Die Autoren danken Marin Manuel und Olivia Goldman-Szwajkajzer für ihre Hilfe in den Fotos zu machen. Die Autoren danken auch Arjun Masukar und Tobias Bock für das Manuskript Korrektur. Finanzielle Unterstützungen wurden von der Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401) zur Verfügung gestellt, das NIH-NINDS (R01NS077863), die Thierry Latran Foundation (OHEX Project), die Französisch Verband für Myopathie ( Grant-Nummer 16026) und Target ALS sind dankbar anerkannt. Felix Leroy war der Empfänger einer &quot;Contrat Doctoral&quot; von der Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinien (86/609 / CEE und 2010-63-UE) und Französisch Gesetzgebung durchgeführt und wurden von der Universität Paris Descartes Ethikkommission genehmigt. 1. Spinal Cord Scheibe Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen täglich oder einen Tag im Voraus. Wenn über Nacht, Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 gehalten und in fest verschlossenen Flaschen gekühlt halten. <ol><li> Bereiten Low Na + künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF): 3 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mM Sucrose, 26 mM NaHCO 3, 0,8 mM CaCl 2, 8 mM MgCl 2, 25 mM Glucose, 0,4 mM Ascorbinsäure, 1 mM Na-Kynurenat, 2 mM Na-Pyruvat. Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,4). Da Na-Kynurenat oft schwer zu lösen, stellen Sie sicher, das in der Tabelle aufgeführten Materialien zu kaufen. </li><li> Bereiten K-Gluconat solution: 130 mM K-Gluconat, 15 mM KCl, 0,05 mM EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM Glucose, 1 mM Na-Kynurenat, 2 mM Na-Pyruvat, eingestellt auf pH 7,4 mit KOH. </li><li> Bereiten ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 25 mM Glucose, 0,4 mM Ascorbinsäure, 2 mM Na-Pyruvat. Blase mit 95% O 2 und 5% CO 2 (pH 7,4). </li><li> Vor dem Beginn der Dissektion, lösen sich 2% Agar in 80 ml der K-Gluconat-Lösung und halten bei 60 ° C warm. </li></ol></li><li> intrakardialer Perfusion <ol><li> Führen Sie diese Vorbereitung auf die weiblichen und männlichen Mäusen im Alter von P2 bis P11. </li><li> Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 0,1 ml 25 mM Natrium-Pentobarbital (50 mg / kg). </li><li> Mit Nadeln oder Klebeband, immobilisieren die Maus auf dem Rücken auf einer großen Petrischale mit Silikon gefüllt. Verwenden Sie ein Sezieren microscope für den Rest der Präparation. </li><li> Halten Sie die Spitze des Brustbeins, heben Sie die Brust und schneiden Sie die Membran mit einer feinen Schere. Dann öffnen Sie die Brust auf beiden Seiten, indem sie durch die Rippen schneiden das Herz aussetzen. </li><li> Schneiden Sie den rechten Vorhof vor den linken Ventrikel mit einer 27G Nadel Punktierung. </li><li> Perfuse mit eiskaltem niedrigen Na + ACSF. Nach 30 sec, sollte eine niedrige Na + ACSF aus dem Atrium fließen zu sehen. Geringe Mengen an Natrium verhindern, dass die Zellen, die aus Spick und Zelltod bei der Präparation zu reduzieren. </li><li> Halten Sie die Nadel im Herzen unter dem Binokular halten, bis die Leber gelb wird, wenn das Blut abgelassen wird. </li></ol></li><li> Rückenmark Dissektion <ol><li> Enthaupten das Tier und legte es auf seinen Bauch. </li><li> Entfernen Sie schnell , die Haut des Rückens (Abbildung 1A1). Machen Sie zwei Schnitte durch die Schultern und hinunter den Brustkorb (Abbildung 1A2). Dann schneiden Sie die Schnur als low wie möglich in der kaudalen Abschnitt, um die Wirbelsäule mit dem Beginn der Rippen aus dem unteren Teil des Tieres zu isolieren. Drehen Sie das Tier wieder und entfernen Sie die Eingeweide noch an den Rippen befestigt. </li><li> Übertragung der Wirbelsäule zu einer anderen, kleineren Silizium gefüllte Petrischale und benutzen 4 insect pins es dorsalen Seite nach oben (Figur 1A) zu halten. </li><li> Kontinuierlich perfundieren das Tier mit Carbogen blasigen ACSF (bei etwa 4 ° C) , während eine Laminektomie der dorsalen Seite durchgeführt wird , und Aussetzen des Rückenmarks von der rostralen Ende (1B). Dazu legen Sie die Spitze der feinen Schere zwischen dem Knochen und dem Rückenmark und schneiden den Knochen nach und nach aus dem rostralen Ende, um sicherzustellen, von der weißen Substanz zu bleiben weg. Alternate auf jeder Seite , während mit einer Pinzette die Band von Knochen bereits geschnitten (Abbildung 1B1) fern zu halten. </li><li> Unter Verwendung der kleinsten Feder Schere und Pinzette, heben Sie die Dura und schneidenbeide Seiten auf, während Sie die lose Teil der Dura, um mit der Schere eine Beschädigung des Rückenmarks zu vermeiden. Schneiden Sie entlang der rostro-caudale Achse. HINWEIS: Die Dura ist eine halb transparente kontinuierliche Membran; in diesem Alter ist die pia mater zu zerbrechlich und wird während der Präparation und Slicing (Abbildung 1B2) kommen auseinander. </li><li> Sobald die Dura ein stumpfes Glas oder Kunststoffspitze entfernt verwendet wird vorsichtig auf die Schnur auf der linken Seite des von der Halbschnitt Wirbelsäule gebildet Nut schieben, und schneiden Sie die ventralen und dorsalen Wurzeln auf der rechten Seite, von der rostralen Seite beginnen , am weitesten von wo aus sie die Schnur (wenige mm zumindest Abbildung 1B2) eingeben. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Seite, gehen immer von rostral nach kaudal. Wenn linkshändig, von der linken Seite beginnen und dann auf die rechte Seite zu bewegen. </li></ol></li><li> Die Einbettung in Agar <ol><li> Schieben Sie die Kabel aus der Wirbelsäule. Verwenden Sie einen kleineren Insektenstift festzunagelndie Schnur mit der Rückenfläche nach oben und zart jedes Stück Membran noch daran (Abbildung 1C1) angebracht entfernen. </li><li> Einmal gereinigt, schneiden beide Enden (Abbildung 1C2). Fügen Sie ein gebogener Insektenstift im vorderen Teil der Schnur der Schnur zu manipulieren und beachten Sie seine Ausrichtung (Pfeil in Abbildung 1C2). Dann übertragen das Rückenmark zu einer eiskalten K-Gluconatlösung. HINWEIS: Diese Lösung ahmt die intrazelluläre Zusammensetzung des CSF und die Zellen vor dem Absterben des osmotischen Schock verhindern , sobald die Motoneuronen 26 geschnitten wird. </li><li> Sobald das Rückenmark innerhalb der intrazellulären Lösung ist, nehmen Sie den Becher mit dem Agar aus dem trockenen Bad und kühlen sie auf eine Mischung aus Eis und Wasser. </li><li> Halten Sie Rühren, während die Temperatur zu messen. Wenn die Temperatur 38 ° C erreicht das Rückenmark tauchen, es durch das Insekt Stift halten und legen Sie sie nach unten rostralen Seite. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark ist als straight wie möglich weg von den Wänden, Schwanz- Teil leicht nach oben (Abbildung 1D1). </li><li> Verlassen das Becherglas in das Gemisch aus Eis und Wasser das Agar zu ermöglichen, so schnell wie möglich zu verfestigen. Stellen Sie sicher , dass es an seinem Platz bleibt und dass das Kabel so gerade wie möglich (Abbildung 1D1) ist. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Nach dem Erstarren schneiden den Agarblock das Rückenmark in der Weise , dass die Basis des Blocks in einem 35 ° Winkel mit dem Lendenteil des Cords (Pfeil in Figur 1D2) enthält. Die dorsale Oberfläche sollte entfernt werden , mit Blick auf von der Basis (Abbildung 1D2). Hinweis: Dies ist ein kritischer Schritt in dem Verfahren zum Aufrechterhalten der Kontinuität der Motoneuron-Pools zu den ventralen Wurzeln, von dem sie zu verlassen. </li><li> Kleben Sie den Block in die Kammer des Vibratom mit Sekundenkleber. Tauchen sie in K-Gluconatlösung und fügen Sie slushed gefrorenen K-Gluconatlösung zu haltendas Bad (unter 2 ° C) gekühlt. </li><li> Schneiden Sie 350 bis 400 &amp; mgr; m dicke Scheiben der Lendengegend (erkennbar durch ihre Krümmung und mit größerem Durchmesser). In der richtigen Ausrichtung (siehe 1.4.1.), Verwenden Sie die Klinge von der dorsalen auf der ventralen Oberfläche zu schneiden und Scheiben kontinuierlich mehr rostral machen. Typischerweise gibt es 4-5 geeignete Scheiben mit ventral Wurzeln erstreckt 2 mm oder mehr. Verwenden Sie die folgenden Parameter: 10 ° Winkel, 70 Hz Schwingungsfrequenz und 10 mm / min Geschwindigkeit des Schneidens. </li></ol></li><li> Die Inkubation <ol><li> Übertragen Sie die Scheiben zu ACSF bei 34 ° C. Nach ca. 30 min, kühlen die Scheiben bis auf RT und die Aufnahme-Session beginnen. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection A1:. Die Entfernung der Haut des Rückens der dorsalen Säule zu belichten A2:Schneiden der Schultern und Rippen der dorsalen Säule frei B1:. Vertebrale Spalte auf die Silizium-gefüllte Petrischale gepinnt (dorsalen Seite nach oben, kaudal links) B2:. Gleiche mit dem Rückenmark ausgesetzt und seziert C1:. Rückenmark isoliert . (rostralen Seite links) C2: Rückenmark bereit eingebettet werden (Bauchseite nach oben, rostralen Seite links). Notieren Sie sich die kleineren Insektenstift an der rostralen Seite D1:.. Rückenmark im Agar - Becher (rostralen Seite dow, Bauchseite gegenüber dem Boden) D2: Cut Agar - Block mit dem eingebetteten Rückenmark. Notieren Sie sich die 35 ° Winkel der Rückenmark bildet mit der Basis des Blocks und der Lendenanschwellung (Pfeil). Maßstabsbalken 1 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Platzieren der Scheibe in die Kammer HINWEIS: Ventral Wurzeln sind von unterschiedlicher Größe. <ol><li> Bereiten Sie eine Schachtel mit verschiedenen Pipetten mit Spitzendurchmessern von 40 bis 170 &amp; mgr; m im Voraus reichen. Zur Vorbereitung Saugpipetten, bereiten viele Pipetten mit einer langen Verjüngung. Mit einem Diamantmesser, machen einen Schnitt an verschiedenen Positionen. Dann unter einem Binokular, brechen sie durch die Spitze mit einer Pinzette zu schlagen. </li><li> Entfernen Sie die Kammer von der Aufnahme Mikroskop