This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

1. Herstellung der Plasmide <ol><li> Bereiten Sie ein Plasmid (zB pET22) mit dem Ankerprotein (OmpA) zu einer biorthogonales Verknüpfung Domäne fusioniert (bezeichnet in diesem Protokoll als Anker-ST), Epitop - Tag (wie 6xHis, myc oder FLAG - Tags für die Reinigung und Identifizierung), periplasmatischen Lokalisation tag, Antibiotikaresistenz, und geeignete Replikationsursprung auf der Basis der ausgewählten Bakterienstamm 7. <ol><li> Extrahieren Plasmid-DNA aus über Nacht Kulturen eines im Handel erhältlichen DNA-Extraktions-Kit mit folgenden Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Bereiten Sie ein Plasmid (zB pACYC184) mit dem Enzym / Protein (PTE) innerhalb der OMV an die komplementäre bioorthogonale Verknüpfung Domäne des Ankerproteins zu dem fusionierten verpackt werden ( im Sinne dieses Protokoll als Enzym-SC), Epitop - Tag, periplasmatische Lokalisierung Tag, Antibiotika-Resistenz, die als Ankerprotein-Plasmid unterschiedlich ist, und geeignete origin der Replikation auf dem ausgewählten Bakterienstamm 7 basiert. <ol><li> Extrahieren Plasmid - DNA aus über Nacht Kulturen eines im Handel erhältlichen DNA - Extraktions - Kit mit folgenden Protokoll des Herstellers 7. </li></ol></li></ol> 2. Erzeugung eines OMV Verpackung E. coli Kultur <ol><li> Plasmidisolierung <ol><li> Reinige Plasmide kodieren , das Enzym-SC konstruieren und Anker-ST - Konstrukte aus getrennten Leitungen Wartungszelle Kommerzielle Plasmidisolation Kit gemäß Herstellerprotokoll 7 verwenden. Bestimmen DNA-Konzentration und Reinheit durch Absorption bei 260 nm und 280 nm gemessen wird. </li></ol></li><li> Co-Transformation <ol><li> Wählen Sie ein E. coli - Stamm, der kommerziell erhältlich ist , die Proteinexpression zu erleichtern. HINWEIS: BL21 (DE3) -Zellen wurden hier verwendet. Die T7-Lysogen wird für die Expression des anker ST Konstrukts erforderlich, die für prot auf dem T7-Promotor und T7-RNA-Polymerase beruhtein Ausdruck. Verwendung anderer Bakterienstämme erfordert entweder die Anwesenheit des T7 - Lysogen - Gens oder die Verwendung eines Plasmids , ausgenommen pET22 7. </li><li> Verdünnen gereinigte Plasmid-DNA zu äquivalenten molaren Konzentrationen dann wandeln sie in kompetente Bakterienzellen entweder über Hitzeschock-Transformation oder Elektroporation gemäß dem Protokoll des Herstellers für die kompetenten Zellen ausgewählt. </li><li> Platte transformierten Zellen auf antibiotikahaltigen Luria-Bertani (LB) Agarplatten sowohl mit Ampicillin (pET22) und Chloramphenicol (pACYC184); beide in Endkonzentrationen von 25 ug / ml. </li><li> Legen Sie die Kulturschale bei 37 ° C über Nacht nur Klone zu isolieren beide Plasmide enthalten. HINWEIS: Kolonien, die Antibiotika-Selektion überleben wird für alle zukünftigen OMV Präparate verwendet werden. Antibiotika (Ampicillin und Chloramphenicol) wird für alle flüssigen Kulturen zugegeben werden Selektionsdruck aufrecht zu erhalten und um die Anwesenheit beider Plasmide gewährleistet. </li></ol></li></ol> 3. OMV Produktion <ol><li> Colony Expansion <ol><li> Beimpfen von 5 ml Kulturmedium (typischerweise Terrific Broth (TB) oder LB) Antibiotika bei den genannten Konzentrationen (Schritt 2.2.3) mit einer einzelnen Kolonie aus den Selektionsplatten beschrieben in 2.2.4 enthält. </li><li> Führen