This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. Sperrung Replikation mit FROS <ol><li> Induzierung der Replikation Verstopfungs <ol><li> Verdünnen Sie eine frische über Nacht Kultur eines E. coli Stamm , der ein tetO - Array und PKM1 18 bis OD 600 nm = 0,01 in einer verdünnten komplexen Medium (0,1% Trypton, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) mit Antibiotika Durchführung nach Bedarf zur Auswahl. Hinweis: Fügen Sie nicht Tetracyclin zur Auswahl, da es nicht mit diesem System kompatibel ist. Machen das Volumen der Kultur entsprechend 10 ml pro Probe erforderlich. Zum Beispiel ist das Kulturvolumen für die Versuchsplanung in 1 60 ml. </li><li> Wachsen bei 30 ° C unter Schütteln , bis die OD 600 nm = 0,05-0,1. Entfernen Sie eine 10-ml-Probe als nicht-induzierten Kontrolle zu dienen und mit 0,1% Arabinose zu der verbleibenden Kultur die Produktion von TetR-YFP von PKM1 zu induzieren. Weiter wachsen sowohl die nicht-induzierten und veranlaßteKulturen. Nach 1 Stunde überprüfen auf das Vorhandensein eines einzigen Brennpunkt innerhalb jeder Zelle der induzierten Kultur unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (siehe Abschnitt 2). </li><li> Wenn die induzierten Zellen bestätigt blockiert sind (mehr als 70% der Zellen einen einzigen Fokus), notieren Sie die OD 600nm und nehmen Sie eine 7,5 ml Probe für die Analyse von 2-D - Gelen (siehe Abschnitt 3). Nehmen Sie eine äquivalente Probe von der nicht-induzierten Kontrollkultur. </li></ol></li><li> Durch Loslassen der Replikation Verstopfungs <ol><li> Zum Lösen der Replikation Block, 100 ng ml -1 des unentgeltlichen Induktor Anhydrotetrazyklin (AT) zu einer 10 - ml - Probe der blockierten Zellen. Weiterhin bei 30 ° C für 10 min zu wachsen und Proben für die Zelldichte (1 ml), Mikroskopie-Analyse (10 ul) und neutral neutral 2-dimensional Agarose-Gelen (7,5 ml). </li></ol></li><li> Induzierende Zusammenbruch der replisome <ol><li> Wenn die Zellen ein temperaturempfindliches Allel wie dnaB ts oder dnaC ts enthalten, erfordert deactivation, bewegen Sie den Kolben, die blockierten Zellen auf 42 ° C enthält. Proben für Analyse zu Zeitpunkten erforderlich (beispielsweise 1 Stunde nach Inkubation). Nachdem die Zellen bei 42 ° C für 1 Stunde inkubiert wurden, verschieben sich die Zellen auf 30 ° C für 10 min (siehe Abbildung 1). Anmerkung: Die Zellen können auf 30 ° C für restart Analyse verschoben werden. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Abb . 1: Übersicht über die FROS Replikation blockieren und Freigabe Experimentelles E. coli - Stämme , die tetO - Array tragen , werden bei 30 ° C gezüchtet. Wenn die Zellen eine OD 600nm von über 0,05 zu erreichen, wird TetR-YFP Produktion mit Arabinose induziert (ara; 0,1%). Weiter eine Subpopulation von nicht-induzierten Zellen wachsen zu lassen als Kontrollen bei 30 ° C zu handeln. 2 Stunden (siehe 2.1) - Eine Probe der induzierten Zellen wird nach 1 über Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Wenn die Replikation istbestätigt blockiert werden, werden die Proben für die Reagenzgläser angezeigt 2-D-Gel-Analyse entnommen (siehe 3.1) und für Vitalitätstests (optional). Die Replikations Blockade kann mit Anhydrotetracyclin entfernt werden (AT; 0,1 &amp; mgr; g / ml) und die Zellen 10 min später analysiert. Wenn Zellen ein temperaturempfindliches Allel (zB dnaB ts) tragen, kann dies durch Verschieben der blockierten Zellen auf 42 ° C für eine angemessene Analyse inaktiviert werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Bereiten Sie eine Agarose-Pad durch Pipettieren von 500 ul geschmolzene Agarose (1% in Wasser) auf einen Objektträger; Overlay das Deckglas unmittelbar vor den Agarose verfestigt. Lagern Sie den Schieber (s) in feuchten Tüchern bei 4 ° C bis benötigt. </li><li> Wenn die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie das Deckglas aus dem Agarose-Pad und Pipette 10 ul BakterienKultur auf die Mitte des Kissens die Bewegung der Zellen während der Sichtbarmachung zu verhindern. Sobald die Probe (ca. 5 min) getrocknet ist, ersetzen Sie das Deckglas. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Deckglas und legen Sie die Folie unter der Optik. </li><li> Visualisieren Sie die Zellen unter Verwendung von Phase-Mikroskopie bei 100facher Vergrößerung. <ol><li> Auf der Acquire Dialogfeld innerhalb der Imaging-Software, stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms. Nehmen Sie das Bild von Acquire auswählen. Sie nicht auf die Bühne zu bewegen. Im Dialogfenster Acquire, wählen Sie YFP als Beleuchtung für den Außen Shutter-Kamera verbunden ist. Stellen Sie die exporsure Zeit bis 1000 ms. Schalten Sie das Bühnenlicht. Nehmen Sie das Fluoreszenzbild von Acquire auswählen. Hinweis: Zeit kann je nach Lichtquelle, Mikroskop und verwendeten Kamera. </li><li> Um die Phase und fluoreszierenden Bildern überlagern, wählen Sie Farbe aus dem Display-Menü zu kombinieren. Im Farb Kombinieren Dialogfeld wählen Sie das YFP Bild als grüne Komponente und dem Phasenbild als blue Komponente. Klicken Sie auf Farbe kombinieren. Bestimmen Sie, ob die Bevölkerung hatte die Replikation erfolgreich blockiert durch die Festlegung, ob die Mehrheit der Zellen pro Zelle ein Fokus haben. Anmerkung: Vergleich zu einer Probe von der Steuerung ohne Zusatz von Arabinose nützlich ist, um visuell den Unterschied in eYFP Produktion zu identifizieren. </li></ol></li></ol> 3. DNA-Extraktion / Agarose-Stecker <ol><li> Hinzufügen Natriumazid (Endkonzentration von 0,1%) zu den 7,5 ml Kulturproben aus den Schritten 1.1.3 und 1.2.1. Inkubieren auf Eis für mindestens 5 min. Hinweis: Natriumazid extrem giftig ist. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblatt vor Beginn der Arbeit und gehe es erst, wenn alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen 5000 × g für 10 min Zellen zu pelletieren. Überstand verwerfen und das Pellet in 200 ul Pett IV (PIV) -Puffer (10 mM Tris: HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Mikrozentrifuge (13 000 × g für 2 min) Zellen zu pelletieren. DiSCARD den Überstand. In diesem Stadium des Verfahrens die Pellets weiter oder bei -20 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit der niedrigsten Zelldichte in 50 ul PIV und bei 50 ° C. Bei allen anderen Proben, die Volumina der PIV einzustellen, die endgültige Zelldichte die gleiche in jedem Röhrchen (zB Probe 1 (OD 600nm = 0.128) in 50 &amp; mgr; l resuspendiert, Probe 2 (OD 600 nm = 0,138) resuspendiert in 54 &amp; mgr; l). <ol><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von frisch hergestellten 0,8% igen Lösung in PIV (Endkonzentration 0,4%; , z. B. Probe 1 50 ul Probe 2 54 ul). Stellen Sie sicher, dass die Proben, Agarose und PIV über 50 ° C sind Erstarrung zu verhindern. </li></ol></li><li> Behandeln eines Mikroskop-Objektträger mit 40 ul einer geeigneten Glas Wasser abweisend oder Silikonlösung. Reiben Sie die Folie mit einem Gewebe, bis es trocken ist. Hinweis: Dies kann im