes debe cumplir con criterios específicos, incluyendo la integridad estructural del tejido, que puede ser confirmada por microscopía, y la respuesta a la estimulación eléctrica a frecuencias fisiológicas hasta 10 Hz. Las rebanadas se pueden cortar a un espesor de 150-400 μm dependiendo de la aplicación adicional. Mientras que las rodajas más delgadas pueden prevenir las condiciones hipóxicas en el núcleo del tejido y permitir una detección más fácil de las células trasplantadas con un microscopio de fluorescencia, así como un posicionamiento más preciso deLos electrodos de registro 15 , las rebanadas más gruesas pueden proporcionar una mejor integridad de la estructura del tejido y una mayor estabilidad del tejido, lo que será ventajoso para las mediciones de la fuerza 10 y procesamiento histológico posterior después de las grabaciones. Para evitar las influencias potenciales de altas concentraciones de BDM en los canales iónicos y las proteínas de manipulación de Ca 2+ 16 , 17 , se recomienda el lavado de BDM por incubación de rebanadas en DMEM libre de BDM durante al menos 30 minutos antes de su uso posterior. Sorprendentemente, la contracción y el subsiguiente movimiento del tejido después del lavado de BDM no obstaculizan las grabaciones de electrodos punzantes. Limitaciones En contraste con los modelos de cultivo de células comunes, las rebanadas proporcionan una estructura de tejido intacta que incluye conexiones eléctricas y mecánicas preservadas de célula a célula, matriz extracelular y distribución de cardiomiocitosTes y no miocitos dentro del tejido nativo [ 6] . Sin embargo, las rebanadas de tejido cardíaco no coinciden exactamente con la situación in vivo , ya que tienen sólo 150 a 400 μm de grosor, suministradas por medio artificial y pueden resultar dañadas durante el proceso de preparación. La tinción con azul de tripán y la evaluación inmunohistológica de la caspasa-3 activa y el fragmento PARP p85 revelaron que las células dentro de las rodajas embrionarias, excepto las de las capas superficiales, eran viables después del corte 9 . El sistema de conducción no se conserva en las rebanadas ventriculares, y la propagación de excitación es bidimensional en lugar de tridimensional en las rebanadas planas. Las rebanadas de corazones embrionarios muestran espontáneas hasta por dos semanas en el cultivo 9 . También pueden ocurrir contracciones espontáneas de rodajas adultas y no está claro si son inducidas por células del sistema de conducción o pueden indicar daño celular y Ca 2 +Oad 18 . Aplicaciones futuras Además de los estudios electrofisiológicos con electrodos afilados y matrices de microelectrodos, que pueden utilizarse para experimentos farmacológicos para analizar el impacto de los fármacos sobre las propiedades potenciales de acción y la propagación de la excitación 11 , estudios de desarrollo 19 o caracterización de cardiomiocitos 15 trasplantados, Los corazones se han utilizado para las medidas de la contracción de la fuerza 10 , que se podrían aplicar a las rebanadas del adulto, también. Otras aplicaciones futuras potenciales incluyen (I) estudios de microscopía a largo plazo en cortes cultivados, por ejemplo para evaluar la integración estructural de cardiomiocitos derivados de células madre inyectadas, (II) inyección de tintes permeables a juntas de separación para investigar acoplamiento intercelular o (III) estudios de endoteliales Y función vascular de la coronaDentro de las rodajas. En conclusión, los cortes ventriculares son un valioso modelo de tejido multicelular con una estructura similar conservada in vivo , que puede ayudar a superar limitaciones de los modelos de cultivo de células comunes y son aplicables a una amplia gama de estudios farmacológicos, fisiológicos, de desarrollo y de terapia celular.