Sie eine 1: 100-fache Verdünnung der über Nacht Starterkultur in verwirrte Kulturflaschen. HINWEIS: ein Volumen von Medien zwischen 250-500 ml verwenden. </li><li> Halten die Kultur bei 37 ° C bei 250 Upm Schütteln, dass eine ausreichende Belüftung der Kultur gewährleistet ist, erreicht. </li></ol></li><li> Induktion von jedem Plasmid <ol><li> Erlauben die Bakterienkultur bis zu einer OD 600 von 0,6-0,8, etwa 3 h Wachstum nach Beimpfung des Hauptwachstumskolben wachsen. </li><li> Um die endgültige Ausbeute von PTE-SC beladenen Vesikel zu verbessern, Zentrifuge die gesamte Kultur bei 7000 × g für 15 min. Zellpellet in vorgewärmte, frische Kulturmedien. HINWEIS: Diese Optional Schritt hilft eine leere OMV zu entfernen, die die Induktion PTE-SC vor in den Kulturmedien vorhanden sind. </li><li> Machen Sie eine 20% ige Stammlösung von L-Arabinose in Wasser und Sterilfilter mit einem 0,22 &amp; mgr; m-Filter. Store L-Arabinose-Lösung bei 4 ° C für 2-4 Wochen. </li><li> Fügen Sie den L-Arabinose-Lösung der Kulturflasche bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,2% PTE-SC Produktion zu initiieren. HINWEIS: Dies hilft, den periplasmatischen Raum mit PTE-SC vor der Förderung der verstärkten Vesikulation durch Induktion des mutierten OmpA-ST vorab zu laden. </li><li> Machen Sie eine 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) Lösung in Wasser und Sterilfilter mit einem 0,22 &amp; mgr; m-Filter. HINWEIS: IPTG muss sofort einmal mit Feuchtigkeit versorgt werden. Aliquots von IPTG kann für 3-6 Monate eingefroren werden gespeichert und können unmittelbar vor auftauen zu verwenden. </li><li> Hinzufügen IPTG nach weiteren 3 Stunden Inkubationszeit bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM Herstellung des OmpA-ST zu initiieren. </li><li> Lassen Sie die cultur für eine weitere 8-14 h bei 37 ° C wachsen unter Schütteln. </li></ol></li></ol> 4. OMV Reinigung <ol><li> Entfernung von intakten Bakterien <ol><li> Zentrifugieren der Bakterienkulturmedium für 15 min bei 7000 xg bei 4ºC intakten Bakterien zu pelletieren. </li><li> Dekantieren und zu speichern, die Medien von der Spitze der Post Zentrifugation Zellpellet wird vorsichtig, um nicht das Zellpellet stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 und 4.1.2 für einen zusätzlichen Zentrifugationszyklus alle intakten Bakterien aus dem Kulturmedium ist sicher entfernt werden, um sicherzustellen, dekantieren und die Medien speichern. </li></ol></li><li> Entfernung von Proteinaggregaten <ol><li> Reinigung weiter die Bakterienkulturmedien ein 0,45 um Membranfilter verwendet, um restliche unerwünschte Bakterien und große Zellmaterial zu entfernen. HINWEIS: Verwenden Sie eine biologisch kompatiblen Membranmaterial für höhere Gewinnungsraten und niedriger Proteinadsorption wie Celluloseacetat (CA) oder Polyvinylidendifluorid (PVDF). Spritzenfilter Volumen weniger als 100 ml und Vakuumfiltervolumen größer als 100 ml. <ol><li> Um Spritzenfilter, Kulturmedium in sterile 10-50 ml Spritze ziehen. Bringen 0,45 um Filter zu Luer Ende Spritze. Drücken Sie Kolben und sammeln Durchfluss in ein neues Gefäß. </li><li> Vakuumfilter Kulturmedium auf eine sterile Filtrationsvorrichtung übertragen. Bringen Einheit zur Vakuumpumpe oder Absauger versenken Sog zu erzeugen. Übertragen gefilterten Mediums zu neuen