und legen Sie sie unter einem Binokular. </li><li> Wählen einer Scheibe, die einen ventralen Wurzel von ausreichender Länge enthält (2 mm oder mehr) auf eine Nutsche Stimulationselektrode angebracht zu werden. Wählen Sie die richtige Ausrichtung der Scheibe mit den ventralen Wurzeln nach oben (2A) und schneiden Sie vorsichtig die Agar um die ventralen Wurzeln , während der Rest des Agar verlassen um die Scheibe (2B). Hinweis: Da der Agar fester als die Scheibe ist, wird dies die Gewinde des Ankers Scheibe ermöglichen, sich auf dem Agar zu ruhen und nicht auf der Scheibe und damit die anchor wird das Gewebe nicht schädigen. Stellen Sie sicher , dass die Fäden des Ankers Scheibe oberhalb der Motoneuron - Pool (in rot in 2C gezeigt). </li><li> Montieren Sie die Kammer wieder auf das Mikroskop und kontinuierlich die Aufnahmekammer perfuse mit ACSF mit einer Rate von 1 bis 2 ml / min bei RT. Verwendung einer Glaspipette mit ACSF gefüllt und mit einer Spritze verbunden, saugen einen der ventralen Wurzel (Pfeil in Figur 2C). Um eine gute Stimulation des ventralen Wurzel zu erreichen, muss die Pipettenspitze um den ventralen Wurzel dicht sein. Einen Pol sollte in der Stimulationselektrode und die andere in dem Bad (oder mit der patch-Klemmelektrode reference). </li><li> Erreichen patch-clamp Aufzeichnung der gewünschten Zelltyp und notieren Sie die Wirkung der ventralen Wurzel Stimulation als previsouly 10 beschrieben. <ol><li> Hier wird ein Verstärker für die Datenerfassung verwendet werden. Filter Ganzzellableitungen bei 3 kHz. Digitalisieren bei 10 kHz. Compensate Brückenwiderstand in current-Clamp-Modus. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ventralwurzel Vorbereitung A: Lendenwirbelscheibe Rückenmark eingebettet in Agar mit der ventralen Wurzel nach oben . B: lumbalen Rückenmark Scheibe mit den ventralen Wurzeln aus dem Agar befreit . C: lumbalen Rückenmark Scheibe mit einer Stimulationselektrode eng um den ventralen Wurzeln (Pfeil) platziert . Beachten Sie die Position der Renshaw - Zellen, die rote Fluoreszenz im CHRNA2-Cre Maus 28 mit der Maus Reporter gekreuzt R26 Tom 17. Maßstabsbalken 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<ol>
	<li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation.">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li><li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord.">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li><li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices.">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li><li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo.">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417 (2007).</li><li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat.">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li><li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals:+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase.">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li><li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat.">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li><li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording.">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse.">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots.">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition.">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition).">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li><li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G(93A-Low)+mice.">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li><li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li><li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li><li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS.">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li><li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo.">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice.">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors.">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse.">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li><li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses.">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li><li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells.">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li><li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK.">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li><li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices.">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li><li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat.">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li><li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gower's+tract+and+spinal+border+cells.">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li><li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts.">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li><li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse.">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li><li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-,+T-,+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons.">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li><li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord).">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li><li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse.">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity.">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Oblique