Las rebanadas de tejido fino se han utilizado con frecuencia en la ciencia básica ya que Yamamot y Mcllwain demostraron en 1966 que la actividad eléctrica de las rebanadas del cerebro se mantiene in vitro 1 . Desde entonces, se han realizado estudios electrofisiológicos y farmacológicos sobre cortes de cerebro 2 , hígado 3 , pulmón 4 y tejido miocárdico 5 , 6 , 7 . En 1990 se describieron las primeras grabaciones de parche-clamp en rodajas ventriculares de corazones de ratas neonatales, pero esta técnica cayó en el olvido durante algún tiempo. Más de una década más tarde, nuestro grupo estableció un nuevo método para preparar murino embrionario 9 , neonatal 10 y adultos 11 rebanadas de corazón. Estos cortes de tejido viable se pueden utilizar para experimentos agudos (trozo de adultoS se pueden cultivar durante varias horas) o experimentos de cultivo a corto plazo (se pueden cultivar por unos días los cortes embrionarios y neonatales). Los cortes muestran in vivo como características electrofisiológicas y una propagación de excitación homogénea según se evaluó mediante un potencial de acción de electrodo nítido y grabaciones de electrodos de microelectrodos 11 . Debido a su morfología &quot;bidimensional&quot;, permiten el acceso directo de electrodos de grabación a todas las regiones del ventrículo, lo que las convierte en una herramienta interesante para las investigaciones electrofisiológicas y plantea nuevas opciones experimentales en comparación con los corazones enteros perfundidos de Langendorff. La respuesta de fármacos de los cortes a los bloqueadores de los canales iónicos como el verapamilo (bloqueador del canal de Ca 2+ tipo L), lidocaína (bloqueador del canal de Na + ), 4-aminopiridina (bloqueador de canal de K + dependiente del voltaje no selectivo) y linopirdina (KCNQ K + - bloqueador de canales) 9 , 11 </suP&gt; correspondieron a efectos conocidos sobre cardiomiocitos disociados. Medidas de fuerza isométrica reveló una relación de frecuencia de fuerza positiva y sugiere fuertemente la función contráctil intacta [ 10] . Estos hallazgos demostraron que los cortes ventriculares murinos son adecuados como un modelo de tejido in vitro para estudios fisiológicos y farmacológicos. Además, las rodajas ventriculares de los corazones receptores en combinación con registros de electrodos agudos han demostrado ser una herramienta muy útil para caracterizar la integración eléctrica y mecánica, así como la maduración de 12 cardiomiocitos fetales 12 , 13 , 14 y derivado de células madre trasplantados. En resumen, las rodajas ventriculares son un modelo valioso y bien establecido de tejido multicelular y deben considerarse complementarias a los cardiomiocitos disociados y los corazones perfundidos de Langendorff(En contraste con las células disociadas), así como el acceso directo de las tecnologías de medición como registros de electrodos agudos a todas las regiones del corazón (en contraste con las preparaciones enteras del corazón).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Leica VT 1000s</td>
			<td style="width:340px;">Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;">Microtome with vibrating blade.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Stainless Steel Blades</td>
			<td style="width:340px;">Campden Instruments, Loughborough, England</td>
			<td>7550-1-SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td>Z627992&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Fine brush, e.g. size 6 (4/32&#34;)</td>
			<td style="width:340px;">VWR, International, Radnor, USA</td>
			<td>149-2125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Preparation table</td>
			<td style="width:340px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;">self made</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Molt for embedding ventricles in agarose</td>
			<td style="width:340px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;">self made</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:248px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:340px;">Becton, Dickinson;&#160; Franklin Lakes, USA</td>
			<td>300013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">27Gx3/4`` Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:340px;">Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4657705</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">20G 11/2`` Needles</td>
			<td>4657519</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Small scissor</td>
			<td style="width:340px;">WPI, Sarasota, USA</td>
			<td>501263</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip</td>
			<td style="width:340px;">WPI, Sarasota, USA</td>
			<td>500342</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Oxygen gas (medical grade O2)</td>
			<td style="width:340px;">Linde, Munich, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2)&#160;</td>
			<td style="width:340px;">Linde, Munich, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">NaCL</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">KCL</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">746436</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:248px;">CaCl2</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">746495</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:248px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">NIST200B&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">HEPES</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">51558</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:248px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">S5761&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">D(+)-Glucose</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">G8270&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:248px;">MgSO4</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">M7506&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">NaOH</td>
			<td style="width:340px;">Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td>
			<td style="width:140px;">S8045&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:340px;">Henkel, D&#252;sseldorf, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Low-melt Agarose&#160;</td>
			<td style="width:340px;">Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:140px;">6351.2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Heparin-sodium-25000 I.E./5mL</td>
			<td style="width:340px;">Ratiopharm, Ulm, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160; (DMEM), high glucose, GlutaMAX</td>
			<td style="width:340px;">ThermoScientific, Waltham, USA</td>
			<td style="width:140px;">10566016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">SEC-10LX Amplifier</td>
			<td style="width:340px;">npi electronic GmbH, Tamm, Germany</td>
			<td>SEC-10LX</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">EPC 9</td>
			<td style="width:340px;">HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Zeiss Axiovert 200</td>
			<td style="width:340px;">Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">&#160;Low magnification Micromanipulator</td>
			<td style="width:340px;">Narashige, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:140px;">Nm-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">High magnification, three-axis micromanipulator</td>
			<td style="width:340px;">Narashige, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:140px;">MHW-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Peristaltic perfusion pump</td>
			<td style="width:340px;">Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td>
			<td style="width:140px;">PPS2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">2-channel temperature controller</td>
			<td style="width:340px;">Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany</td>
			<td style="width:140px;">TCO02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Square pulse stimulator</td>
			<td style="width:340px;">Natus Europe GmbH, Planegg, Germany</td>
			<td style="width:140px;">Grass SD9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:340px;">WPI, Sarasota, USA</td>
			<td style="width:140px;">1B150F-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine short axis ventricular heart slices for electrophysiological studies