Schiff. </li></ol></li></ol></li><li> Die Isolierung von OMV über Ultrazentrifugation <ol><li> Fügen Sie die gefilterten Kulturmedien in Zentrifugenröhrchen vorsichtig gegenüberliegende Rohre in der Zentrifuge zu balancieren. </li><li> Pellet bei ~ 150.000 xg für 3 h bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge des entsprechenden Rotors unter Verwendung sowohl des Instruments passend und -röhren verwendet wird. </li><li> Dekantiert die OMV abgereichertem Kulturmedien von der OMV Pellet, darauf achten, daß die OMV Pellet zu stören, sofort bei der Fertigstellung of Zentrifugieren als Pellet ermöglicht die OMV in den Medien zu bleiben wird das Pellet reduzieren OMV Erholung erweichen. HINWEIS: Dieses Pellet leicht braun werden und in Abhängigkeit von der Ausgangsbetrag der Bakterienkultur kann oder mit dem Auge nicht sichtbar sein. direkt von der Spitze des Zentrifugationsröhrchens die Medien Ansaugrauchmelder ist auch eine Option, wenn man bedenkt, dass die mehr Medien aus dem OMV entfernt Pellet die reineren die endgültige OMV Probe sein wird. </li><li> Speichern Sie die zentrifugiert Überstand für eine spätere dynamische Lichtstreuung (DLS) Tests, um sicherzustellen, dass die OMV Partikel von den Medien völlig erschöpft waren. </li><li> Hinzufügen 0,5-1 ml sterilfiltriert Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4 oder 100 mM N - Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES) Puffer bei pH 8,0 auf das OMV Pellet ermöglicht es für 30 min bei RT inkubiert. Stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht trocknet. HINWEIS: Extremes in Ionenstärke der Lösung, pH-Wert und Temperatur kann in reduzierter OMV Löslichkeit führen und fördern aggresuchung. </li><li> Pipettieren vorsichtig die gereinigte OMV Lösung aus dem Zentrifugenröhrchen, das Mischen sanft das gesamte Pellet, um sicherzustellen, wurde in Lösung gebracht worden. </li></ol></li></ol> 5. OMV Charakterisierung <ol><li> Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen DLS oder Nanopartikel-Tracking-Software nach den Protokollen des Herstellers zur Verfügung gestellt einzigartig für jedes Instrument OMV Größenverteilung und Partikelkonzentration zu bestimmen. HINWEIS: Hier OMV Größenverteilung und Konzentration bestimmt wurde Nanosight LM10 Nanoparticle-Tracking und NTA 2.3 Analyse-Software verwendet wird. <ol><li> Öffnen Sie die Software. </li><li> Schalten Sie Mikroskop und reinigen alle Oberflächen auf dem Mikroskop und Nanopartikel-Tracking-Einheit. </li><li> In ~ 0,5 ml OMV Probe direkt auf das Sichtfenster der Partikel-Tracking-Gerät durch den Luer mit einer sterilen 1-ml-Spritze Montage sicher zu sein, das gesamte Sichtfenster abdecken, ohne dass Luft in das System Blasen zu injizieren. </li><li> Platz ter Nanopartikel-Tracking-Einheit auf dem Mikroskoptisch, und schalten Sie den Laser. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Aufnahme&quot; in der Software. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop Fokus und inszenieren die Partikel auf dem Vorschaubildschirm in der Software-Fenster zu visualisieren. </li><li> Stellen Sie die &quot;Kamera-Shutter&quot; und &quot;Camera Gain&quot; bis helle Partikel eindeutig auf einem dunklen Hintergrund sichtbar gemacht werden. </li><li> Stellen Sie erfassen Dauer auf 60 Sekunden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Record&quot;. </li><li> Wenn Sie gefragt werden, geben Sie die Probe / Gerätetemperatur, die Probe beschriften und in einen Benutzer festgelegten Ordner laufen bei der Fertigstellung der jeweils die Videodaten speichern. </li><li> Halten Sie alle Analyseparameter (Nachweisgrenze, Blur, Min Streckenlänge, Min Erwartete Partikelgröße) auf automatische Erkennung Modus und klicken Sie auf &quot;Prozessablauf.&quot; HINWEIS: Das Handbuch für wie kann jeder Parameter unabhängig für die Feinabstimmung Analyseergebnisse angepasst werden. </li><li> Nehmen Sie Partikelgrößenverteilung und Partikel / ml Konzentration, wie durch die Software bestimmt wird. HINWEIS: Eine typische OMV hydrodynamischen Größenbereich zwischen 30 bis 200 nm mit einer Partikel / ml - Konzentration von ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Die Bestimmung OMV Proteingehalt <ol><li> Verwenden Sie Standard - SDS-PAGE und Western - Blot - Protokolle OMV Reinheit, Enzymproduktion, und die SC-ST Vernetzungseffizienz 7 zu bewerten. HINWEIS: Vernetzungseffizienz wird nicht zu 100% 7 sein. </li></ol></li></ol> 6. Überprüfung der Enzym Verpackung <ol><li> PTE-Aktivitätstest <ol><li> Führen alle enzymatischen Assays in einem geeigneten Puffer, wie 100 mM CHES-Puffer (pH 8) bei 25 ° C entweder in einer Küvette oder in einer Well-Platte 96/384 gemultiplext. </li><li> Werden 5 ul einer 1: 1.000-Verdünnung von Paraoxon in CHES-Puffer und 90 &amp; mgr; l CHES und 5 &amp; mgr; l gereinigter OMV (~ 36-fach konzentriert, im Vergleich zu der OMV-Konzentration im Kulturmedium). Achtung: Paraoxon ist eine giftige Pestizidund muss pro Hersteller und institutionellen Richtlinien behandelt werden. </li><li> Nehmen Sie Extinktionsablesungen in regelmäßigen Abständen (alle 20 sec für ~ 2 Stunden Gesamtreaktionszeit) bei 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) und bei 348 nm (isosbestischer Punkt ε = 5,4 mM -1 cm -1) zu Überwachung der Reaktionsverlauf des chromogenen paraoxon Abbauprodukt, p - Nitrophenol. HINWEIS: Bei pH - Werten über 8 die dominante deprotonierten Form p - Nitrophenol vorhanden ist , bei 405 nm für eine genaue Überwachung zu ermöglichen. In allen anderen komplexen oder niedrigerer pH - Lösungen ist es notwendig , den isosbestischen Punkt von 348 nm , wie mehrere Formen der p - Nitrophenol zu nutzen , wird anwesend sein. </li><li> Berechnen Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten durch die Steigung des linearen Teils der Verlaufskurven aus Schritt 6.1.3 Bestimmung der relativen Menge des PTE in jeder Probe, Verpackungseffizienz und Gesamt PTE Produktion zu vergleichen. </li><li> Führen Standard enzymatischeTestprotokolle K M, V max und k cat für die OMV verkapselt PTE zu bestimmen. ANMERKUNG: Eine Analyse Lineweaver-Burk kann zur Bestimmung dieser kinetischen Parameter verwendet werden , wenn der y-Intercept = 1 / V max und Steigung = K M / V max 20. </li></ol></li><li> Transmembran-Substrat / Produkt Diffusion. <ol><li> Führen die gleiche Analyse kinetischer Assay, wie in Schritt 6.1 unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen an Triton X-100 in Puffer CHES von 0-3 Vol% beschrieben. HINWEIS: Die Zugabe von Triton X-100 zu den solubilisierten Funktionen OMV so dass die Lipid-Doppelschicht zu stören, für die der Inhalt der OMV zur