Diese Arbeit wurde von den Delaware COBRE Programme in Drug Discovery und in Advanced Biomaterials von Institutional Development Awards vom National Institute of Medical Sciences Generäle an den National Institutes of Health (P20GM104316 und P30 GM110758-01, jeweils), die Pew Charitable Trusts finanziert unterstützt (00026178), ein National Science Foundation Career Award (DMR-1253906), die Burroughs Wellcome Fund (1.006.787) und der National Science Foundation IGERT SBE2 Programm an der University of Delaware (Stipendium für L. Sawicki). Die Autoren danken dem Delaware Biotechnology Institute BioImaging Center an der University of Delaware für die Ausbildung und den Zugang zu der konfokalen Mikroskopie, Frau Katherine Wiley für die Unterstützung während der Videoaufnahme, Mr. Matthew Rehmann für hMSCs isoliert aus Knochenmark, Prof. Christopher J großzügig Bereitstellung . Kloxin und Herr Stephen Ma für die großzügige Bereitstellung von Photomasken, und für die Verwendung des automatischen Plattenleser Prof. Wilfred Chen. </p&gt;

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The authors have nothing to disclose.

Das hier vorgestellte Verfahren zeigt Techniken, die von Thiol-En-Klick-Chemie gebildeten Zellen innerhalb von Hydrogelen photoencapsulate und photopattern anschließend die Gele mit biochemischen Signale. Die Verwendung von Licht, um anfänglich Hydrogele bilden können homogene Vermischung und Suspension der Zellen in der Polymerlösung vor der Polymerisation. Schnelle Polymerisation &quot;Sperren&quot; das Gel in der Form der definierten Form und kapselt Zellen innerhalb des Hydrogels Netzwerk suspendiert. Gele können auch in zahlreiche verschiedene Formen geformt werden (beispielsweise Glasobjektträger oder Spritzenspitzen) in Abhängigkeit von der gewünschten Endanwendung. Beispielsweise für die 3D-Kultur eingekapselten Zellen in Hydrogelen Glasobjektträger angebracht sind besonders nützlich für Bildgebungsanwendungen als Lichtdämpfung innerhalb einer dünnen Probe begrenzt ist. Spritzenformen können für eine schnelle Verkapselung von Zellen verwendet werden, so dass eine größere Anzahl von Proben in kurzer Zeit hergestellt werden (im Vergleich zu Glas-Objektträgers), die für die Experimente verwendet werden können, erfordern eine große Anzahl von Zellen wie Zytometrie oder qPCR fließen. Anschließend kann diese Gele dann mit biochemischen cues gemustert werden , um gewünschte zelluläre Antworten , wie beispielsweise Differenzierung oder Invasion hervorzurufen. 30,31 Assays für die Lebensfähigkeit und die Stoffwechselaktivität zeigen das Überleben von Zellen für das Materialsystem und Strukturieren Bedingungen dargestellt. Beachten Sie, dass die metabolische Aktivität bis zum Tag 3 in nicht abbaubare Gele (RGKGRK Peptid vernetzen) überwacht wurde, um die ersten Auswirkungen der Polymerisation und Musterbedingungen auf die Zellfunktion zu beurteilen. Zusätzlich wird ein Membranintegrität Test (Live / Dead Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Färbung) von hMSCs bei 1 und 6 Tage nach der Einkapselung in Gelen mit einem abbaubaren Peptid vernetzen formuliert (GPQGIWGQ) unterstützt, dass die Zellen lebensfähig bleiben und nach 1 Woche in Kultur zu verbreiten. Die Lebensfähigkeit von zusätzlichen Zelllinien wurde für Photopatterning Bedingungen 32 ähnlich denen berichtetverwendet hier und für das beschriebene Hydrogelsystem ausgewertet werden können Live / Dead-Färbung und die metabolische Aktivität Assays verwendet. Während wir Probleme mit der Lebensfähigkeit der Zellen nicht beobachtet haben, mit diesem Materialsystem und damit verbundene Verfahren (4.2 und 4.3), können einige Zelltypen zu radikalischem und / oder Lichteinwirkung empfindlich sein. In diesem Fall können Benutzer betrachten nicht-photoinitiierte Materialsysteme verwenden, wie beispielsweise Azid-Alkin, 12 FXIII, 31 oder Diels Alder-basierte Hydrogelbildung Chemien. 