Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

1. Die Beurteilung der Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren auf Pellicle und Biofilm Koloniebildung <ol><li> Bereiten Sie eine 2x Lösung definierter Biofilm-induzierenden MSgg Medium 25 ohne Calciumchlorid und Eisen (III) -chlorid - Hexahydrat. Nach Filtersterilisation, das Calciumchlorid hinzu. Das Medium bereit ist, direkt zu verwenden, oder es kann in der Dunkelheit bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie die 1x MSgg Verdünnungs am Tag des Experiments. <ol><li> Verdünne die 2x MSgg Medium mit sterilem destilliertem Wasser (Häutchen) oder sterile 3% heißem (80 ° C) Agar (Biofilme) und fügen Eisen (III) -chlorid-Hexahydrat auf eine Endkonzentration von 50 uM (Häutchen) oder 250 &amp; mgr; M bis 1 x ( Biofilme). Fügen Sie Antibiotika oder kleine Molekül-Inhibitoren auf die gewünschte Konzentration und gut mischen. Um beispielsweise eine Endkonzentration von 0,5 mM D-leucin in 30 ml zu erhalten, Häutchen oder Biofilme zu etablieren, fügen 196,6 ul einer 76,3 mM (10 mg / ml) D-Leucin-Stammlösung. NEINTE:. Die endgültige 1x MSgg Zusammensetzung in Tabelle 1 beschrieben , ist im Vergleich zu dem Originalrezept 25 enthielt das Medium 50 ug / ml Threonin und die Eisenkonzentration Biofilm - Kolonien auf festem Medium wachsen MSgg wurde 2,5 - fach erhöht , um die faltigen Koloniemorphologie zu optimieren . </li></ol></li><li> Nach dem Erstarren des Agars, trockne die festen MSgg Platten in einer biologischen Haube für 30-45 min vor der Inokulation. </li><li> Um spezifische Inhibitoren auszuwählen , die mit den Mechanismen der Pellikelbildung (Abbildung 1) interferieren, auszuschließen , dass die verwendeten Konzentrationen beeinflussen planktonischen und statische Wachstum. <ol><li> Bestimmen planktonischen Wachstums (Zunahme der optischen Dichte über die Zeit in Flüssigkultur) in einem einfachen Wachstumskurve, die durch die optische Dichte bei 600 nm, bis die stationäre Wachstumsphase jede Stunde gemessen wird. </li><li> Um zu bestätigen, daß die gemessene Trübung Kultur lebende Zellzahlen darstellt, bestimmen die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU)von Zellen in der planktonischen Wachstumsphase aus einer Schüttelkultur nach mehreren Zeitpunkten. </li><li> Um die Wirkung von kleinen Molekül-Inhibitoren auf die statischen Häutchen Wachstum, Ernte Zellen am Ende eines 3-tägigen Inkubation bei 23 ° C von einer 24-Well-Zellkultur zu bewerten und unter den gleichen Bedingungen beimpft wie in den Abschnitten 1.7-1.9 beschrieben und bestimmen die CFU. Für diese Steuerung verwenden , um ein Häutchen-defizienten Stamm, der die Operons für die extrazelluläre Matrixkomponenten (dh B. subtilis Δ epsH, Δ Tasa) fehlt. HINWEIS: Dieser Stamm ist in der Lage unter statischen Bedingungen wachsen, aber im Gegensatz zu einem Pellicle-bildenden Wildtyps ist es einen Mangel an der Fähigkeit, die Flüssigkeit-Luft - Grenzfläche zu schwimmen, wo das Wachstum durch erhöhte Sauerstoffgehalt 26 begünstigt wird. Somit ist diese extrazelluläre Matrix- und Häutchen-defizienten Stamm ist eine empfohlene Referenzstamm Wachstum unter statischen Bedingungen zu beurteilen. HINWEIS: Für die spezifische Exausreichend der nicht-kanonische D-Aminosäure D-Leucin unten beschrieben, eine Wirkung auf planktonischen und statische Wachstum bei Konzentrationen , die mit Pellikelbildung gestört wurde 12,17 ausgeschlossen. Die Methoden planktonischen und statische Wachstum zu bestimmen , sind im Detail 17 beschrieben. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> Abbildung 1. Konzeptübersicht für die Identifizierung eines robusten Versuchsaufbau die spezifische Hemmung der Biofilmbildung zu bewerten. Die Auswahlkriterien für kleine Molekül - Inhibitoren , die spezifische Interferenz mit Biofilmbildung zeigen , ohne ausgeprägte Wirkung auf Planktonwachstum. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen dieser Figur.</a> <ol start="5"><li> Streak aus B. subtilis von einem -80 ° C Lager (LB culture von 10 9 Zellen / ml in 20% Glycerin eingefroren) einzelne Kolonien auf einem LB-1,5% Agar - Platte mit einer sterilen Spitze oder Applikatorstäbchen zu isolieren. </li><li> Wachsen über Nacht bei 30 ° C. </li><li> Kritischste Schritt: Für eine robuste Pellicle Hemmung durch die nicht-kanonische D-Aminosäuren wie D-Leucin, zu wachsen nahm eine einzelne Kolonie von der LB-1,5% Agar - Platte in 3 ml LB - Brühe bei 37 ° C für 4 h in einem Schüttelinkubator (Schüttelgeschwindigkeit 200 Umdrehungen pro Minute). Ersetzen die LB-Brühe mit Biofilm-induzierenden MSgg Medium vor der Beimpfung durch Zentrifugieren 1,5 ml Starterkultur für 4 min bei 6000 xg, sorgfältig den Überstand zu entfernen und Resuspendieren des Pellets in 1,5 ml MSgg Medium. Der Rest der Kultur kann verworfen werden. Wichtig: Um die Robustheit des Systems zu gewährleisten, die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) der gewaschenen Starterkultur sollte zwischen 0,6 und 1 liegen. </li><li> Während des Wachstums der Starterkultur, bereiten eine 12-Well-Zellkultur Multidish Platte mit deg 3 ml MSgg Medium ohne oder mit einem Konzentrationsbereich des kleinen Molekül - Hemmstoff (beispielsweise 0,3, 0,5, 1 mM D-Leucin - 17). Um Randeffekte auszuschließen, verteilen sich die Position der verschiedenen Konzentrationen über die Multidish Platte. Alternativ können Sie auch 24-Well-Zellkulturplatten Multidish 1,5 ml MSgg Medium enthält. </li><li> Beimpfen die Vertiefungen der 12-Well-Zellkultur Multidish-Platte mit 3 ul der gewaschenen Starterkultur (1: 1000 Verdünnung). HINWEIS: Eine niedrigere Verdünnungsverhältnis, das heißt, 1: 500 verwendet werden. Dies verringert die Entwicklungszeit der Häutchen. </li><li> Wachsen die Häutchen bei 23 ° C unter statischen Bedingungen für drei Tage. Nicht die Häutchen in dieser Zeit bewegen, wie es die endgültige Oberflächenmorphologie der Pellicle beeinflussen können. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit einem Binokular und homogene Belichtung von Blitz. Alternativ können Sie auch ein Bild von den Häutchen mit einer hochauflösenden Kamera. Um zu vermeiden, durch inconsis verursachte ArtefakteZelt Licht Winkel und Schatten, nehmen Top-down-Bilder mit der Kamera auf einem Stativ befestigt ist und eine weiche und große Lichtquelle bei 45 ° von beiden Seiten nutzen. ANMERKUNG: Eine alternative Methode B. zu studieren subtilis Vielzelligkeit ist der Biofilm - Kolonie - Assay auf festem, Biofilm-induzierenden MSgg Medium. Wie Häutchen, ermöglicht dieser Test die Untersuchung von Raum-Zeit-Prozesse. Sobald der aktive Bereich von niedermolekularen Inhibitoren bestimmt wird, deren Wirkung auf die Koloniebildung Biofilm untersucht werden. </li><li> Zur Biofilm-Kolonien wachsen, punktsymmetrisch 1,5 ul der ungewaschenen Vorkultur (Schritt 1.7) auf der getrockneten MSgg 1,5% Agar-Platte mit Hilfe einer Schablone, - 4 Tropfen pro Petrischale von 8,5 cm Durchmesser. Lassen Sie die Tropfen auf die Platte adsorbieren, bevor sie in Bewegung. HINWEIS: Die Vorlage hilft, eine gleichmäßige Verteilung der Biofilm Kolonien innerhalb des Gebiets zu erhalten, wo die Zellen gezüchtet werden. Um die Vorlage zu bereiten, die Gesamtfläche des Wachstums an der ursprünglichen Skalen ziehen, teilen sie gleich Sekteors und die Mitte markieren. Für eine Runde Petrischale von 8,5 cm Durchmesser, weist diese 14 cm 2 zu einem Biofilm Kolonie. </li><li> Inkubiere die Platten bei 30 ° C für drei Tage. Während dieser Zeit Biofilm Kolonien entwickeln und bilden eine dreidimensionale, faltige Struktur. </li><li> Nehmen Sie Bilder wie in Schritt 1.11. </li></ol> 2. Ethanol-Resistenztest <ol><li> Wachsen Biofilme wie in den Schritten 1,1-1,7 und 1,12-1,14 beschrieben. </li><li> Nach 68 h Wachstum bei 30 ° C, schneiden die Biofilm-Kolonien in zwei gleiche Teile mit Hilfe einer Rasierklinge und der Schablone. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> Abbildung 2. Beispiel experimentelle Design der Beständigkeit von Biofilm Kolonie Zellen zu Sterilisationsmitteln. (A) Vorlage zur Beurteilung für die gleichmäßige Verteilung der Biofilm Kolonien in einer Petrischale verwendet und zum Schneiden. (B)Top-down-Bilder von unbehandelten Wildtyp-Biofilm für 68 Stunden auf einer soliden, definiert Biofilm-induzierenden MSgg Medium bei 30 ° C gezüchtet. Die Erweiterung zeigt, wie ein Biofilm Kolonie kann in zwei gleiche Hälften geschnitten werden. (C) Die zwei gleiche Hälften Biofilm gleich behandelt (Kontrolle, PBS) oder mit entweder PBS oder Sterilisationsmittel und wie beschrieben verarbeitet. Maßstabsbalken:. 1 cm <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> Heben Sie jede Hälfte des Biofilms Kolonie von der Agarplatte mit einem kleinen Spachtel und es in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 500 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bewegen. Falls erforderlich, kratzen die verbleibenden Zellen von der Platte und übertragen sie auch auf das Reaktionsgefäß. HINWEIS: Die zweite Hälfte des Biofilms Kolonie unterschiedlich behandelt wird, je nachdem, ob es die Steuerung oder den Widerstand gegen Steri zu testenlizing Mittel. </li><li> Für die Steuerung, wie in Schritt 2.3 die zweite Hälfte des Biofilms Kolonie in 500 &amp; mgr; l PBS inkubiert. Zur Beurteilung der Beständigkeit gegen Sterilantien, übertragen die zweite Hälfte des Biofilms Kolonie zu 500 ul 50% (v / v) Ethanol. HINWEIS: Alternative Mittel wie Natriumhypochlorit Sterilisieren verwendet werden. Für alle Sterilisationsmittel verwendet werden, die aktive Konzentration und Inkubationszeit in einem Vorversuch bestimmen. </li><li> Inkubieren der Biofilm-Kolonien für 10 min auf der Tisch bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren Sie die Biofilm Kolonien für 5 min bei 18.000 xg und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. In 300 ul PBS. </li><li> Beschallen die Zellen leicht (Amplitude 10%, Puls 5 sec) mit der Mikrospitze eines Beschallungsgerät. HINWEIS: Die Beschallungsenergie auf separaten Biofilm Aggregate ausreichend sein. Aber auch harte Beschallung kann die Zellen lysieren. Bestätigen Sie im Voraus durch Lichtmikroskopie, dass die Beschallungsenergieverwendet, um die Zellen nicht lysieren, und dass alle Aggregate gelöst sind. </li><li> Hinzufügen, 700 &amp; mgr; l PBS zu einem Endvolumen von 1 ml. Führen Sie eine serielle Verdünnung (bis 10 -7) in PBS und verteilt 100 ul 3 Verdünnungen auf einem LB-1,5% Agar - Platte unter Verwendung von sterilen Glasperlen. HINWEIS: Die optimalen Verdünnungen plattiert werden sollten in einem Vorversuch bestimmt werden, wie dies hängt von der Menge von Zellen im Biofilm Kolonie von Interesse und die Überlebensrate der Zellen in Reaktion auf das Sterilisationsmittel. </li><li> Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 30 ° C, die CFU zählen und KBE / ml zu bestimmen. Von der letzten KBE / ml jeweils die Hälfte Biofilm Kolonien, berechnen den Prozentsatz der Überlebenden. HINWEIS: Bei durchgeführt und analysiert, wie beschrieben, die beiden Hälften des Steuer Biofilm Kolonie und der unbehandelte im Vergleich zu mit Ethanol behandelten Hälfte der unbehandelten Biofilm Kolonie sollten Unterschiede von unter 10% in Lebendzellanzahl ergeben, die Symmetrie oder den Widerstand der Kolonie Verifizieren , welche nach Süctively. Alternativ können die Ergebnisse insgesamt CFU dargestellt werden. Die Zellzahlen der Kontrolle und unbehandeltem Biofilm Kolonie sollte in der gleichen Größenordnung bleiben. Im Gegensatz dazu sind die Zellzahlen der mit Ethanol behandelten Hälfte eines kleinen Moleküls behandelten Biofilms Kolonie erwartet um mindestens zwei Größenordnungen fallen für eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Sterilisationsmittel zu beanspruchen. </li></ol> 3. Biofilm Colony Probenvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie <ol><li> Biofilm wachsen Kolonien wie in den Schritten 1,1-1,7 und 1,12 bis 1,14 beschrieben. </li><li> Eine frische Charge von 2% (v / v) Glutaraldehyd, 3% (v / v) Paraformaldehyd-Lösung in 100 mM Natriumcacodylat, 5 mM Calciumchlorid-Puffer, pH 7,3. Bereiten Sie 5 ml Fixiermittel für jede Petrischale von 8,5 cm Durchmesser. ACHTUNG: Glutaraldehyd und Paraformaldehyd sind gefährlich. Behandeln Sie sie mit Sicherheitsausrüstung innerhalb einer chemischen Haube. Entsorgen Sie die Lösungen und die kontaminierten Materialien zur hazardous Abfälle. </li><li> Vorsichtig die Fixiermittel zu den Biofilm Kolonien, ohne direkt auf der Biofilme zu verzichten. HINWEIS: Aufgrund des hydrophoben Charakters des Biofilms Kolonie, langsam die Kolonien aus dem Agar zu lösen und zu schweben beginnen. </li><li> Dichtung sorgfältig die Platten mit einem Streifen Parafilm. Inkubieren auf einem Rotationsschüttler für 2 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend die Platten auf 4ºC übertragen über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem mit einer Vakuumpumpe verbunden Glaspipette Pasteur. </li><li> Vorsichtig 10 ml 100 mM hinzufügen Natriumcacodylat, 5 mM Calciumchlorid-Puffer des Biofilms und Inkubation für 5 min zu waschen. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit dem Pasteur Glaspipette aus der Ecke der Platte durch vorsichtiges Pipettieren Beschädigung des Biofilms und fügen Sie frische Waschlösung zu vermeiden. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. </li><li> Für die Entwässerung der Biofilm Kolonien, gehen Sie mit den folgenden Schritten: 2x 5 min in ddH 2 O; 2x 20 min in 30% Ethanol; 2x 20 min in 50% Ethanol; 2x 20 min in 70% Ethanol; 2x 20 min in 96% Ethanol; 2x 30 min in 100% -igem Ethanol. <ol><li> 15 ml Flüssigkeit für jede Petrischale von 8,5 cm Durchmesser in jedem Schritt und entfernen Sie die Flüssigkeit sorgfältig nach jeder Inkubation. </li></ol></li><li> Verwenden eines von zwei unterschiedlichen Verfahren zum Trocknen der Proben aus Ethanol. <ol><li> Für Lufttrocknung von Ethanol: <ol><li> Schneiden Sie ein Zellulosefilterpapier (Durchmesser von 9 cm) in den Quartalen. Kurz ein Viertel in 100% Ethanol versenken und dann auf sie sorgfältig zu übertragen, eine Floating-Biofilm-Kolonie. Setzen Sie den nassen Filterpapier in einer Petrischale mit einem Filterpapier ausgekleidet. Decken Sie die Petrischale und lassen Sie den Biofilm Kolonien über Nacht trocknen in einer chemischen Haube. </li></ol></li><li> Zum kritischen Punkt (CP) -TROCKENTUNNEL Kohlendioxid (CO 2) als Übergangsflüssigkeit unter Verwendung: <ol><li> Füllen Sie 75% des kritischen Punktes Trockenmaschine Kammer mit 100% Ethanol. Übertragen Sie die Proben in einen Halter, um jede Probe in die eigene chamber. Wenn nötig, schneiden Sie den Biofilm mit einer Schere in kleinere Stücke. Lassen Sie die Unterwasserproben in Ethanol während der gesamten Behandlung. Dann übertragen Sie den Halter in die Kammer und die Kammer fest schließen. </li><li> Kühlen der Kammer auf 7 ° C und Rühren beginnen. Füllen Sie die Kammer vollständig mit flüssigem CO 2. Während einer 7 min Inkubationszeit, lassen die Ethanolmischung mit dem CO 2. Dann entlädt 25% der Lösung. HINWEIS: Die Kammer unter dem Niveau der Probe nicht leer. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.8.2.2 viermal. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.8.2.2 fünfmal mit einer Inkubationszeit von 5 min nur. Schließlich sollte das Ethanol vollständig durch CO 2 ersetzt werden. </li><li> Während der letzten Runde leer nur 5% der Kammer. Drehen Sie das Rühren und die Kühlung ab. Starten Sie die Kammer auf 42 ° C erhitzt wird. Bei einer Temperatur von 31,1 ° C und einem Druck von 73,9 bar, die Flüssigkeit CO 2 erreicht seinen kritischen Punkt, den Zustand , in dem der gasförmige phase hat die gleiche Dichte wie die Flüssigphase des Lösungsmittels 27. Sobald die Temperatur 42 ° C erreicht, für 10 min inkubieren. Bei 42 ° C besteht das CO 2 in der Kammer als überkritisches Gas. HINWEIS: Ständig den Druck der Kammer überprüfen. Der Druck sollte nicht mehr als 120 bar bei 42 ° C. </li><li> Beginnen Sie langsam das Gas freizusetzen mit kontinuierlichen Erwärmung. Dies hält die Proben in der CO 2 -Gas - Phase und verhindert die Verformung der Probenmorphologie durch die Flüssigkeitsoberflächenspannung. Stellen Sie den Durchflussmesser bis 5 l / h durch eine Feinabstimmung das Dosierventil steuert das Messgerät. Warten, bis der gesamte Druck in der Kammer freigesetzt wird. Jetzt die Kammer geöffnet und die Proben vorsichtig aus der Halterung entfernen. </li></ol></li></ol></li><li> Mantel ein Elektronenmikroskopie Stummel mit Kohlenstoffband. Mit Hilfe einer Pinzette, übertragen sorgfältig die Biofilm Kolonien auf den Stummel. Schließen Sie jede Kolonie mit dem Stummel durch eine dünne Brücke aus dem Auto Hinzufügenbon Band, die zur Ladungsableitung unter dem Elektronenstrahl von entscheidender Bedeutung ist. In diesem Stadium behandeln die Biofilm Kolonien mit Vorsicht, da sie sehr zerbrechlich sind. Speichern der Proben in einem Exsikkator für mindestens 24 h oder bis zur Untersuchung. </li><li> Am Tag der Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop, Sputter-Beschichtung der Biofilm-Kolonien für 2 min in einem Winkel von 60º in einer Gold-Palladium-Sputter-Beschichtungsvorrichtung. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und drehen Sie die Proben von 120 ° dazwischen. Am Ende, Sputter-coat die Proben einmal für 3 min von oben. Die 20 nm dünnen Schicht Gold-Palladium verbessert die Leitfähigkeit und erhöht den Kontrast der Probe für die Bildgebung in der SEM. </li><li> Speichern der Proben in einem Exsikkator 28 die Rehydratisierung der Probe zu vermeiden , bis die Abbildung mit einem Rasterelektronenmikroskop 29,30. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bacillus subtilis Formen robust und stark strukturierte Biofilmen sowohl in flüssiger (Häutchen) und auf festem Medium (Kolonien). Daher dient sie als ideale Modellorganismus der Wirkungsweise von spezifischen Inhibitoren Biofilm zu charakterisieren. Auf festen Medien bilden Zellen mehrzelliger Strukturen mit charakteristischen Eigenschaften, die nicht offensichtlich in Häutchen sind, wie Falten von der Mitte zum Rand hin ausstrahlen. So sind Häutchen und Kolonien ergänzende Systeme zu studieren B. subtilis Vielzelligkeit. Das Ziel dieser Studie ist es, eine B zu entwickeln subtilis Modellsystem für die Biofilm (Häutchen und Kolonien) Hemmung. Mehrere Schritte sind für die Reproduzierbarkeit des Biofilms Störung Aufsatz kritisch. Ein erster wichtiger Schritt ist, um zu bestätigen, dass die Wirkung auf die Biofilmbildung ist nicht auf einer allgemeinen Toxizität für Bakterien in der planktonischen Lebensstil gewachsen. Dies kann durch den Vergleich der Wirkung von einer bestimmten Konzentration betrachtet werden alsMall-Molekül-Hemmstoff auf die relative Biofilm Hemmung der Wirkung dieses Moleküls auf Planktonwachstum. Eine dramatisch stärkere Wirkung auf Biofilmentwicklung kann die Identifizierung von Zielmechanismen stellen sicher, dass für die Entwicklung von Biofilmen besonders wichtig sind. Ferner zeigt die hier beschriebene Untersuchung der Bedeutung der Vorkultur Bedingungen für die Entwicklung von Häutchen und ihre Empfindlichkeit gegenüber kleinen Molekülen. Bevor die Wirkung von kleinen Molekülen Charakterisieren, reproduzierbare und robuste Versuchsbedingungen (beispielsweise Häutchen Wachstumstemperatur und der Mangel an Empfindlichkeit gegenüber der Medienzusammensetzung) , um ihre Wirkungen zu testen , sollte festgelegt werden. Um solche Zustände können die Medien der Vorkultur Zustand Wachstumsphase der Vorkultur, pre-Nährmedien Entfernung, Wachstumstemperatur und Wachstumsmedien sollte berücksichtigt werden, finden. Eine große Herausforderung, wenn ein spezifischer Inhibitor für die Biofilmbildung gefunden wird, ist quantitativ zu findenund qualitative Verfahren, welche die Wirkung dieser kleinen Molekül-Inhibitoren auf die Biofilmentwicklung und Widerstands charakterisieren. Hier sind zwei wichtige Methoden sind im Detail beschrieben, die verwendet werden können, um die Auswirkungen solcher Inhibitoren zu bewerten. Zuerst stellen wir eine einfache quantitative Methode, die reproduzierbar die Beständigkeit der behandelten gegenüber unbehandelten Kolonie Biofilme Bakterizide, wie Ethanol Sonde kann. Repräsentative Ergebnisse sind für die Empfindlichkeit von D-Leucin-behandelten Biofilms Kolonien auf 50% -igem Ethanol dargestellt. Allerdings kann dieser Aufsatz leicht durch die Verwendung unterschiedlicher Sterilisierungsmitteln oder Antibiotika modifiziert werden. Zweitens ist eine SEM-Verfahren im Detail beschrieben, die hochauflösende Untersuchung der Veränderungen in der Biofilm-Kolonie durch den kleinen Molekül-Hemmstoff in mehreren komplementierenden Spiegel verursacht ermöglicht: die Gesamtstruktur, die Organisation und die Abundanz der EPS-Matrix und ihre Bestandteile, und die Einzelzell-Morphologien im gesamten Biofilm. Wir stellen fest, dass zwei Methoden der dehydration (lufttrocknende von 100% Ethanol oder CP-Trocknung Kohlendioxid als Übergangsflüssigkeit verwendet wird) kann ebenso während der SEM Probenvorbereitung eines Biofilms Kolonie verwendet werden. Wichtig setzt die erfolgreiche Fixierung der Biofilmprobe stark von der Hydrophobizität des Biofilms Kolonie. Diese Hydrophobizität ist ein charakteristisches Merkmal von B. subtilis Biofilmen aufgrund der hydrophoben Oberflächenschicht 10,34. Verschiedene Ansätze wurden bisher zu untersuchen Biofilm Montage und Entwicklung mit B verwendet subtilis als Modellorganismus 35. Eine Reihe von unabhängigen Studien zeigten die Auswirkungen der Medienzusammensetzung auf Biofilmentwicklung 36-38. Bisher jedoch eine systematische Bewertung der Auswirkungen der Medienzusammensetzung auf Biofilm Hemmung war nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen fehlt. Diese Studie zeigt , dass , während die Hemmung der Pellicle B. subtilis durch kleine Moleküle empfindlich Bedingungen Kultur vor, es ist unaffected durch die Wirkungen von Temperatur und Medienzusammensetzung und somit nützlich für die systematische Bildschirme von kleinen Molekül-Inhibitoren. Außerdem haben wir eine einfache, reproduzierbare und quantitative Verfahren den Widerstand der unbehandelten oder niedermolekularer Inhibitor behandelten Biofilms Kolonien antibakterielle Mittel zu beurteilen, die derzeit in den Organismus B. Biofilm Modell fehlt subtilis. B. subtilis Biofilme in Kombination mit fluoreszierenden Reportern kann weiter entnommen werden , für kleine Moleküle als Inhibitoren zu suchen , die entweder einen speziellen Entwicklungsschritt der Biofilmbildung oder eine bestimmte Subpopulation von Zellen innerhalb des Biofilms Ziel. Die hier beschriebenen Methoden bieten keine einzelne Zelle Auflösung in Bezug auf die Genexpression innerhalb des Biofilms. Methoden für die EPS - Matrix - Gen - Expressionsanalyse innerhalb B. subtilis Biofilme auf Einzelzellebene wurden erfolgreich 39 etabliert. Bakterielle Biofilme sind Cruciasl Bedeutung in Landwirtschaft, Industrie und klinischen Umgebungen. In einem landwirtschaftlichen Kontext erhöht die Kapazität Biofilme zu bilden , die Pflanzenwirts Kolonisierung zahlreicher Pflanzenpathogene 40 und in einem klinischen Kontext sind Biofilme inhärent resistent gegenüber antimikrobiellen Mitteln 21 und stehen im Mittelpunkt vieler persistent und chronischen bakteriellen Infektionen. Darüber hinaus ist es jetzt anerkannt , dass Biofilme haben große Auswirkungen auf die Kosten für die Industrie , da sie extrem schwierig zu entfernen und 41 steuern. Somit liefert ein experimentelles Rahmen für die Untersuchung der mikrobiellen Biofilm - Inhibitoren zu entwickeln bedeutende landwirtschaftliche 42,43, 21,44 klinischen und technologischen Fortschritten 45-47. Die aktuellen Verfahren sind beschränkt B. subtilis. Wir empfehlen nach den beschriebenen quantitativen und qualitativen Konzepte als auch Biofilm-spezifischen niedermolekularen Inhibitoren in anderen Spezies zu studieren. In Ergänzung<html> Diese Studie auf ein spezifisches Beispiel für die Biofilm - Hemmung durch D-Leucin bezieht, aus mehreren spezifischen Biofilm - Inhibitoren bisher 17 veröffentlicht. Wichtig ist , dass D-Leucin bereits als Anti-Biofilm - Molekül in der Pflanzenkrankheitserreger Xanthomonas citri 48, präsentiert möglich Ähnlichkeiten zwischen Pflanzens Kolonisierung und Biofilmbildung gekennzeichnet. Biofilmbildung (Häutchen und runzelig Koloniebildung) ist auch üblich , in menschliche Krankheitserreger (zB Pseudomonas aeruginosa 49-51 und uropathogene Escherichia coli 52,53). Die beschriebenen Verfahren können ferner für bestimmte Medikamente zu suchen, entwickelt werden, die die Biofilmbildung hemmen und Biofilm-vermittelte Resistenz gegen antimikrobielle Mittel in der klinischen Forschung zu reduzieren. Insgesamt sind die hier beschriebenen Verfahren können als Grundlage verwendet werden quantitative und qualitative Konzepte zu entwickeln Biofilm-spezifischen niedermolekularen Inhibitoren bei anderen Spezies als auch zu studieren. nt &quot;&gt; Zusammenfassend stellen wir ein einfaches und nützliches Werkzeug-Box , die die möglichen Stärken und Tücken bei der Verwendung von B. subtilis zeigt Biofilm - Inhibitoren zu untersuchen.