slicing des Rückenmarks ist wichtig, da es für die einseitige Stimulation der Motoneuron-Pools und Renshaw Zellen in einer einzigen Wirbelsegments in einer zuverlässigen, umfassende und spezifische Weise ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht es eine schnelle, elegante und eindeutige Identifikation von aufgezeichnetem Motoneurone. Als nächstes werden wir die Vorteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Scheibe Zubereitungsmethoden zu markieren, und dann werden wir die häufigsten Fallen stressen zu vermeiden, während der Durchführung dieses Verfahrens. Die meisten Studien Querschnitten unter Verwendung stützen ihre Identifizierung auf intrinsischen elektrischen Eigenschaften 3,14,15,29. Doch diese variieren stark zwischen den Motoneuron - Pools sowie zwischen Motoneuron - Subtypen innerhalb eines bestimmten Pool (Alpha-, Beta- und Gamma-Motoneuronen 30). Daher sind unter Verwendung von Studien Größenparameter wahrscheinlich kleiner Gamma-Motoneuronen auszuschließen. Auf der anderen Seite, Cooper und Sherrington described 1940 eine Gruppe von großen Nervenzellen im ventrolateralen grauen Substanz des lumbalen Rückenmark von Affen und Katzen , die 31,32 Axone aufsteigend überschritten hatte. Zusätzlich zu den Motoneuron somas nahe zu sein, stellten sie fest, dass sie von Motoneuronen histologisch nicht zu unterscheiden erschienen. Ein kürzlich erschienener Artikel bestätigte die Existenz solcher Zellen in der Maus 33. Aufgrund der großen Grße dieser Zellen und ihre Lage, konnten sie wurden in früheren Studien irrtümlicherweise enthalten. Unser Identifizierung Kriterium schließt mutmaßliche spinal Grenzzellen, da ihre Axone in der ventralen Wurzel nicht projizieren, während gleichzeitig eine zuverlässige Identifizierung aller Motoneuronen, unabhängig von ihrer Größe. Darüber hinaus die intrinsischen elektrischen Eigenschaften zu analysieren, (zB Eingangswiderstand), ist zeitaufwendiger als die einfache Beobachtung eines antidromic Aktionspotential. Neben intrinsischen elektrischen Eigenschaften verwenden, einige Studiemit biocytin Etikettierungen 14,17 s quer Scheiben verwenden, bestätigen ihre Identifizierung durch die Durchführung post - hoc - Analyse der molekularen Marker für die Motoneurone (wie Islet-1/2 16) oder durch die Morphologie zu visualisieren. Solche Kennzeichnungen sind jedoch langwierig und bieten keine direkte Identifizierung. Sie werden daher nur selten systematisch durchgeführt. Einige Studien versucht , den Einsatz von Mauslinien , um eine genetisch kodierte Motoneuron fluoreszierenden Marker exprimieren (Hb9-GFP Mauslinie 18, ChAT-EGFP transgenen Mäusen, die eGFP in cholinergen Zellen einschließlich Motoneuronen 19 oder G85R SOD1-YFP transgenen Mäuse exprimieren, die stark exprimieren das YFP - Fusionsprotein in Motoneuronen 17). Da jedoch der genetische Markerexpression üblicherweise in Zeit und da die Scheiben üblicherweise von Embryonen oder juveniles genommen werden konditioniert wird, wird die Expression des Markers nicht im Alter angemessen die study durchgeführt wird. Andere Studien haben rückläufige Mittelinjektion 34 verwendet das Motoneuron - Pool zu visualisieren. Wir Choleratoxin Beta-Injektionen in die soleus oder der EDL (persönliche Beobachtung) auch durchgeführt. Solche Markierungstechniken sind von großem Wert eines bestimmten Motoneuron-Pool zu beschriften, sondern erfordern langwierige Operation ein paar Tage vor dem Experiment. Darüber hinaus ist die junge Alter, in dem die Scheibe Experimente durchgeführt werden, ist es wesentlich schwieriger, speziell die Muskeln Ziel. Schließlich gibt es ein echtes Anliegen der Motoneuron von Stören durch eine exogene Substanz injiziert wird. Unter optimalen Bedingungen konnten wir antidromic Aktionspotentiale in nahezu alle aufgenommenen Motoneurone zu erhalten. Der 35 ° -Winkel eingesetzt ist kritisch ventral Wurzeln von ausreichender Länge zu erhalten. Abschließend bietet die schräge Scheibe Vorbereitung eine schnelle und zuverlässige Art und Weise jedes Motoneuron zu identifizieren, die zu anderen Identifizierungstechniken überlegen ist. Wie in der Einleitung erwähnt, nur zwei Studien berichtet erfolgreiche Stimulation