33 Facile Techniken Musterungs biochemischer Signale innerhalb Gelen zu detektieren und zu quantifizieren, ebenfalls dargestellt werden (3.1 und 3.2). Ellman-Assay ist von besonderem Interesse , weil die Reagenzien im Handel erhältlich und keine zusätzlichen Verarbeitungsschritte oder synthetischen teurer Reagenzien (beispielsweise fluoreszenzmarkierte Peptid) erforderlich sind. Ellman-Assay kann verwendet werden, um genau die Modifikation von freien Thiolen mit biochemischer Signale unter differe bestimmennt Photostrukturierungs Bedingungen sowie schnell Muster zu visualisieren. Für die Peptid Inkorporation Quantifizieren der Thiolfunktion Konzentration vor und nach der Musterbildung, als quantitatives Maß der Peptid Inkorporation wird direkt mit Ellman-Assay beurteilt. Während diese Art der Quantifizierungs mit fluoreszenzmarkierten Peptiden, 34 bildbasierte Quantifizierung erfordert zeitaufwendige Handhabung und Analyseschritte (beispielsweise die Synthese eines fluoreszenzmarkierten Peptids und die Erzeugung einer Kalibrierungskurve in Beziehung Fluoreszenz Peptidkonzentration durchgeführt werden Verwendung von Bildanalyse). Für die Bildgebung Peptid Einarbeitung kann Ellman-Reagenz direkt auf die Proben und sofort visualisiert angewendet werden. Während auf die x- und y-Ebenen für Modellvisualisierung beschränkt, kann die Technik als einfache Routineverfahren verwendet werden, um zu bestimmen, ob Matrizen freien Thiolgruppen strukturiert worden enthält. Es ist wichtig zu beachten, dass Ellman-Test nicht c istonsidered cytocompatible, also, während sie verwendet werden kann, zu beobachten und zu quantifizieren photopatterns, kann sie nicht in Gegenwart von Zellen durchgeführt werden. Zum Abbilden Strukturierung in drei Dimensionen und in Gegenwart von Zellen, bleibt die Konjugation von fluoreszierenden Peptide innerhalb Hydrogelmatrices ein leistungsfähiges und weit verbreiteter Ansatz. Auflösung der Muster kann in der x- ausgewertet werden, y- und z-Ebenen unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, und dieses Verfahren ist cytocompatible so dass Zellen in strukturierten Bereichen oder nicht gemusterten Bereiche identifiziert werden kann. Zusammengenommen Ellman-Assay und Imaging-basierte Techniken sind ergänzende Instrumente für Forscher sowohl quantitativ zu beurteilen und qualitativ die Photopatterning biochemischer Signale innerhalb des Materialsystem. Photoclick oder breiter photoinitiiert, Chemien für die Bildung und Modifikation von Hydrogelen in Gegenwart von Zellen, sind zahlreich. Die Form, Kapselung und Strukturierungstechniken präsentiert werden, gehören nicht limITED zu dem Materialsystem beschrieben und können auf alternative lichtbasierte Chemien, wie Thiol-Alkin, 35 Azid-Alkin, 4 und andere Thiol-En - Chemien (beispielsweise Thiol-norbornen), 10,13 als auch angewendet werden , wie mit verschiedene Photoinitiatoren wie Irgacure 2959, Eosin Y und Campherchinon. Hinweis : Benutzer können müssen Prozedurparameter (zB Inkubationszeiten, Polymerisationszeiten, Zelldichte) anpassen , um sicherzustellen , dass die Bedingungen für diese anderen Systeme cytocompatible bleiben. Da der Strukturierungsprozess eine Diffusion des alloc-modifizierten Peptids (s) in das Hydrogel (2.2.3-2.2.5) erfordert, kann dieses Verfahren am nützlichsten für die Zugabe von Integrin-Bindungseinheiten (zB Peptide oder extrazelluläre Matrixprotein nachzuweisen Fragmente) an das Hydrogel, wo Befestigung des Liganden an das Netzwerk zur Erzeugung von Zugkräften durch die Zelle und Voll Integrin - Aktivierung erforderlich ist. 36 Note, für Biomoleküle , die möglicherweisewerden in ähnlicher Weise aktiv in Lösung oder auf Immobilisierung (zB Wachstumsfaktoren oder Zytokine), der Inkubationsschritt für Einheit Diffusion (~ 1 h) in das Hydrogel könnte dazu führen , Ereignisse zu signalisieren , die Strukturierung Ergebnisse Konvolut. Andere Verfahren wurden für die Wachstumsfaktor - Immobilisierung oder lokale Sequestrierung für ihre Strukturierung etabliert. 37-39 Zusätzlich Musterauflösung wird durch die Kontrolle über die Belichtung bestimmt. Hier Photomasken ermöglichen die Erzeugung von Mustern durch das Gel Tiefe und in der x- und y-Ebenen; jedoch größere räumliche Kontrolle über Musterungs biochemischer Signale innerhalb Gele können mit alternativen Verfahren zur Bestrahlung wie beispielsweise die Verwendung eines Zwei-Photonen - konfokalen Mikroskop erreicht werden , zu erzeugen Muster in der x-, y- und z- Ebene. 