Reaktionslösung frei zugänglich zu sein. </li><li> Berechnen und vergleichen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten an jedem Triton X-100 Ebene Trans Passage des Substrats / Produkt durch minimale Änderung der Enzymaktivität (Anfangsgeschwindigkeiten) angegeben, um zu überprüfen, verglichen zur Enzymaktivität in die Abwesenheit von Triton X-100. Wenn eine wesentliche Erhöhung der Enzymaktivität in Gegenwart von Triton X-100 beobachtet wird, ist es wahrscheinlich, daß das Substrat frei diffundieren nicht in das OMV. </li><li> Assay freie Enzymaktivität in Gegenwart von Triton X-100, der Enzymaktivität (wie in Abschnitt 6.1 oben beschrieben), um zu überprüfen, wird nicht durch das Tensid selbst gehemmt. HINWEIS: Wenn Aktivität stark von Triton X-100, alternative Additive wie Saponine oder verschiedene Polysorbat / Tween-Tenside können besser geeignet sein Bersten der OMV Membran beeinflusst. </li></ol></li></ol> 7. OMV über Speicher, <ol><li> Einfrieren <ol><li> Platz ~ 100 &amp; mgr; l-Aliquots von gereinigtem OMV direkt in flüssigem Stickstoff zu schnappen die Aliquots einfrieren sicher nicht vollständig zu sein, um die Fläschchen in Wasser getaucht oder Kontakt mit einem flüssigen Stickstoff mit der Probe selbst. HINWEIS: Gereinigte OMV direkt im Puffer werden einschnappen können eingefroren, die zum Lösen der OMV Pellet während des purificat ausgewählt wurdeIonen - Prozess ohne zusätzliche Gefrierschutzmittel notwendig 7. </li><li> Lagern Sie die schockgefroren Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Tauen gefrorenen Aliquots aus Schritt 7.1.1, indem sie bei RT sicher zu sein, nicht zu erwärmen, die Proben platzieren. </li><li> Vor allen Proben für die Speicherung auf diese Weise vorbereitet führen den Enzymtest in Schritt 6.1 Vergleich Anfangsgeschwindigkeiten beschrieben vor und nach dem Einfrieren zu verifizieren, dass es keinen signifikanten Verlust der Enzymaktivität Beitrag Gefrier-Auftau. HINWEIS: Shop gereinigt OMV bei 4 ° C, wenn eine Verringerung der Enzymaktivität aufgrund von Gefrieren beobachtet wird. </li></ol></li><li> Die Gefriertrocknung <ol><li> Lyophilisieren die schockgefroren gereinigte OMV Aliquots im Handel erhältliche Lyophilisation Ausrüstung verwendet 21. </li><li> Die lyophilisierte Aliquots bei RT für Wochen oder bei -80 ° C für viele Monate. </li><li> Das gleiche Volumen von gereinigtem Wasser auf das gefriergetrocknete OMV als vor der Lyophilisation und lassen Sie sich für 30 min bei RT stehen t rehydrierener probieren. Vorsichtig mischen, wenn notwendig, sicher zu sein, nicht zu verwirbeln oder die OMV beschallen. </li><li> In lyophilisierten OMV Pulver direkt auf Point-of-Care für Anwendungen, in denen eine vorherige Verdünnung / Solubilisierung nicht notwendig ist. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Protokoll - Funktionen eine repräsentative gerichtet Verpackungstechnik zu demonstrieren , in dem ein Enzym von Interesse produziert und verpackt in die OMV durch E. coli. Wie bei vielen komplexen Techniken gibt es mehrere Bereiche, in denen das Protokoll zur Verwendung in verschiedenen einzigartigen Anwendungen aufzunehmen modifiziert werden, von denen einige im Folgenden beschrieben. Während der Mechanismus der OMV Verpackung und Enzym Verkapselung kann auf die spezifischen Bedürfnisse angepasst werd...