Los cardiomiocitos murinos se han utilizado ampliamente para estudios in vitro de fisiología cardiaca y nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, las preparaciones multicelulares de cardiomiocitos disociados no son representativas de la compleja estructura in vivo de cardiomiocitos, no miocitos y matriz extracelular, que influye tanto en las propiedades mecánicas como electrofisiológicas del corazón. Aquí se describe una técnica para preparar viable ventricular rodajas de corazones de ratón de adultos con un preservado in vivo como estructura de tejido, y demostrar su idoneidad para electrofisiológicos grabaciones. Después de la excisión del corazón, los ventrículos se separan de las aurículas, se perfunden con solución libre de Ca2 + que contiene 2,3-butanodiona monóxima y se insertan en un bloque de agarosa de bajo punto de fusión al 4%. El bloque se coloca sobre un micrótomo con una hoja vibrante, y se preparan rebanadas de tejido con un espesor de 150-400 μm, manteniendo la vibración freDe la cuchilla a 60-70 Hz y moviendo la hoja hacia adelante lo más lentamente posible. El espesor de las rebanadas depende de la aplicación posterior. Las rodajas se almacenan en solución de Tyrode helada con Ca2 + 0,9 mM y 2,3-butanodiona monóxima (BDM) durante 30 min. Después, las rebanadas se transfieren a DMEM a 37ºC durante 30 minutos para lavar el BDM. Los cortes se pueden utilizar para estudios electrofisiológicos con electrodos afilados o matrices de microelectrodos, para mediciones de fuerzas para analizar la función contráctil o para investigar la interacción de cardiomiocitos derivados de células madre trasplantados y tejido huésped. Para grabaciones de electrodo agudo, se coloca una rebanada en un plato de cultivo celular de 3 cm sobre la placa calefactora de un microscopio invertido. La rebanada se estimula con un electrodo unipolar, y los potenciales de acción intracelular de los cardiomiocitos dentro de la rebanada se registran con un electrodo de vidrio afilado.