34,40 Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass, während das Materialsystem in diesem Verfahren verwendet nur anfänglich mit biochemischer Signale modifiziert wird, orthogonal Photoclick Chemien verwendet werden könnte alte zu ermöglichenRationen in Matrixeigenschaften über die Zeit. 12 Das Verfahren und Techniken , die hier vorgestellt für die Erstellung von synthetischen Matrizen mit gut definierten und raum - zeitlich-gesteuerte Eigenschaften Vielfalt an die aktuellen Konzepte. Insbesondere ist die kommerzielle Verfügbarkeit von Reagenzien und Materialien in diesem Verfahren verwendet wird, wird bei der Verwendung von Hydrogel-basierte Biomaterialien für Anwendungen in kontrollierten Zellkultur interessiert zu einer Vielzahl von Forschern nützlich sein.

Klicken Chemien sind in der Gestaltung von Materialien für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen zunehmend verwendet werden, einschließlich Arzneimittelabgabe, Tissue Engineering und kontrollierte Zellkultur aufgrund ihrer selektiven, effizient und oft cytocompatible Reaktivitäten. 1-3 Photoclick Chemien , die Licht verwenden , um auszulösen oder initiieren Reaktionen (beispielsweise Azid-Alkin, 4 Thiol-en, 5 und Tetrazol-Alken 6) sind von besonderem Interesse für die Bildung oder Modifikation von Biomaterialien. Schnelle Raten unter milden Bedingungen und Kontrolle , wann und wo sie stattfinden , mit Licht , diese Reaktionen machen gut geeignet für Anwender gerichtete Steuerung von Biomaterial Eigenschaften in Gegenwart von Zellen. 7,8 Insbesondere Thiol-En - Photoclick- Chemie verwendet wurden , zu erzeugen Hydrogel-basierte Biomaterialien mit robusten mechanischen Eigenschaften 5,9 und für die Einkapselung von einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich, aber nichtt begrenzt, humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs), Fibroblasten, Chondrozyten und Pankreaszellen mit Versprechen für die Zellkultur und Lieferung. 10,11 Ferner haben diese Chemien für die räumliche Musterung biochemischer Signale verwendet worden Schlüsselaspekte der nachzuahmen nativen Zellmikroumgebungen und entsprechende Zell-Matrix - Interaktionen erleichtern, einschließlich der Haftung, Differenzierung und Invasion. 3,12 Für den Bau von Thiol-En - Hydrogele mit Licht, Peptide Cysteine (Thiol) , die gemeinsam umgesetzt werden , mit funktionalisierten Polymeren mit Acrylaten oder Norbornene ( &#39;en&#39;) für eine schnelle, photoinitierte Polymerisation unter cytocompatible Bedingungen. 13 Der Ausbau dieser Toolbox haben wir versucht zu etablieren Verfahren zur Bildung von Hydrogelen mit neuen vielseitig und leicht zugängliche Bausteine, die eine minimale synthetische Verarbeitung erforderlich oder waren zu ihren breiten Einsatz als synthetische extrazelluläre Matrix im Handel erhältlich.14 Im einzelnen Peptide wurden modifiziert mit Allyloxycarbonyl (Alloc) -geschützten Lysine: eine für Anhänger, Integrin-bindenden Gruppen Zelladhäsion zu fördern [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] oder zwei für nicht abbaubare oder zell abbaubare Vernetzungen [K ( alloc) RGKGRKGK (alloc) G oder KK (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) K = Pep2Alloc jeweils]. Mit diesen Sequenzen wurden die Bedingungen für eine rasche Reaktion eingestellt (1-5 min) mit vierarmige thiol-modifizierten Poly (ethylenglycol) (PEG4SH) unter Verwendung cytocompatible Dosen von langwelligen UV - Licht (10 mW / cm 2 bei 365 nm) und der Photoinitiator Lithium-phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Die resultierenden Hydrogele waren stabil unter Zellkulturbedingungen für Wochen. Um Zellgetriebenen Abbau und Umbau, ein enzymatisch spaltbare Peptid innerhalb der Gel - Vernetzungen eingebaut wurde (dh GPQGIWGQ), 15 und Modell Primärzelle, humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) blieb hoch rentabel nach der Verkapselung ermöglichen und during Kultur innerhalb dieser Matrizen. Ferner wurden Peptide räumlich innerhalb dieser Materialien strukturiert und hMSCs lebensfähig bleiben und metabolisch aktiv unter Photopatterning Bedingungen. Alternate pendant Peptidsequenzen, hier nicht dargestellt (zB IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), können ebenfalls in Matrices eingearbeitet werden , um weitere Zell - Wechselwirkungen mit der umgebenden Mikroumgebung zu sondieren. Diese Ergebnisse