der ventralen Wurzeln in Querschnitten. Die erste Studie aufgezeichnet zervikalen Neuronen in der Ratte stimuliert und die weiße Substanz , wo der ventralen Wurzel Stutzen 4 austritt. Sie erfolgreich antidrome Aktionspotential in 85% der aufgenommenen Neuronen induziert. Wir glauben, dass ihre hohe Erfolgsquote auf die Tatsache gestützt, dass bei der zervikalen Ebene, die Axone und Somen von Motoneurone auf der gleichen Ebene liegen. Dies ist nicht der Fall in mehr caudal slices. Schon bei der zervikalen Ebene, deren Querscheiben behielt nur Stubs der ventralen Wurzeln, die weniger zuverlässig sind zu stimulieren. Die zweite Studie stimulierte die Hühnerembryo dorso-Lendenwirbelsegment 5. Allerdings verwendeten sie spannungsempfindlichen Farbstoff-Aufnahme, die die räumliche Auflösung fehlte den Erfolg der Induzierung einer antidromic Aktionspotentiale auf Einzelzellebene anzuzeigen. Unsere Scheibe preparatIon bietet auch eine hervorragende Möglichkeit , Renshaw - Zellen zu stimulieren , wie kürzlich in einem Papier 28 angegeben. Mit Hilfe der schrägen Scheiben, waren sie in der Lage monosynaptic Renshaw Zellen - Antworten in 46% der Fälle zu erfassen, die eine wesentliche Verbesserung von 10% Erfolgsrate lag bei angetroffen mit Querschnitten 35. Obwohl wir nicht einen ähnlichen Vergleich zur Stimulation der Motoneuron-Pools, diese Beobachtung in der Renshaw-Zelle führt uns finden konnten, zu glauben, dass Motoneurone auch mehr Konnektivität beizubehalten. Oblique Aufschneiden des Rückenmarks ist eine sehr anspruchsvolle Technik, die zuverlässig viel Übung erfordert, bevor ein Präparat, von dem Erhalt eines aufzeichnen kann. Mit sehr feine und scharfe Pinzette und Mikro-Schere ist von wesentlicher Bedeutung. Die Zeit, zu sezieren kann ziemlich lang sein (bis zu 1 Stunde), solange das gesamte Verfahren in gekühltem Carbogen blasigen Dissektion Medium durchgeführt wird. Während einige Autoren erkennen keinen Nutzen intrakardialer perfusion in der Herstellung von Scheiben 36, beschlossen wir , diesen Schritt des Verfahrens aufrecht zu erhalten. Es ist schwer, den Vorteil der intrakardialen Perfusion für die Qualität der Aufnahmen objektiv zu messen, vor allem, weil es mit dem Alter ändert. Der wichtigste Faktor ist die Maus Alter. Wir nahmen erfolgreich von Mäusen zwischen P2 und P11 das obige Protokoll verwendet. Historische diesem Alter wird das Rückenmark Myelin zu dicht und die größten Zellen (die Motoneurone) sterben vor dem Schneiden, höchstwahrscheinlich wegen Sauerstoffmangel. Nach diesem Fenster, fanden wir es immer schwieriger, gesunde Scheiben zu erhalten. In jüngster Zeit wurden neue Techniken berichtet worden , bei älteren Tieren 17,36 gesunde Scheiben zu erhalten. Sie benutzten zusätzliche Additive , um ihre Sezieren und Aufzeichnungsmedium wie ergänzende Energiequellen (Ethyl-Pyruvat), geringere Na + und Cl - Konzentrationen Onkose der Zellen 37,38 und Polyethylenglykol zu verhindern , dass die eff zu begrenzenjekte der umfangreichen Membran, die während des Schneidens Querschnitten erhalten auftreten. Mit solchen Verbesserungen konnten sie von bis zu 6 Monate alten Tiere aufzunehmen. In Zukunft wäre es interessant, schräge Schnittpräparate bei erwachsenen Tieren, um zu versuchen, die Vorteile der beiden Techniken kombinieren. die beiden Protokolle Die Kombination sollte relativ einfach nachweisen und ein zuverlässiges Werkzeug Motoneuron Identität zu bestätigen und zu studieren, die Bevölkerung von Axonkollateralen von Motoneuronen in erwachsenen Mäusen gezielt bereitzustellen. Darüber hinaus könnte man versuchen, schräge Scheiben im Embryo Maus zu erhalten. Bemerkenswert unserer Zubereitung behält auch die dorsalen Wurzeln, die das Rückenmark, sowie die Aktivierung von dorsal neuronaler Populationen stimuliert werden kann , um die Aktivierung monosynaptic I a Innervation der Motoneuronen zu studieren. Abschließend bieten Ventralwurzel Stimulationen ein zuverlässiges Werkzeug Motoneuron Identität zu bestätigen und die Bevölkerung von Motoneuron Axonkollateralen gezielt zu untersuchen. &lt;/ P&gt;

Historisch gesehen , in vivo an großen Tieren wie Katzen oder Ratten Motoneuron Aufnahmen scharf Elektrode 1 wurden durchgeführt , oder auf einem isolierten ganzen Rückenmark in Mäuse 2. Die Entstehung der Patch-Clamp-Aufnahmetechnik in den 1980er Jahren für den direkten Zugriff auf das Motoneuron genannt somas nach Bedarf Abdichtung unter Sichtführung erreicht werden. Somit wurde das Rückenmark slice Zubereitung leicht seit den frühen 1990ern 3 erreicht. Jedoch oft früh slice Zubereitung nicht für die Stimulation der ventralen Wurzeln ermöglichen. Nach bestem Wissen und Gewissen, haben nur zwei Studien erfolgreich Stimulation der ventralen Wurzeln in Querschnitten berichtet, und keiner wurde von den Mäusen 4,5 erhalten. In diesem Artikel stellen wir eine Technik tragfähige