El infarto de miocardio conduce a una pérdida virtualmente irreversible de cardiomiocitos. La terapia de reemplazo celular utilizando cardiomiocitos derivados de células madre para la regeneración cardíaca exógena es un enfoque terapéutico prometedor. La integración eléctrica y la maduración de las células trasplantadas son cruciales para la seguridad y la eficacia de la terapia de reemplazo celular. Para evaluar la integración y maduración, se trasplantaron cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSCM, 2 inyecciones de 0,5 x 10 6 iPSCM / 10 μL) que expresan la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) en corazones sanos de ratones adultos (véase Peinkofer et al. Para una descripción detallada de los métodos 15 ). Seis días después del trasplante, se prepararon cortes ventriculares de los corazones receptores utilizando el protocolo descrito. Una grabación representativa se muestra enFigura 3. Se colocó una porción que contenía iPSCM trasplantada en DMEM a 37ºC y se estimuló focalmente mediante un electrodo unipolar colocado en tejido huésped ( Figura 3A , a la izquierda). Se registraron los potenciales de acción intracelular con microelectrodos de vidrio afilados rellenos de KCl 3M en iPSCM transplantada positiva eGFP y tejido huésped vecino dentro de las rebanadas ( Figura 3A , derecha). Se pudo demostrar la persistencia y la integración eléctrica de iPSCM trasplantado en los corazones receptores. IPSCM se consideraron estar integrado eléctricamente, si una interdependencia temporal de artefactos de estimulación y los potenciales de acción registrados intracelularmente en cardiomiocitos trasplantados estaba presente ( Figura 3B ]. La calidad de la integración eléctrica podría ser cuantificada por el retraso de la activación eléctrica, es decir , el retraso entre el estímulo y el inicio de laY la frecuencia de estimulación máxima sin bloques de conducción, es decir , la máxima frecuencia de estimulación que conduce a una generación de potenciales de acción 1: 1 después de cada estímulo. El IPSCM trasplantado en este experimento representativo se integró eléctricamente, como se indica por una frecuencia de estimulación máxima sin bloques de conducción de alrededor de 5 Hz ( Figura 3B , derecha), pero la calidad del acoplamiento no fue tan buena como dentro del tejido huésped, Retardo entre el artefacto de estimulación y el potencial ascendente de acción (tejido huésped: 8 ms, iPSCM: 20 ms). Los potenciales de acción de los cardiomiocitos del huésped tuvieron una amplitud de 84 mV, un potencial diastólico máximo de 74 mV, una duración de 11 ms a una repolarización del 50%, una duración de 108 ms a una repolarización del 90% y una velocidad de 114 V / s. Aumentar la frecuencia de estimulación de 1 a 5 Hz conduce a una disminución en el potencial de acción duranteIon a 90% de repolarización (86 ms). El iPSCM trasplantado mostró diferencias significativas en las propiedades potenciales de acción. En comparación con las células del huésped, la amplitud fue menor (53 mV), el potencial diastólico máximo menos negativo (-54 mV), la duración al 50% de repolarización aumentó (14 ms), la duración a 90% de repolarización más corta (90 ms) y la velocidad ascendente Más lento (57 V / s). Un aumento en la frecuencia de estimulación de 1 a 5 Hz causó una disminución en la duración del potencial de acción a 90% de repolarización (67 ms). En conclusión, en este ejemplo representativo a los 6 días después del trasplante, la iPSCM analizada mostró características típicas de cardiomiocitos inmaduros. Este hallazgo anecdótico está en línea con las mediciones en un número estadísticamente suficiente de células y preparaciones, que se han informado antes de 15 . <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig1.jpg" /> Figura 1: </Fuerte&gt; Molde por encargo para incrustar ventrículos en agarosa. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig2.jpg" /> Figura 2: Electrodo de anillo hecho a medida (tierra) para grabaciones de electrodos agudos. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55725/55725fig3.jpg" /> Figura 3: Integración eléctrica de iPSCM trasplantado . ( A ) Rebanada de corazón ventricular (izquierda) que contiene eGFP positivo iPSCM (derecha). SE:Electrodo de estimulación. Los puntos rojos marcan la ubicación de las grabaciones. ( B ) Grabaciones potenciales de acción en tejido sano del huésped (trazas superiores) e iPSCM trasplantado (trazas inferiores). La rebanada se estimuló focalmente con un electrodo de estimulación colocado en el tejido huésped en torno a 2 Hz (trazas izquierdas) y 5 Hz (trazas a la derecha). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55725/55725fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Aquí, describimos la preparación de cortes ventriculares viables de ratones adultos y su uso para registros de potencial de acción de electrodos agudos. Estas preparaciones multicelulares proporcionan una estructura de tejido conservada in vivo como, lo que los convierte en un valioso modelo para estudios electrofisiológicos y farmacológicos in vitro .

Racimos del corazón ventricular de eje corto murino para estudios electrofisiológicos

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

murine-short-axis-ventricular-heart-slices-for-electrophysiological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.3K vistas.  University of Cologne.  Aquí, describimos la preparación de cortes ventriculares viables de ratones adultos y su uso para registros de potencial de acción de electrodos agudos. Estas preparaciones multicelulares proporcionan una estructura de tejido conservada in vivo como, lo que los convierte en un valioso modelo para estudios electrofisiológicos y farmacológicos in vitro . 