sind vielversprechend für die Anwendung dieser Hydrogel-basierten Materialien für die dreidimensionale (3D) Zellkultur und Lieferung zu studieren und direkten Zell-Matrix-Interaktionen für eine Vielzahl von Zelltypen. Hierin Zellen Methoden photoencapsulate und anschließend photopattern biochemische Signale innerhalb des Hydrogels System vorgeschlagen werden dargestellt (Abbildung 1). Techniken zu beobachten und zu quantifizieren , werden diese photopatterns auch gezeigt: vor allem, i) die quantitative und qualitative Verwendung von Assay Ellman&#39;schen die modifica zu bestimmention von freien Thiolen innerhalb gemusterten Substraten und ii) dem komplementären qualitative Verwendung fluoreszierender Peptide (AF488Pep1Alloc) , diese Muster in drei Dimensionen zu beobachten. Des weiteren Tests zur Rentabilität (Live / Dead Lebensfähigkeit / Zytotoxizität-Färbung) und die metabolische Aktivität bestimmen (MTS, 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-Tetrazolium) vorgestellt, so dass Benutzer die cytocompatibility von photoencapsulation und Photopatterning Bedingungen für verschiedene Zelllinien innerhalb Hydrogelmatrices bestimmen können. Während das Protokoll für eine facile lichtbasierten Photoclick Hydrogelsystem gezeigt wird, können die Techniken auf zahlreiche andere radikalisch initiierte Hydrogelsysteme für photoencapsulation und Photostrukturierungs in Gegenwart von Zellen angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">Custom Peptides</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">4arm PEG Thiol, MW 20k</td>
			<td style="width:161px;">JenKem USA</td>
			<td style="width:123px;">4ARM-SH</td>
			<td style="width:331px;">Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate</td>
			<td style="width:161px;">Colorado Photopolymer Solutions</td>
			<td style="width:123px;">Li-TPO</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">Dimethyl Phenylphosphonite</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">149470</td>
			<td style="width:331px;">Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">682519</td>
			<td style="width:331px;">Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Lithium Bromide</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">213225</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">2-Butanone</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">360473</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Flask, Round Bottom, 100 mL</td>
			<td style="width:161px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1506-05</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit</td>
			<td style="width:161px;">Chemglass</td>
			<td style="width:123px;">CG-1402-L-02</td>
			<td style="width:331px;">Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Magnetic Stir Bars</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Magnetic Stirring and Hot Plate</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Vacuum Dessicator</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Deuterium Oxide</td>
			<td style="width:161px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:123px;">16630</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14190-250</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Fungizone</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15290-018</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15400-054</td>
			<td style="width:331px;">Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">1.5 or 2 mL sizes, sterile.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle)</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-823-16H</td>
			<td style="width:331px;">Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-544-1</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">High-Purity Silicone Rubber, 0.010&#34; Thick, 6&#34; x 8&#34; Sheet, 55A Durometer (Gasket)</td>
			<td style="width:161px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:123px;">87315K62</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Ethanol, 200 Proof</td>
			<td style="width:161px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:123px;">2701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">RainX, Original</td>
			<td style="width:161px;">Amazon</td>