Rückenmarksscheiben neugeborenen Mäusen zu erreichen (P2 - P11) in dem die Motoneuron-Pool seiner ventralen Wurzel abzuweichen Axone beibehält. auslassenral Wurzel Stimulation löst antidromic Aktionspotential aus dem gleichen Ventralwurzel zurück in die Somen des Motoneuron-Pool zu verlassen. Es regt auch die Motoneuron Sicherheiten Ziele, andere Motoneuronen 6-10 und die Renshaw - Zellen 11-13. Da nur Motoneurone ihre Axone die ventralen Wurzeln nach unten senden, verwenden wir die Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale als eine einfache und sichere Weg um physiologicaly Motoneuronen 10 identifizieren. Neben der Verwendung von potenziell nicht-inclusive oder irreführende elektrophysiologischen und morphologischen Kriterien , um die Motoneuron Identität, die jüngsten Studien über Rückenmark Motoneurone zu bestätigen stützen sich ebenfalls auf mühsame und zeitraubende Post - hoc - Anfärbungen 16. Eine solche Identifizierung wird in der Regel nur durchgeführt mit einer Probe der aufgezeichneten Zellen. Andere Identifikationsstrategien setzen auf Mauslinien, in denen die Motoneurone endogene Fluoreszenz exprimieren <sup&gt; 17-19. Doch bereits in jungen Jahren mit genetisch kodierten Markierungen kann schwierig sein, wenn Markerexpression noch variabel ist oder wenn die Studie erfordert bereits eine transgene Mauslinie verwendet wird. Alternativ kann antidrome Aktionspotentialaufzeichnungen routinemäßig auf allen Mäusen vom Beginn der Zellaufnahme erfolgen. Experimentatoren arbeiten an intakten Rückenmark Vorbereitungen bei der Katze, Ratte und Maus haben zuverlässig solche Identifikationstechniken seit den 1950er Jahren 1,2,20,21 verwendet. Bei optimalen Bedingungen konnten wir antidromic Aktionspotentiale aus praktisch alle aufgenommenen Motoneurone zu entlocken. Darüber hinaus können Ventralwurzel Stimulation verwendet werden , um zuverlässig andere Motoneurone 22,23 oder ihre Ziele begeistern. die Renshaw Zellen 10,24,25. Wir präsentieren hier Anwendungen der Ventralwurzel Stimulation in Form von antidromic Aktionspotential Aufnahmen von Motoneuron somas sowie Anregung von Renshaw Zellen.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Na-kynurenate</td>
			<td >ABCAM</td>
			<td >ab120256</td>
			<td >dissolves better then other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaH2PO4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaHCO3&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CaCl2&#160;</td>
			<td >G Biosciences</td>
			<td >R040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2&#160;</td>
			<td >Quality Biological</td>
			<td >351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glucose&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ascorbic acid&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na-pyruvate&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >K-gluconate&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX-314</td>
			<td >Alomone</td>
			<td>Q150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CsOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >232041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Na-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gluconic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >G1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >232041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td >P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vannas Spring Scissors - 2.5mm&#160;</td>
			<td >FST</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stimulator</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td colspan="2">Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibratome</td>
			<td >Campden</td>
			<td >Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation

Elektrophysiologische Aufnahmen von Rückenmark Scheiben haben sich als wertvolle Technik zu sein, ein breites Spektrum von Fragen zu untersuchen, die von Mobilnetzwerkeigenschaften. Wir zeigen, wie rentabel schräge Scheiben des Rückenmarks von jungen Mäusen herzustellen (P2 - P11). Bei dieser Herstellung behalten die Motoneuronen ihre Axone von den ventralen Wurzel des Rückenmarks kommen aus. Die Stimulation dieser Axone entlockt zurück ausbreitenden Aktionspotentiale der Motoneuron somas und spannend die Motoneuron Kollateralen im Rückenmark eindringen. Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale ist eine sofortige, endgültige und elegante Art und Weise Motoneuron Identität zu charakterisieren, die andere Methoden Identifizierung übertrifft. Darüber hinaus ist die Motoneuron Kollateralen stimulierenden eine einfache und sichere Weg, um die Sicherheit Ziele der Motoneuronen im Rückenmark, wie andere Motoneuronen oder R zu erregenenshaw Zellen. In diesem Protokoll stellen wir antidrome Aufnahmen von der Motoneuron somas sowie Renshaw Zellanregung aus ventral root Stimulation.