Video: Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Reducción del estrés de la pared del ventrículo izquierdo y la mejoría de la función en su defecto corazones con Algisyl LVR-

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Investigación

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo murino de Curación de Heridas

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramiocárdica celular de la entrega: Las observaciones en murinos Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murino heterotópico Corazón Trasplante Técnica

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Use of Two Intracorporeal Ventricular Assist Devices As a Total Artificial Heart

Mechanical circulatory support (MCS) has been introduced as a viable alternative to heart transplantation primarily through the use of intracorporeal ventricular assist devices (VADs) for support of the left ventricle. However, certain clinical scenarios warrant biventricular mechanical support. One strategy for some patients is the excision of both ventricles and the implantation of two VAD pumps as a total artificial heart (TAH). This has recently been made possible by the improvements in device design and the small profile of centrifugal devices. This TAH approach remains experimental with many important challenges such as the device settings to balance the right and left circulation, the orientation of the devices and the outflow graft with their influence on hemolysis and stability, and the outcome of chronic support using such an orientation. This protocol aims to provide a reproducible approach for total artificial heart replacement with two intracorporeal centrifugal VADs in a cow model.

Here, we present a protocol using two centrifugal pumps as a total artificial heart replacement.

Uso de dos dispositivos de asistencia Ventricular intracorpórea como un corazón Artificial Total

Mechanical circulatory support (MCS) has been introduced as a viable alternative to heart transplantation primarily through the use of intracorporeal ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Rebanadas de hígado cortadas con precisión de la murino como modelo Ex Vivo de biología hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter of investigation in the pathophysiology of ventricular arrhythmias (VA). Neurons in the stellate ganglia (SG)&#160;&#8211;&#160;bilateral star-shaped structures of the sympathetic chain &#8211;&#160;are an important component of the sympathetic infrastructure. The SG are a recognized target for&#160;treatment via cardiac sympathetic denervation in patients with therapy-refractory VA. While neuronal remodeling and glial activation in the SG have been described in patients with VA, the underlying cellular and molecular processes that potentially precede the onset of arrhythmia are only insufficiently understood and should be elucidated to improve autonomic modulation. Mouse models allow us to study sympathetic neuronal remodeling, but identification of the murine SG is challenging for the inexperienced investigator. Thus, in-depth cellular and molecular biological studies of the murine SG are lacking for many common cardiac diseases. Here, we describe a basic repertoire for dissecting and studying the SG in adult mice for analyses at RNA level (RNA isolation for gene expression analyses, in situ hybridization), protein level (immunofluorescent whole mount staining), and cellular level (basic morphology, cell size measurement). We present potential solutions to overcome challenges in the preparation technique, and how to improve staining via quenching of autofluorescence. This allows for the visualization of neurons as well as glial cells via established markers in order to determine cell composition and remodeling processes. The methods presented here allow characterizing the SG to gain further information on autonomic dysfunction in mice prone to VA and can be complemented by additional techniques investigating neuronal and glial components of the autonomic nervous system in the heart.

Pathophysiological changes in the cardiac autonomic nervous system, especially in its sympathetic branch, contribute to the onset and maintenance of ventricular arrhythmias. In the present protocol, we show how to characterize murine stellate ganglia to improve the understanding of the underlying molecular and cellular processes.

Localización, Disección, Y Análisis Del Ganglio Estrellado Murino

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

Use of a Percutaneous Ventricular Assist Device/Left Atrium to Femoral Artery Bypass System for Cardiogenic Shock

The left atrial to femoral artery bypass (LAFAB) system is a mechanical circulatory support (MCS) device used in cardiogenic shock (CS) that bypasses the left ventricle by draining blood from the left atrium (LA) and returning it to the systemic arterial circulation via the femoral artery. It can provide flows ranging from 2.5-5 L/min depending on the size of the cannula. Here, we discuss the mechanism of action of LAFAB, available clinical data, indications for its use in cardiogenic shock, steps of implantation, post-procedural care, and complications associated with the use of this device and their management.
We also provide a brief video of the procedural component of device therapy, including the pre-placement preparation, percutaneous placement of the device via transseptal puncture under echocardiographic guidance and the post-operative management of device parameters.

The following article describes the stepwise procedure for placement of a device (e.g., Tandemheart) in cardiogenic shock (CS) that is a percutaneous left ventricular assist device (pLVAD) and a left atrial to femoral artery bypass (LAFAB) system that bypasses and supports the left ventricle (LV) in CS.

Uso de un dispositivo de asistencia ventricular percutánea / sistema de derivación de la aurícula izquierda a la arteria femoral para el shock cardiogénico

The left atrial to femoral artery bypass (LAFAB) system is a mechanical circulatory support (MCS) device used in cardiogenic shock (CS) that bypasses the ...