			<td style="width:123px;">800002243</td>
			<td style="width:331px;">May be purchased from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SL2</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Photomasks</td>
			<td style="width:161px;">Advance Reproductions Corporation</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Photomask Division, different designs may be printed as desired.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">DTNB; Ellman&#39;s Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">PI-22582</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S5136</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E6758</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS</td>
			<td style="width:161px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">S318</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Orthophosphoric Acid</td>
			<td style="width:161px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:123px;">33266</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Cysteine Hydrochloride Monohydrate</td>
			<td style="width:161px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C7880</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:208px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td style="width:161px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">L-3224</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay</td>
			<td style="width:161px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">G3582</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Capable of speeds at 90-110 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Multiwell Plate Reader</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Epifluorescent or Confocal Microscope</td>
			<td style="width:161px;">Various Vendors</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Omnicure Exfo Series 2000</td>
			<td style="width:161px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Zeiss Zen Lite Software</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">ImageJ</td>
			<td style="width:161px;">NIH</td>
			<td style="width:123px;">----</td>
			<td style="width:331px;">Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-mediated formation and patterning of hydrogels for cell culture applications

Klicken Chemien wurden für die Verwendung in zahlreichen Biomaterialien Anwendungen, einschließlich der Arzneimittelabgabe, Tissue Engineering und Zellkultur untersucht. Insbesondere Licht vermittelte Klick-Reaktionen, wie photoinitiierte Thiol-En und Thiol-Alkin-Reaktionen, leisten räumlich-zeitliche Kontrolle über Materialeigenschaften und die Konstruktion von Anlagen mit einem hohen Maß an Benutzer gerichtet Eigenschaft Kontrolle ermöglichen. Herstellung und Modifizierung der Hydrogel-basierte Biomaterialien die Präzision durch Licht und der Vielseitigkeit von diesen Thiol-X Photoclick Chemien angeboten lieferte verwenden, sind von wachsendem Interesse, insbesondere für die Kultur von Zellen in gut definierten, biomimetische Mikroumgebungen. Hier beschreiben wir Methoden zur photoencapsulation von Zellen und die anschließende Photopatterning biochemischer Signale innerhalb Hydrogelmatrices mit vielseitig und modularen Bausteinen polymerisiert durch eine Thiol-En-Photoclick-Reaktion. Insbesondere wird ein Ansatz für die Zusammenarbeit vorgestelltnstructing Hydrogele aus Allyloxycarbonyl (Alloc) -funktionalisierten Peptid Vernetzungen und anhängenden Peptideinheiten und Thiol-funktionalisierten Poly (ethylenglycol) (PEG), die in Gegenwart von Lithium acylphosphinate Photoinitiator und cytocompatible Dosen von langwelligen ultravioletten (UV) Licht rasch polymerisieren. Facile Techniken Photostrukturierungs zu visualisieren und die Konzentration von Peptiden hinzugefügt quantifizieren beschrieben. Darüber hinaus werden Methoden zur Einkapselung von Zellen etabliert, insbesondere humanen mesenchymalen Stammzellen und ihre Lebensfähigkeit und Aktivität zu bestimmen. Während die Bildung und die anfängliche Strukturierung von Thiol-alloc Hydrogele hier gezeigt sind, können diese Techniken allgemein auf eine Reihe von anderen Licht und radikalisch initiierte Materialsysteme gemusterten Substraten zu erzeugen (beispielsweise Thiol-norbornen, Thiol-acrylat) angewendet werden.