Mehrzelligen Bakteriengemeinschaften spielen eine bedeutende Rolle in natürlichen und anthropogenen Umgebungen und kann vorteilhaft oder sehr schädlich sein. Diese mehrzelligen Kolonien werden als Biofilm bekannt ist, wobei die einzelnen Zellen in einer selbst hergestellten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) Matrix eingebettet sind. Die EPS haften stark die Zellen an der Oberfläche sie besiedeln. Sie dienen als Schutzschild gegen mechanische und chemische Kräfte und schaffen einen engen Kontakt zwischen benachbarten Zellen, die Erleichterung zellulären Kommunikation 1. Ein Biofilm kann als differenzierte Gemeinschaft betrachtet werden, in denen Zellen stark regulierten verwenden, Prozesse orchestriert ihre Aktivitäten innerhalb der Gemeinschaft zu koordinieren, sowie über Artgrenzen 2-5. Der Übergang von einer planktonischen, wird freilebenden Modus des Wachstums eines Biofilms Zustand oft mit Entwicklungsprozessen verbunden. Ein gutes Beispiel ist die Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis, und daher ein undomesticated Stamm dient als robuster Organismus Modell die Entwicklungsstadien, die zu Biofilmbildung zu untersuchen. In diesem Bakterium, sich in auffälliger vielzelligen Strukturen bewegliche Zellen organisieren , die spezielle Aufgaben 4 auszuführen. Eine Gruppe von Zellen, die matrix-Erzeuger sekretieren Exopolysaccharide 6, das Amyloid - Protein tasa 7,8, und die Oberfläche Hydrophobizität Protein BSLA 9,10; von denen alle mit bei der Montage der EPS 11-13. Angesichts der Fülle von Biofilmen in natürlichen und anthropogenen Nischen und die vermeintliche tödlichen Schaden, den sie verursachen können, gibt es eine dringende Notwendigkeit, Wege zu finden, ihre Bildung zu verhindern. Kleine Molekül-Inhibitoren können in der Entdeckung neuer Regulationswege unterstützen, Enzyme und Struktur der Biofilmbildung beteiligten Proteine ​​und damit fördern Einblicke in die komplexen Prozesse der vielzelligen Gemeindeversammlung. Als B. subtilis ist ein gut untersuchtes Modell für BioFilmbildung 14,15, kann es verwendet werden , um die Wirkungen verschiedener Biofilm Inhibitoren zu bewerten. Diese Studie befasst sich vier grundlegende Methoden, die für die Bewertung der Reaktion von Biofilmen zu kleinen Molekül-Inhibitoren sind der Schlüssel. Erstens, um sicherzustellen, dass diese Inhibitoren haben einen Biofilm-spezifischen Ziel, die Trennung der planktonischen Wirkung auf das Wachstum von der Wirkung auf die Bildung von Biofilmen ist kritisch. Die meisten antibakterielle Mittel Zielzellen in ihre planktonischen Wachstumsphase, sondern Moleküle, die die Biofilm Lebensstil Ziel sind selten. Zusätzlich kann , wie Moleküle , die nicht toxisch nicht planktonischen Wachstum beeinflussen, können sie den Selektionsdruck begünstigt antibiotische resistente Mutanten 16 reduzieren. Wenn zum Beispiel Biofilme mit D-Aminosäuren oder bestimmten anderen Zellwand-störenden Molekülen behandelt werden, werden sie entweder gestört oder zerlegt werden , aber diese Inhibitoren leicht nur planktonischen Wachstums 12,17 beeinflussen. Im Gegensatz dazu beeinträchtigen viele Antibiotika dramatisch Planktonwachstum, mit lenig oder keine Wirkung auf die Bildung von Biofilmen 17. Zweitens, eine konsistente und robuste experimentellen Rahmen zur Gründung der Wirkung der kleinen Moleküle zu untersuchen ist von entscheidender Bedeutung. Wir haben beobachtet, dass die aktive Konzentrationsbereich von kleinen Molekül-Inhibitoren war empfindlich auf die Vorkultur Bedingungen und zu den experimentellen Aufbau die Wirkung dieser kleinen Molekül-Inhibitoren zu untersuchen verwendet. Verschiedene Berichte, insbesondere solche B. das Studium subtilis zeigten Variationen in dem Konzentrationsbereich , bei der D-Aminosäuren , die Bildung von Häutchen hemmen - die schwimmenden bakteriellen Biofilmen 12,17-19. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin , dass die folgenden Faktoren für Unterschiede in der aktiven Konzentrationsbereich ausmachen: Die Vorkultur Bedingungen (logarithmische 12,17 im Vergleich zu späten stationären Wachstumsphase 20), das Wachstumsmedium in der Vorkultur Zustand verwendet (reich, undefined [Luria Broth, LB] gegen definiert [Natriumglutamatglycerin, MSgg]), das Verhältnis der Inokulation und insbesondere die Entfernung des Vorkulturmediums vor der Inokulation. Die Temperatur des statischen Pellicle Wachstum zeigten eine weniger wichtige Rolle bei der Aktivitätsbereich des kleinen Molekül-Hemmstoff D-Leucin, einer repräsentativen D-Aminosäure in dieser Studie verwendet. Schließlich, nachdem die Biofilme mit spezifischen Biofilm-Inhibitoren behandelt, robust und informative Verfahren erforderlich sind, um die Auswirkungen dieser Inhibitoren auf Biofilm Fitness zu charakterisieren. Hier sind zwei Methoden, unabhängig die Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren kennzeichnen, sind im einzelnen beschrieben: (1) Die Wirkung auf die einzelnen Zellen innerhalb eines Biofilms Kolonie und ihre Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Die Zellen in Biofilmen sind in der Regel resistent gegen Antibiotika im Vergleich zu den Bakterien freilebenden 21-23. Während dieses Phänomen multifaktoriell ist, wurde die Fähigkeit der EPS - Antibiotikum Penetration zu reduzieren oft als attraktiver Erklärung 24 betrachtet </sup&gt;. Diese Methode bewertet das Überleben der vorher festgelegten Biofilm-Zellen nach der Exposition gegenüber antibakterielle Substanzen. (2) Die Wirkung auf die Biofilm-Kolonie-Architektur von der großen zur kleinen Maßstab. Biofilm-Kolonien werden durch ihre dreidimensionale Struktur und die Anwesenheit der EPS gekennzeichnet. Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie, Veränderungen in der Zellmorphologie, Biofilm Koloniestruktur und die Architektur und die Abundanz der EPS kann aus der großen (mm) sichtbar gemacht werden, um die kleinen Maßstab (um).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="897">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Luria Broth, Lennox</td>