Dargestellt ist hier ein Verfahren für die Konstruktion, Herstellung und Reinigung von Enzym-beladenen bakterielle äußere Membranvesikel (OMV). OMV sind klein, vor allem unilamellare, Proteo , die von 30 bis 200 nm 1,2 in einem Größenbereich. Alle Gram-negative und Gram-positive Bakterien , die bisher untersucht wurden , haben gezeigt , Freisetzung von entweder OMV oder extrazelluläre Vesikel (EV) von ihrer Oberfläche 3,4. Der genaue Mechanismus, durch den OMV produziert haben noch voll auf Grund der unterschiedlichen Bakterienpopulationen aufgeklärt werden, dass sie so gut wie die unterschiedlichen Funktionen ausscheiden, die sie dienen. OMV wurden , um eine breite Palette von Fracht aus kleinen Molekülen, Peptiden und Proteinen an genetischem Material dazu dient , eine Vielzahl von komplexen Signal, Gen - Translokation zu transportieren gezeigt, und Virulenzfunktionen 5,6. Die genauen Mechanismen der OMV Biogenese sind nicht gut charakterisiert, und scheinen zwischen Bakterienarten zu unterscheiden. Trotz this der Tat haben wir ein Verfahren zur Steigerung der Verpackungseffizienz eines rekombinanten Proteins in OMV entwickelt durch eine synthetische Bindung zwischen einem Protein von Interesse und eine hoch reichlich Protein endogen der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV entsteht. In Abwesenheit eines synthetischen Bindung oder künstlich eingearbeitet Affinität zwischen dem rekombinant exprimierten Protein und der OMV die beobachtete Verpackungseffizienz sehr niedrig 7. Dieses Ergebnis ist in dem Augenblick der OMV Bildung an der Bakterienoberfläche oder durch gerichtete Verpackung durch Mechanismen, die nicht gut verstanden sind innerhalb der OMV erfolgt entweder durch Zufall Verkapselung als Einbau der Proteine ​​zu erwarten. Ein gewisser Erfolg wurde in Verpackungsproteine ​​einfach durch Überexpression in den periplasmatischen Raum beobachtet worden, die auf zufällige Chance Verkapselung, aber effektive Verpackung setzt eine hohe Proteinabhängig mit einigen Proteinen mit hohem Wirkungsgrad Verpackung im Vergleich zu anderen tham Do Paket nicht mehr 8-10. Durch die Verwendung von gemeinsamen synthetischen Biologie - Techniken haben wir versucht , Escherichia coli (E. coli) zu konstruieren , ein aktives Enzym von Interesse in OMV gleichzeitig produzieren, verpacken und ausscheiden, die derzeitigen Kenntnissen Beschränkungen hinsichtlich umgeht , wie OMV gebildet werden und wie Ladung durch die Bakterien ausgewählt ist für Verpackung. Für die Zwecke dieser Anmeldung ein Split-Protein Biokonjugation System wurde als der synthetische Verknüpfung der Wahl ausgewählt Richtungs Verpackung in das OMV erleichtern. Wie der Name schon ein Split-Protein Biokonjugation System schlägt besteht aus zwei komplementären Untereinheit Domänen, die miteinander interagieren. Die geteilten Proteindomänen für die Zwecke dieses Protokoll ausgewählt werden als die SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) Domäne und aus dem Streptococcus pyogenes Fibronektin-bindenden Protein (FbaB) 11 abgeleitet werden. Diese Spaltung Proteinsystem ist ungewöhnlich, dass when die beiden Untereinheiten innerhalb der Nähe sind eine Isopeptidbindung bildet sich spontan zwischen dem proximalen Asparaginsäure und Lysin Aminoreste Säure eine kovalente Bindung zu schaffen. Isopeptidbindung Bildung erfordert nicht die Zugabe von Chaperon - Proteinen, katalytische Enzyme oder Cofaktoren und kann bei Raumtemperatur (RT) und über einen weiten Bereich von physiologisch relevanten Bedingungen 12 leicht auftreten. Als Beweis des Konzeptes wurde Phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) aus Brevundimonas diminuta ausgewählt in E. coli 13 OMV abgeleitet verpackt werden. PTE enthält einen zweikernigen Zn / Zn aktiven Stelle und hat die Fähigkeit , Organophosphate durch eine Hydrolysereaktion zu brechen aryldialkylphosphates in Dialkylphosphate und arylalkohole Umwandlung 14. Die Exposition gegenüber Organophosphaten beeinträchtigt richtige Neurotransmitterfunktion durch die Hydrolyse von Acetylcholin durch Acetylcholinesterase bei