Die Einrichtung und Verfahren photoencapsulate Zellen und anschließend photopattern Gelen eingekapselten Zellen enthält , die in Abbildung 1 dargestellt ist, und ein Beispiel für die Stammlösungen Herstellung einer 10 Gew% Gel zu bilden , in Tabelle 1 bereitgestellt. Unter Verwendung der Tabelle 1, die Menge an Monomeren (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) und Photoinitiator (LAP) erforderlichen Hydrogele polymerisiert wird berechnet. Auf der Grundlage dieser Berechnungen wurden Stammlösungen von PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc und LAP hergestellt und gemischt mit und ohne Pep1Alloc zur Bildung und Photopatterning Gele, bzw. (1A). Anschließend werden die Zellen von den Platten, gezählt und zentrifugiert , in geeigneten Mengen für die Verkapselung (1B) gesammelt. Das Zellpellet wird in gelbildende Lösung (Peptid / Polymer / LAP in PBS), und die Zelle / Monomer-Mischungen werden auf Glas oder Spritze mol übertragen resuspendiertds. Die Zellen werden innerhalb des Hydrogels bei Anwendung von Licht (1-5 Minuten von 10 mW / cm 2 bei 365 nm) (1C) eingekapselt. Für Photostrukturierungs (1D) werden Gele mit Pep1Alloc und LAP für 30 min bis 1 h und 30 min, wodurch die Diffusion des Peptids und Initiator in die polymerisierte Matrix getränkt. Diese Peptid-beladenen Gele werden mit Photomasken mit gewünschten Mustern bedeckt und auf eine zweite Dosis von Licht ausgesetzt (1 min), die die Peptide auf freie Thiole in der Matrix zu konjugieren. Anhänger Anbindehaltung sind nur kovalent in Regionen an das Gel gebunden Licht ausgesetzt, entsprechende Zell-Matrix - Interaktionen zu erleichtern und imitiert wichtigsten mechanischen und biochemischen Eigenschaften der nativen Zelle Mikroumgebung in Richtung Zellfunktion und Schicksal in - vitro - Untersuchung. Ellman-Test bietet eine einfache und kostengünstige Methode Gel Modifikation und Peptid Einarbeitung innerhalb von photopatte zu quantifizierenrned Substrate. Gemusterte und nicht strukturierte Gele (dh Gele mit oder ohne Peptid - Modifikation) werden in Ellman-Reaktionspuffer nach der Polymerisation durchtränkt. Als nächstes Cystein - Standards , und die in Puffer getränkte Gele werden in 48-Well - Platten gegeben und mit Ellman-Reagens (2A, links) inkubiert. Nach 1 Stunde und 30 Minuten wurden Aliquots von Proben werden in einzelnen Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, und die Extinktion wird bei 405 nm aufgezeichnet. Eine Kalibrierungskurve (2A, rechts) von den Cystein - Standards aufgetragen (Absorption vs Konzentration, linear fit), und die Menge der freien Thiole in Gele können auf der Grundlage ihrer Verdünnungsfaktor bestimmt werden. Diese freien Thiol - Konzentrationen für verschiedene Polymerisation und Photostrukturierungs Bedingungen einer 10 Gew% igen Gels sind in 2B gezeigt. Gele polymerisiert 1 oder 5 min ohne Pep1Alloc (blaue Balken, I = 1 min und II = 5 min) haben statistisch ähnlich frei Thiolkonzentrationen, was darauf hinweist tHut eine schnelle Reaktion auftritt und Gelieren ist innerhalb von 1 min (two-tailed t-Test, p&gt; 0,05). Somit zusätzliche Belichtung (2-5 Minuten) nicht zu einer weiteren Umwandlung von funktionellen Gruppen. Gele polymerisiert für 1 min ohne Pep1Alloc wurden mit Pep1Alloc (3 mg / ml) und LAP (2,2 mM) für 30 und 90 min (grüne Balken, II = 30 min und IV = 90 min) und ausgesetzt auf eine zweite Dosis von Licht durchtränkt für 1 min. Die Abnahme der freien Thiole (60-80% in Bezug auf die 1 min Zustand) zeigt