			<td style="width:305px;">Difco</td>
			<td style="width:127px;">240230</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Merck, 203.30 g/mol&#160;</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride anhydrous</td>
			<td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td>
			<td>1311-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma, 197.91 g/mol</td>
			<td>31422-250G-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iron(III) chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 270.30 g/mo)</td>
			<td>F2877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zinc chloride anhydrous&#160;</td>
			<td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td>
			<td>424592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma, 337.27 g/mol</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tryptophan</td>
			<td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td>
			<td>BP395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma, 165.19 g/mol</td>
			<td>P5482-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Sigma, 119.12 g/mol</td>
			<td>T8625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol anhydrous</td>
			<td>Bio-Lab Itd</td>
			<td>712022300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamic acid monosodium salts hydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>G1626-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-leucine</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>855448-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol anhydrous</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">razor blade</td>
			<td>Eddison</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">circular cellulose filter papers</td>
			<td>Whatman, 90 mm</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutaraldehyde</td>
			<td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>EMS, 16% in water</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium cacodylate</td>
			<td>Merck, 214.05 g/mol&#160;</td>
			<td>8.2067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride 2-hydrate</td>
			<td>Merck, 147.02 g/mol&#160;</td>
			<td>1172113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stub-aluminium mount</td>
			<td>EMS, sloted head</td>
			<td>75230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">carbon adhesive tape</td>
			<td>EMS</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker 37&#176;C</td>
			<td>New Brunswick Scientific Innowa42</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:301px;">Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td>
			<td>Branson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 30 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 23 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter System, 500 ml, polystyrene</td>
			<td>Cornig Incorporated</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S150 Sputter Coater&#160;</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPD 030 Critical Point Dryer</td>
			<td>BAL-TEC</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Environmental Scanning Electron Microscope</td>
			<td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Das Häutchen - Test ist eine Methode , die stark reguliert und dynamische Prozesse von B. zu studieren subtilis Vielzelligkeit. Außerdem wird der Pellicle-Assay eine Reihe von entweder pre-starter Bedingungen oder kleine Molekülkonzentrationen in einer einzigen Zellkultur Multidish Platte in einem Experiment zum Testen geeignet. Jedoch B. subtilis Pellikelbildung ist empfindlich für die Vorkultur Bedingungen (zB Wachstumsmedium der Vorkultur und der Wachstumsphase), der Inokulation Verhältnis und die Entfernung des Vorkulturmediums. Wir daher zunächst für einen Versuchsaufbau gescreent, die uns Häutchen Hemmung durch D-Leucin zu reproduzieren erlaubt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass reproduzierbare Pellicle Hemmung durch D-Leucin erhalten werden kann, wenn die Zellen in undefinierten, reich LB Medium bis zu einer mittleren logarithmischen Wachstumsphase (Einzelkolonie in 3 ml LB bei 37 ° C für 4 Stunden vorkultiviert werden unter Schütteln ), zentrifugiert und in definierten MSgg Medium resuspendierten vor einer 1: 1000 inoculatIon (3A). Wenn die Zellen in MSgg Medium zu der mittleren logarithmischen Wachstumsphase (einzelne Kolonie in 1 ml LB für 2 h gezüchtet, erneut verdünnt 1: 100 bis 3 ml MSgg und bei 200 5 h bei 37 ° C unter Schütteln gezüchtet rpm), Entfernung des Vorkulturmediums hatte keine Wirkung auf die D-Leucin-Aktivität aufweisen. Zellen der stationären Wachstumsphase (einzelne Kolonie in 1 ml LB für 2 h erneut verdünnt 1: 100 bis 3 ml MSgg und gezüchtet für bis zu 20 Stunden in einer Walze bei Raumtemperatur) aufgewachsen vor und gewaschen in MSgg Medium zu Impfung waren weniger empfindlich. Jedoch könnte diese Erhöhung des Widerstands gegenüber der Pellicle Hemmwirkung von D-Leucin auf die höhere Zelldichte der Vorkultur zurückzuführen sein, die Erhöhung der Beimpfung Verhältnis. Die Beimpfung Verhältnis der Vorkultur zu dem statischen Wachstum in MSgg Medium, dh, 1: 500 oder 1: 1000, beeinflusst der Aktivitätsbereich von D-Leucin und die Zeit der Entwicklung Pellikel (3B). Pellicle-Hemmung durch D-Leucin aufgetretenbei verschiedenen Wachstumstemperaturen (23 ° C und 30 ° C, 3C). Wichtig ist, während die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber D-Leucin auf die Vorkultur Bedingungen abhängt, zeigt die Reproduzierbarkeit der Phänomene bei verschiedenen Temperaturen, die Pellicle-Hemmung durch das kleine Molekül D-Leucin robuste Eigenschaften hat. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig3.jpg" /> . Figur 3. Beispiel Ergebnisse , die die Wirkungen verschiedener Vorkultur Bedingungen auf Pellicle Hemmung durch D-Leucin zeigen mehrere Parameter wurden bewertet werden eine robuste Versuchsaufbau zu erhalten, einschließlich: (A) Entfernen von Verunreinigungen aus der Vorkultur Wachstums Medium, Wachstumsmedium der Vorkultur (rich undefinierte LB Medium oder definiert Biofilm-induzierenden MSgg Medium) (nicht gegen gewaschen gewaschen) und Wachstumszustand der Vorkultur (logarithmisch gegen stationäre Wachstumsphase), (B) Beimpfung Verhältnis (1: 1.000 gegenüber 1: 500) der Vorkultur in die endgültige Pellicle Wachstumsmedium, und (C) Wachstumstemperatur (23 ° C gegenüber 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610 - Zellen wurden im Medium angegeben (LB oder MSgg) für 4 h bei 37 ° C oder bei Raumtemperatur über Nacht (o / n) unter Schütteln und Vorkulturmedium wurde durch MSgg ersetzt gezüchtet wenn angegeben (gewaschen oder nicht-gewaschen). Schließlich wurde die Starterkultur beimpft 1: 1,000, wenn nicht anders angegeben und Häutchen wurden drei Tage lang unter statischen Bedingungen bei 23 ° C gezüchtet. Top-down-Aufnahmen wurden mit einer Kamera aufgenommen. Nun Durchmesser beträgt 22 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Nach der Identifizierung der Vorkultur Bedingungen und einem Versuchsaufbau, die für eine reproduzierbare Aktivitätsbereich von D erlaubt-Leucin auf Pellikelbildung (Vorkultur in LB zu einer mittleren logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet, in MSgg gewaschen, verdünnt 1: 1000 und für drei Tage bei 23 ° C gezüchtet) wurde die Wirkung für seine Robustheit getestet. Zu diesem Zweck wurde die Aktivität von D-Leucin auf Pellikelbildung in verschiedenen modifizierten MSgg Medien (4) bewertet. Der Aktivitätsbereich von D-Leucin in Pellicle Hemmung war konsistent in den fünf getesteten Medien, und zeigt, dass die Wirkung von D-Leucin auf Pellikelbildung robust ist. Ein ähnlicher Trend wurde mit D-Tyrosin beobachtet, wo Pellicle Hemmung im Konzentrationsbereich von bis zu 2 &amp; mgr; M in mehreren modifizierten MSgg Medien (geringere Eisenkonzentration und der Ersatz der Stickstoffquelle mit Ammoniumchlorid oder die Kohlenstoffquelle nicht mit Glukose, Daten übereinstimmte gezeigt). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Empfindlichkeit gegenüber D-Leucin tritt inverschiedene Wachstumsmedien. Es zeigen Top-down - Fotografien von B. subtilis NCIB 3610 Häutchen, bei 23 ° C unter statischen Bedingungen gezüchtet in definierten, Biofilm-induzierenden MSgg Medium oder in verschiedenen modifizierten MSgg Medien (Kohlenstoffquelle 0,5% Glucose, Stickstoffquelle , 0,5% (NH 4) 2 SO 4; hohe Eisen 250 uM FeCl 3; niedrige Glycerin 0,125% Glycerin) für drei Tage, mit Ausnahme der alternative Stickstoffquelle Medium (wo die Häutchen für fünf Tage gezüchtet wurden) , entweder ohne oder mit D-Leucin in den angegebenen Konzentrationen. Starterkulturen wurden bei 37 ° C für 4 Stunden gezüchtet mit in undefined, reich LB-Medium schütteln. Vor der Beimpfung wurden die Zellen durch Zentrifugation gewaschen und in dem entsprechenden Pellicle Wachstumsmedium resuspendiert. Die Starterkultur verdünnt 1: 1000, die gut Durchmesser 22 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </a&gt; Eine alternative Methode zu untersuchen B. subtilis Vielzelligkeit ist der Biofilm - Kolonie - Assay auf festem MSgg Medium. Wie Häutchen, ermöglicht dieser Test die Untersuchung von Raum-Zeit-Prozesse. Sobald der aktive Bereich kleiner Molekülinhibitoren in dem Pellicle-System bestimmt wird, deren Wirkung auf Biofilm Koloniebildung untersucht werden. In dieser Studie wurden Biofilm-Kolonien verwendet, um die Wirkung von D-Leucin auf den Widerstand von Biofilm-Kolonien zu sterilisierenden Mitteln zu beurteilen, weil Biofilm Kolonien weniger zerbrechlich sind und auf dem festen Hintergrund, sie leichter zu manipulieren. Wenn behandelten Biofilms Kolonien mit D-Leucin für 10 min auf 50% Ethanol ausgesetzt werden, fällt der Anteil der überlebenden Zellen mit der unbehandelten Fraktion dramatisch im Vergleich (Bild 5). Dieses Verfahren kann weiter entwickelt werden, um die Auswirkungen von anderen kleinen Molekül-Inhibitoren und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber bakterizide Mittel zur Beurteilung (sterilllen Mittel oder Antibiotika). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiel Ergebnisse von unbehandelten oder behandelten Biofilm Kolonie Widerstand gegen ein Sterilisationsmittel. Biofilm Kolonien von B. subtilis NCIB 3610 wurden bei 30 ° C für 68 Stunden auf festem, definiertem Medium gezüchtet, mit oder ohne 0,5 mM D-Leucin. Nach dem Schneiden wurde die Kolonien in zwei gleiche Hälften, eine Hälfte mit PBS (interne Kontrolle) und die andere Hälfte mit 50% Ethanol oder PBS (Kontrolle) behandelt. Nach dem milden Beschallung, serielle Verdünnung, Beschichtungs- und Zählung der koloniebildenden Einheiten wurde der Prozentsatz der Überlebenden im Vergleich zu der internen Kontrolle berechnet. Dargestellt sind die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten mit den Mittelwerten von zwei (A) oder drei (B, C) repliziert und deren Standardabweichungen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier t</a>o eine größere Version dieser Figur sehen. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug , das verwendet werden kann , auf die räumliche Architektur des Biofilms Kolonie Falten zu konzentrieren, die Fülle und der Lokalisierung der EPS und Einzelzellmorphologie 31. REM-Aufnahmen erfordert Proben, die unter Hochvakuum abgebildet werden kann. Proben unter Hochvakuumbedingungen zu untersuchen, alle bulk Wassermoleküle entfernt werden, und deshalb SEM-Bildgebung erfordert die Dehydratisierung der Probe vor der Bildgebung. Alternativ können Proben unter niedrigen Vakuumbedingungen im nassen Modus durch Umgebungsrasterelektronenmikroskopie (ESEM) abgebildet werden, wobei die hydratisierte Probe sanft in dem Mikroskopkammer getrocknet wird. Um die Auswirkungen von kleinen Molekül-Inhibitoren auf die Biofilm-Kolonie-Architektur, die EPS-Organisation und Zellmorphologie, drei verschiedene Arten von Proben Dehydratation bewerten wurden verglichen: Trocknen im Mikroskop unter nassen mode Bedingungen (ESEM), luftgetrocknet aus einem Lösungsmittel oder kritischen Punkt (CP) -dried Kohlendioxid als Übergangsflüssigkeit. In unbehandelten und D-Leucin-behandelten B. subtilis Biofilm - Kolonien unterschiedlich Hydratisierung Stufen nach dem Verfahren verwendet werden konnte beobachtet. Imaging unter niedrigen Vakuumbedingungen im nassen Modus durch ESEM erhalten die sehr natürlichen Zustand des Biofilms Kolonie. Jedoch Informationen über Einzelzellmorphologie und EPS Fülle und Architektur war knapp, da die EPS noch vollständig hydratisiert waren und die Zellen wurden in den EPS eingebettet (Daten nicht gezeigt). Im Hinblick auf die Entwässerung wurde CP-Trocknung der strengsten Verfahren. Es entfernt die meisten strukturell gebundenem und bulk Wassermoleküle aus dem Gewebe, für einen Volumenverlust von 30-70% entfallen, abhängig von dem Gewebe 32. Im Gegensatz dazu erhalten Lufttrocknen der gebundenen Wassermoleküle. Ein embryonales Gewebe beispielsweise verloren 18% ihres Volumens nach dem Trocknen an der Luft aus dem flüchtigen Lösungsmittel um Ethanol und 59% nach der CP-Trocknungs 32 </sup&gt;. Da die EPS Wasser und sind sehr hydratisierte binden, empfehlen bedenkt, dass wir den vollständigen Verlust von Wasser in der CP-getrocknet Methode. Wenn die Proben dieser Studie wurden in Ethanol und luftgetrocknet dehydratisiert wurde die dreidimensionale Struktur des Biofilms Kolonie erhalten, einzelne Zellen erschienen, und die EPS wurden abgeflacht, aber sie noch verbunden und bedeckt die Einzelzellen (6A) . Biofilm Kolonien , die mit Ethanol und dehydriert waren CP getrocknet auch ihre dreidimensionale Struktur erhalten, und die EPS erschien wie ein Spinnennetz (6C). In den luftgetrocknet und CP-getrockneten Proben, die Wirkungen des niedermolekularer Inhibitor D-Leucin auf der Biofilmarchitektur Kolonie waren die Einzelzellmorphologie und EPS Struktur offensichtlich (6B und D). Der Biofilm-Kolonien in Gegenwart von D-Leucin gezüchtet waren kleiner und die Falten waren weniger ausgeprägt. Die D-Leucin-behandelten Zellen wurden verlängert, einen Phänotyp, der Obse istrved mit Zellwand-Targeting - Moleküle 33 behandelten Zellen. Zusätzlich wurden die Zellen weniger eindeutig mit den EPS bedeckt und nicht fest verbunden, um ihre Nachbarzellen über die EPS als in den unbehandelten Biofilm-Kolonien gesehen. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass beide Methoden der Biofilm Kolonie Dehydratation, luftgetrocknet aus Ethanol oder CP getrocknet unter Verwendung von Kohlendioxid als das Übergangsflüssigkeit geben wertvolle Erkenntnisse über die Auswirkungen von kleinen Molekülen auf Einzelzellmorphologie sowie auf dem EPS Fülle und Architektur. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig6.jpg" /> Abbildung 6. Kleine Moleküle können die großen und kleinen Maßstab der Architektur Biofilm Kolonie verändern. Biofilm Kolonien von B. subtilis NCIB 3610 grown (A und D) in Abwesenheit oder (B und D) in Gegenwart von 0,5 mM D-Leucin für 72 h bei 30 ° Cin dem Protokoll und getrocknet aus Ethanol auf festem Medium MSgg wurden wie beschrieben fixiert , wie folgend: Verwendung von Kohlendioxid als dem Übergangsflüssigkeit (A und B) luftgetrocknet und (C und D) CP getrocknet. Dargestellt sind oben binokularen Bilder der Biofilm Kolonien nach unten (links, obere Felder), von oben nach unten Fotografien der getrockneten Biofilm Kolonien montiert auf Elektronenmikroskopie Stubs vor Gold-Palladium-Beschichtung (links, untere Tafeln), Nieder- und Hoch Vergrößerung Bilder von SEM erwarb die 3D-Architektur der Biofilm Kolonie Falten oder die einzelne Zellmorphologie / EPS Organisation zu zeigen. Maßstabsbalken von links nach rechts: 5 mm . , 100 &amp; mgr; m, 2 &amp; mgr; m <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54612/54612fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1,925 mM </td><td> Potassium Hydrogenphosphat </td></tr><tr><td> 3,075 mM </td><td> Kaliumhydrogenphosphat </td></tr><tr><td> 100 mM </td><td> 3- (N - Morpholino) propansulfonsäure, pH 7,1 </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> Magnesiumchlorid-Hexahydrat </td></tr><tr><td> 700 &amp; mgr; M </td><td> Calciumchlorid wasserfrei </td></tr><tr><td> 50 uM a </td><td rowspan="2"> Eisen (III) -chlorid-Hexahydrat </td></tr><tr><td> 125 &amp; mgr; M b </td></tr><tr><td> 1 uM </td><td> Zinkchlorid wasserfrei </td></tr><tr><td> 2 uM </td><td> Thiamin-Hydrochlorid </td></tr><tr><td> 50 &amp; mgr; g / ml </td><td> Tryptophan </td></tr><tr><td> 50 &amp; mgr; g / ml </td><td> Phenylalanin </td></tr><tr><td> 50 &amp; mgr; g / ml </td><td> Threonin </td></tr><tr><td> 0,5% (v / v) </td><td> Glycerin wasserfrei </td&gt; </tr><tr><td> 0,5% (w / v) </td><td> L-Glutaminsäure monosodium Säuresalze Hydrat </td></tr><tr><td colspan="2"> ein für Häutchen - Assay; b für Biofilm - Assay </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Abschließende 1x MSgg Zusammensetzung in dieser Studie verwendet.

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Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

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Nanyang Technological University

Research

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Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

15.0K Aufrufe.  Weizmann Institute of Science. This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Serie: Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Wiederkehrende Herpetic Stromakeratitis in Mäuse, ein Modell für das Studium der menschlichen HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...