Bestätigung der Motoneuron Identität Mit antidromen Aktionspotentialen Zell - Targeting Motoneurone sind im ventralen Horn (sichtbar in rot in 2C) gefunden. Starten Sie aus dem Bündel von Axonen der ventralen Wurzel bildet, und gehen bis das Bündel streut voll und man beginnt, große Zellen zu sehen (lange soma Achse, über 20 &amp; mgr; m). Erreichen whole-cell Aufnahme eines runden gesund aussehendes Zelle eine Elektrode Anfangswiderstand von 3 bis 4 M &amp; OHgr verwenden. Die interne Lösung verwendet wurde, enthielt: 140 mM K-Gluconat, 6 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na 2 GTP. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 mit KOH, und die Osmolarität auf 285-295 mOsm mit destilliertem Wasser zugesetzt. <strong&gt; Bestätigung der Motoneuron Identität Sobald Ganzzellaufnahme erreicht wird, eine einzelne zweiphasige Stimulation des ventralen Wurzel gelten (1 - 50 V, 0,1 bis 0,3 ms) ein antidromic Aktionspotential in den aufgenommenen Zellen des ventralen Schnur zu entlocken Figuren 3A1 und 3A2 zeigen antidromic Aktion. Potentiale in Voltage-Clamp oder Strom-clamp, respectively. Wenn die Stimulationsintensität von 1 bis 5 V zu erhöhen (Abbildung 3A1) und von 10 bis 15 V (Abbildung 3A2) die antidromic Aktionspotential erscheint in einem Alles-oder-nichts - Mode mit einer Latenzzeit von 0,9 ms und 1,1 ms sind. Da nur Motoneurone ihre Axone durch die ventralen Wurzeln zu senden, ist die antidromic Aktionspotential ein Beweis für die Zellidentität. In einer Minderheit der Motoneurone (ca. 10%), scheiterte Ventralwurzel Stimulationantidromic Aktionspotential auslösen , sondern löste orthodrome Aktionspotentiale. Die Figuren 3B1 und 3B2 zeigen orthodrome Aktionspotentiale in Voltage-Clamp oder Stromklemme verbunden. Wenn die Stimulation von 20 bis 30 V (Abbildung 3B1) zu erhöhen und von 25 bis 40 V (Abbildung 3B2), erscheint ein Aktionspotential, eine frühere exzitatorischen postsynaptischen Strom folgende (EPSC) oder exzitatorischen postsynaptischen Potentials (EPSP). Die Latenzen der Aktionspotentiale sind länger (5,1 msec und 5,3 msec, respectively). In diesen beiden Zellen löste die Ventralwurzel Stimulieren eines Feed-Forward-Anregung (Motoneurone Axonkollateralen sich senden und zu anderen Motoneurone), die stark genug war, ein orthodrome Aktionspotential zu entlocken. In derartigen Zellen eine antidrome Aktionspotential auslösen das Versagen (gekennzeichnet durch seine Alles-oder-nichts-Mode und einer Latenz von weniger als 5 msec) sagt uns ar schließen, dass diese Zellen nicht zulassen,<html> e Motoneurone. Man beachte, daß die Intensität erforderlich Stimulation hervorzurufen Vorwärtserregungs ist höher als die benötigte eine antidrome Aktionspotential hervorzurufen. Alle hier gezeigten Stimulationen sind 0,1 msec aber manchmal mehr Stimulation (bis zu 0,3 ms) erforderlich sein kann, eine antidrome Aktionspotential hervorzurufen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig3.jpg" /> Abbildung 3. Motoneuron Responses to Ventralwurzel Stimulation A1: 1 V (rote Kurve) und 5 V (schwarze Kurve) Stimulationen A2:.. 10 V (rote Kurve) und 15 V (schwarze Kurve) Stimulationen B1: 20 V (rote Kurve) und 30 V (schwarze Kurve) Stimulationen . B2: 25 V (rote Kurve) und 40 V (schwarze Kurve) Stimulationen. Schwarze Punkte zeigen Reiz Timing. Doppelpfeilspitzen betonen den Unterschied in der Latenzen zwischen Ortho- und antidromic Spikes.m / files / ftp_upload / 54525 / 54525fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Renshaw Zellstimulation Zell - Targeting Renshaw Zellen im Vorderhorn 27,28 gefunden. Visualisieren Sie die Axon-Bundles mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bildgebung ein 20X und ein 63X Ziele verwenden. Starten Sie aus dem Bündel von Axonen der ventralen Wurzel bildet , und gehen bis die Axone zu zerstreuen beginnen , aber sind noch erkennbar (Abbildung 4A, Pfeile). Ziel ist für die Zellen mittlerer Größe (etwa 10 bis 15 &amp; mgr; m im Durchmesser, 4A, Pfeilspitzen). Erzielen Sie whole-cell Aufnahme eines runden gesund aussehende Zelle eine Elektrode aus anfänglichen Widerstand von 5 bis 7 MOhm mit. Je nach Experiment verwendeten wir either Cs + -basierten oder K + -basierte interne Lösungen 10. Die Cs-basierte Lösung verhindert große Kaliumströme, die um -45 mV sichtbar waren. In einigen Experimenten haben wir auch 5 mM QX-314 die Natriumkanäle, die für Spiking in dem aufgezeichneten Zelle zu blockieren. Die Cs + -basierte Lösung enthält: 125 mM Cs-Gluconat, 5 mM QX-314 Cl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 1 mM CaCl 2, 4 mM Mg-ATP und 0,4 mM Na-GTP, wobei der pH eingestellt auf 7,3 mit CsOH. Die K + -basierte Lösung sollte sowohl in spannungs- und stromKlemme, die Renshaw Zellantworten auf ventralen Wurzel Stimulation in Bedingungen annähert , so viel wie möglich die physiologischen diejenigen zu analysieren verwendet werden. Diese Lösung enthält: 125 mM K-Gluconat, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2, 4 mM Mg-ATP, 0,4 mM Na-GTP, wobei der pH auf 7,3 mit KOH eingestellt. Die Reizstärke zwischen 10 und 100 V und die Dauer variiert, variiert zwischen 50 und 300 &amp; mgr; s. Bipo<html> lar Pulse wurden in allen Fällen verwendet. Antwort der Renshaw - Zellen zu Ventralwurzel Stimulation Die Stimulation des ventralen Wurzel löst die corelease von Glutamat und Acetylcholin aus Motoneuron Kollateralen auf die Renshaw Zellen 10. Feed-Forward - Hemmung vermittelt durch GABA und Glycin rekrutiert auch 10. 4B zeigt Antworten auf die einzelnen Stimulation des ventralen Wurzel. Die Zelle wurde in einen Voltage-Clamp-Modus mit dem Cäsium-basierten Lösung aufgezeichnet, und bei einer Spannung von -45 mV gehalten. QX-314 in der intrazellulären Lösung verhindert die Zelle von Brennen und GABA und Glycin-Antworten wurden von 3 uM Gabazin blockiert und 1 &amp; mgr; M Strychnin, respectively. Der nach innen gerichtete synaptischen Stroms in 4B ist die Summe der glutamatergen und Nikotin Ströme. <html> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig4.jpg" /> Abbildung 4. Renshaw - Zell - Stimulation aus der Ventralwurzel A: Bilder der Renshaw - Zellpools erworben einen schrägen Kondensator in derselben Schicht genommen bei zwei verschiedenen Vergrößerungen (20x und 40x - Objektive) verwendet wird . Beachten Sie die Motoneuron Axone in die Ventralwurzel verschmelzenden (Pfeil). Vermeintliche Renshaw-Zellen werden mit Pfeilen angezeigt. Maßstabsbalken: 100 &amp; mgr; m in A1, 50 &amp; mgr; m in A2 . B: Voltage-Clamp - Aufnahmen einer Renshaw Zelle nach Stimulation des ventralen Wurzel (schwarzer Punkt). Die rote Kurve ist der Durchschnitt der grauen. Haltespannung wurde auf -45 mV eingestellt. QX-314 in der intrazellulären Lösung verhindert die Zelle von Brennen und GABA und Glycin-Antworten wurden von 3 uM Gabazin blockiert und 1 &amp; mgr; M Strychnin sind. Schwarzer Punkt zeigt an Reiz Timing.com / files / ftp_upload / 54525 / 54525fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation at JoVE.com

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Wir zeigen, wie schräge Scheiben des Rückenmarks in jungen Mäusen vorzubereiten. Diese Herstellung ermöglicht die Stimulation der ventralen Wurzeln.

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Aufrufe.  Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes.  Wir zeigen, wie schräge Scheiben des Rückenmarks in jungen Mäusen vorzubereiten. Diese Herstellung ermöglicht die Stimulation der ventralen Wurzeln. 

Serie: The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

Vorbereitung der Parasagittale Slices für die Untersuchung von dorsal-ventrale Organisation des medialen entorhinalen Cortex Nager

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video