effiziente Modifizierung von Gelen mit anhänge cues unter diesen Bedingungen. Wenn höhere Änderung gewünscht wird, erhöhte Konzentrationen von Pep1Alloc Lösung kann in die Zugänglichkeit von Pep1Alloc zu freien Thiolen verwendet werden stärker verdünnten Peptidlösungen Umwandlung begrenzen können; So haben wir, dass Konzentrationen von bis zu 20 mg / ml Pep1Alloc produzieren&gt; 90% Umwandlung von freien Thiolen gefunden. Einzigartig ist, können Muster von Peptiden an das Hydrogel hinzugefügtwerden schnell mit Ellman-Reagenz (3A, unter 5 min) abgebildet. Jedoch Visualisierung des Musters wird im Laufe der Zeit verloren (größer als 5 min) durch Diffusion des gelben TNB 2- Dianion durch das Gel. Zur Abbildungsauflösung und beobachten Muster in drei Dimensionen (x-, y-, und z-Ebenen) und in Gegenwart von Zellen, fluoreszierenden Peptidaddition (AF488Pep1Alloc) verbessern, können verwendet werden. In 3B x-, y- und z sind-Projektionen von Bildstapeln mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen gezeigt, was zeigt Musterauflösung (&amp; mgr; m - Skala). Ungefähr (94 ± 2)% und (94 ± 1)% der hMSCs innerhalb abbaubare Gele eingekapselt (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) lebensfähig bleiben (grüne Zellkörper) 1 und 6 Tage nach der Verkapselung jeweils mit wenigen toten Zellen (rot Kerne ) beobachtet (4A). Ferner wird bei 6 Tage nach der Einkapselung beobachtet hMSC Spreizung ( <st<html> rong&gt; 4A, Einschub), was darauf hinweist , dass die Zellen mit Integrin-bindenden RGDS modifiziert mit diesen MMP-abbaubaren Matrizen umzubauen und zu interagieren. Metabolischer Aktivitätstests an Zellen in nicht abbaubaren Gelen gekapselt ausgeführt (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 und 3 Tage nach der Einkapselung (4B) ein zweites Maß für die Lebensfähigkeit der Zellen liefern und zeigen , dass Zellen aktiv bleiben für die verschiedenen photoencapsulation und Photostrukturierungs Bedingungen getestet mit Ellman-Test (2B). Insbesondere gibt es keinen signifikanten Unterschied in der metabolischen Aktivität zwischen 30 min und 90 min Inkubationen mit Pep1Alloc + LAP (Bedingungen III und IV) und die anfängliche Verkapselung (Bedingungen I und II), was darauf hinweist, dass das Verfahren für den Einsatz von Photostrukturierungs geeignet ist, in das Vorhandensein von verkapselten Zellen (t-Test, p&gt; 0,05 two-tailed). 2fig1.jpg &quot;/&gt; Abb . 1: Einrichtung für Zellen innerhalb von Hydrogelen und anschließend Photopatterning mit biochemischen Cue (A) Stammlösungen von Makromeren und Photoinitiator hergestellt und gemischt (PEG4SH = Rückgrat, Pep2Alloc = vernetzen, Pep1Alloc = Anhänger Kleberest (RGDS) einzuschliessen LAP = Photoinitiator ). (B) Die Zellen werden für die Verkapselung gesammelt. (C) Die Zellen werden mit Makromer Lösungen gemischt , ohne oder mit Integrin-bindenden Peptide (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP oder PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP bezeichnet) und sind bei der Einwirkung von Licht verkapselt. (D) Die Gele überschüssigen Thiolgruppen während der Gelbildung enthält (hier PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, gebildet mit 2 mM überschüssigem Thiol) mit einer einzigen Alloc - Gruppe (Pep1Alloc beispiels funktionalisierten mit biochemischer Signale durch die anschließende Zugabe von Peptiden strukturiert werden, RGDS, IKVAV, etc.) Zelladhäsion zu förderninnerhalb spezifischer Regionen des Gels. Hier Strukturierung von Gelen mit fluoreszenzmarkierten RGDS angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> Fig . 