neuromuskulären Verbindungen Hemmung Making Organophosphat abgeleiteten Verbindungen extrem gefährlich 15. Längerer oder signifikante Exposition gegenüber Organophosphaten führt häufig zu unkontrollierbaren Zuckungen und in der Regel zum Tode führt über Erstickung. Während PTE die höchste katalytische Aktivität gegenüber paraoxon zeigt, ein sehr wirksames Insektizid, ist es auch in der Lage 16 eine breite Palette von anderen Pestiziden und V / G - Typ chemischen Nervenmittel zur Hydrolyse. Zur Erleichterung wurde OMV Verpackung, ein bakterielles Plasmid ausgelegt, dass ein Genkonstrukt kodiert, das einen induzierbaren Promotor, einen periplasmatischen Lokalisierungssequenz und eine kurze multiple Klonierungsstelle stromaufwärts von der SC-Gensequenz. Einsetzen des PTE Gens zwischen dem Leiter und SC Sequenz zur Erstellung eines genetischen Schalter erlaubt, die die PTE-SC-Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum für OMV Verpackung ausgerichtet ist. Während die hier beschriebenen Bemühungen auf PTE konzentrieren, ist das Enzym-Gen untereinander austauschbar und leicht mit einem anderen Gen-Sequenz ersetzt werden könnte, um facilitate Verpackung eines alternativen Enzym oder Protein. Was den zweiten Teil des synthetischen Bindung, eine reichliche outer membrane protein (OmpA) wird gewählt, um die ST-Peptidsequenz zu präsentieren. Während die Wahl des Ankerproteins variieren kann, ist es wesentlich, dass das Protein eine permissive Domäne besitzt, die in den periplasmatischen Raum präsentiert, toleriert das Fusionskonstrukt ohne Zytotoxizität zu induzieren, ist bekannt, in OMV anwesend zu sein, und nicht aggregiert, wenn er rekombinant ist hergestellt. OmpA ist ein 37,2 kDa Transmembran - Porin - Protein , das 17 in der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV stark exprimiert wird bekannt sein. Es liegt im Transport von kleinen Molekülen verwickelt &lt;2 nm in der Größe, in der Bakterienmembran 18. Einheimische OmpA hat zwei strukturell unterschiedliche Domains, ein Trans Beta Barrel - Motiv und ein periplasmatisch löslichen C-terminalen Teil bekannt mit dem Peptidoglycan 19 zu interagieren. In der Mutante OmpA-ST Fusion designed hier der C-terminalen Teil von OmpA wurde gelöscht und die ST wurde dem periplasmatisch zugewandt N- oder C-Terminus fusioniert. Löschen des periplasmatischen Teil OmpA verringert die Anzahl der Wechselwirkungen zwischen der äußeren Membran und der Peptidoglykan in Membrandestabilisierung resultierende was zu hyper-vesiculation 7. Genomic OmpA wurde zusätzlich zu dem rekombinant exprimierten OmpA-ST-Konstrukt zu mildern Brutto Membrandestabilisierung gehalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">IPTG</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Can be prepared ahead of time and stored at 4C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">TB/LB Culture Media</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other growth medias will likely work similarly.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">One of many potential suitable surfactants.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Baffled culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">The baffles promote higher levels of aeration.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">CHES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:96px;">BP318-100</td>
			<td style="width:273px;">Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &#62; 8).</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Paraoxon</td>
			<td style="width:93px;">Chem Service</td>
			<td style="width:96px;">N-12816</td>
			<td style="width:273px;">Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Syringe Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">60183-221&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (30 mm)</td>
			<td style="width:273px;">Filter diameter will depend on volume of sample.&#160; Low protein binding membrane is critical.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:93px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:96px;">Excella E24</td>