2: Quantitative Ellman-Assay - Einrichtung und Ergebnisse Modifikation von gemusterten Hydrogele zu bewerten (A) Gele und Cystein Standards werden in 48-Well - Platten mit Ellman-Reagenz inkubiert. Eine lineare Standardkurve aufgetragen Cysteinkonzentration in Gel-Proben zu bestimmen. (B) überschüssige freie Thiole werden innerhalb Hydrogele während der Gelbildung inkorporiert und verbraucht bei der Musterbildung mit einem Anhänger alloc-Peptid (I = 1 min Polymerisation; II = 5 min Polymerisation; III = 30 min Inkubation mit Pep1Alloc; IV = 90 min Inkubation wi<html> th Pep1Alloc; sowohl III und IV polymerisiert und mit Licht für 1 min gemustert). Die dargestellten Daten zeigen den Mittelwert (n = 3) mit Fehlerbalken den Standardfehler zeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> Fig . 3: Ellman-Assay und Fluoreszenzbilder photostrukturierten Hydrogele zu visualisieren (A) Reagenz des Ellman kann schnell erkannt werden , Muster (Linien) in der x- und y-Ebenen (gelb = unstrukturierte Region, Maßstabsbalken = 1 mm). (; 200 &amp; mgr; m Maßstab; 10X Wasser-Tauchziel, Ex / Em 488/525 nm grün = gemusterten Region) (B) Fluoreszierende Peptide können in der x-, y- und z-Ebenen zu beobachten Muster verwendet werden.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . Abbildung 4: Viability und die metabolische Aktivität von Zellen in nicht abbaubaren photostrukturiert Hydrogele (A) Beispiel konfokalen Z-Stapel (z-Projektion; 10X Wasser-Tauchziel) der lebensfähigen (grün; Ex / Em 488/525 nm) und tot hMSCs (rot; Ex / Em 543/580 nm) eingekapselt Hydrogele 24 Stunden nach der Verkapselung (Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; m). Die Zellen verteilt innerhalb dieser Hydrogele 6 Tage nach der Verkapselung (kleines Bild Bild, Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m). (B) Zellen sind metabolisch aktiv 1 und 3 Tage (dunkle und helle Stäbe, beziehungsweise) post-Verkapselung für die verschiedenen Polymerisation (I = 1 min Polymerisation; II = 5 min Polymerisation) und Musterbedingungen (III = 30 min Inkubation mit Pep1Alloc ; IV = 90 min incubation mit Pep1Alloc; beide polymerisiert und für 1 min mit Licht strukturiert). Die dargestellten Daten zeigen den Mittelwert (n = 3) mit Fehlerbalken den Standardfehler zeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> Tabelle 1: Beispiel - Setup Volumen der Stammlösungen berechnen für Hydrogele Herstellung Zellen in der Tabelle , die blau markiert sind , zeigen benutzerdefinierte Parameter;. die übrigen Mengen werden auf der Grundlage dieser Einstellungen berechnet. Die endgültigen Volumen für jede Stammlösung ein Gel zu machen sind orange markiert. Die weißen Zellen enthalten Formeln verwendet, um die endgültige Volumen auf den benutzerdefinierten Parametern zu berechnen. Beachten Sie, dass eine Konzentration von 2,2 mM LAP bis 0,067 Gew% entspricht.

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Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.9K Aufrufe.  University of Delaware. We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented. 

Serie: Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Forschung

Biotechnik

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

Mesenchymale Stromazellen Zellkultur und Lieferung in Autologe Bedingungen: Ein intelligenter Ansatz für orthopädische Anwendungen

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...