			<td style="width:273px;">Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Culture Centrifuge</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">RC 5B PLUS</td>
			<td style="width:273px;">Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">WX Ultra 90</td>
			<td style="width:273px;">Capable of centrifugal forces &#8805;150,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">AH-629</td>
			<td style="width:273px;">Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (25 x 89 mm)</td>
			<td style="width:93px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:96px;">344058</td>
			<td style="width:273px;">Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Tecan</td>
			<td style="width:96px;">Infinite M1000</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for enzyme kinetic assays.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">DLS / particle tracking</td>
			<td style="width:93px;">NanoSight&#160;</td>
			<td style="width:96px;">LM10</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Suitable bacterial expression strain.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pET22</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:96px;">69744-3</td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pACYC184</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td style="width:96px;">28704</td>
			<td style="width:273px;">Example kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

Eine zunehmende Interesse der synthetischen Biologie-Techniken bei der Anwendung der äußeren Membran Vesikel (OMV) zu programmieren, führen zu einigen sehr interessanten und einzigartigen Anwendungen für die OMV, wo traditionelle Nanopartikel zu schwierig erweisen zu synthetisieren. Bis heute sind alle gramnegativen Bakterien wurde gezeigt, OMV Demonstrieren Verpackung einer Vielzahl von Ladung zu erzeugen, die kleine Moleküle, Peptide, Proteine ​​und genetische Material enthält. Auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Ladung, sind OMV in vielen biologischen Prozessen beteiligt im Bereich von Zell-Zell-Kommunikation zu Gentransfer und Lieferung von Virulenzfaktoren abhängig davon, welche Bakterien die OMV produzieren. Erst vor kurzem haben bakterielle OMV für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen durch die Entwicklung von Techniken zugänglich zu steuern und direkte Verpackung von rekombinanten Proteinen in die OMV. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Verwendung von Enzym verpackt OMV zur Bereitstellung verbesserter Marktpreisefürll Herstellung von rekombinanten Enzyms erhöht Vesikulation und verbesserte Enzymstabilität. Erfolgreiche Nutzung dieses Protokolls wird in der Schaffung einer Bakterienstamm führen, die gleichzeitig ein rekombinantes Protein produziert und leitet sie für OMV Verkapselung durch eine synthetische Bindung zwischen dem rekombinanten Protein zu schaffen, und eine äußere Membran-Ankerproteins. Dieses Protokoll beschreibt auch Verfahren zur Isolierung von OMV aus Bakterienkulturen sowie für eine angemessene Handhabung Techniken und Dinge zu berücksichtigen, wenn dieses Protokoll für den Einsatz für andere einzigartige Anwendungen wie Anpassung: pharmazeutische Drug Delivery, medizinische Diagnostik und Umweltsanierung.

Gleichzeitige Expression von zwei rekombinanten Proteinen, wie für die OMV Verpackungsstrategie in diesem Protokoll detailliert erforderlich ist, kann durch eine Anzahl verschiedener Wege erreicht werden. Hier wird ein Zwei-Vektor-System wurde mit kompatiblen Replikationsursprünge und separaten induzierbaren Genkassetten verwendet. Für die Expression des PTE-SC konstruieren Kommerzielle Plasmidrückgrat (pACY184) konstruiert wurde eine Arabinose induzierbare Gen-Kassette und ein Doppe...

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K Aufrufe.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

Serie: Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

Mechanische Trennung und Proteinlöslichkeit der äußeren und inneren Perivitelline-Sublayer aus Henneneiern

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...