Voraus und die behandelten Folien gespeichert langfristig bei Raumtemperatur durchgeführt werden. </li><li> Legen Sie 20 ul Tropfen ter Zelle / Agarosesuspension auf der Folie Stecker zu produzieren, die halbkugeligen sind. Hinweis: Die erste Probe (resuspendiert in 50 &amp; mgr; l PIV) 5 Stecker auf einer Folie erzeugt. </li><li> Wenn die Pfropfen verfestigt haben, schieben sie sanft in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zugabe von 1 ml Zell-Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,2% Natriumdesoxycholat, 0,5% N-Lauroylsarcosin - Natriumsalz (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 Lysozym, 50 ug ml - 1 RNase A). Inkubieren bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Zell - Lyse - Puffer und 1 ml EDTA / Sarkosyl / Proteinase K (ESP) -Lösung (0,5 M EDTA, 1% N-Lauroylsarcosin - Natriumsalz (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 Proteinase K). bei 50 ° C inkubieren sind über Nacht oder bis die Stecker transparent. Wenn eine zweite Inkubation über Nacht erforderlich ist, ersetzen Sie die ESP-Lösung mit frischem Puffer nach etwa 18 Stunden. </li><li> Entferne dasESP-Puffer und die Stecker 5 mal mit 12 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) waschen 30 min Äquilibrierung mit jeder Wäsche ermöglicht. Lagerung bei 4 ° C in 1 ml TE-Puffer. </li></ol> 4. Neutral-neutral 2-dimensionale Gelelektrophorese <ol><li> Übertragen Sie eine Agarose-Stecker aus Schritt 3.8 in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 150 ul Restriktionsenzym-Puffer (1x Konzentration). 25-100 Einheiten Restriktionsenzym (beispielsweise 60 Einheiten EcoRV; (siehe 3A)). Digest bei 37 ° C für 6-8 Stunden. </li><li> Bei 4 ° C, gießen Sie ein 0,4% Agarose-Gel (300 ml) in 1x Tris / Borat / EDTA (TBE) in einen Gelträger von ca. 25 x 25 cm. etwa die gleiche Breite wie der Durchmesser des Steckers Setzen Sie einen Kamm Brunnen zu machen. Wenn das Gel gesetzt ist, nehmen Sie den Kamm und das Gel auf Raumtemperatur bewegen. </li><li> Schieben Sie eine der verdauten Agarose-Stecker in einen Brunnen, die Positionierung des Flachschiebers des Steckers gegen die Seite des Bohrlochs, wobei ter DNA wird in das Gel eintreten. Legen Sie einen einzelnen Stecker auf die gleiche Weise in jeder Sekunde gut. </li><li> Pipettieren geschmolzene 0,4% Agarose in die Vertiefungen der Stecker in Position zu versiegeln. </li><li> Last 1 kb DNA-Leiter in einem leeren gut, so dass wieder eine Lücke zwischen dem Leiter und Proben, und über Nacht laufen, das Gel (16 h, 55 V) in 1x TBE bei Raumtemperatur. </li><li> Beflecken das Gel in einem Wasserbad enthaltend Ethidiumbromid (0,3 &amp; mgr; g ml -1) für 20 min. Hinweis: Ethidiumbromid ein potenter mutagen und ein Toxin betrachtet wird. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblatt vor Beginn der Arbeit und gehe es erst, wenn alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. </li><li> Visualisieren Sie die DNA mit einem UV-Transilluminator langwellige und schneiden Sie jede Spur Fragment mit einer geraden, auch geschnitten, die Aufnahme von überschüssigem Agarose auf beiden Seiten der Bahn zu minimieren. Hinweis: Wenn beispielsweise das Fragment von Interesse 5,5 kb ist, geschnitten, um ein 7,5 cm-Fragment der DNA-Fragmente von 5 kb, umfassen approximately 12 kb (siehe 3A). </li><li> Legen Sie die ausgeschnittenen Gel Spur in einem Gelträger 90 ° zur Richtung der DNA-Migration. Hinweis: Zwei Reihen von 3 Gelfragmenten in einem 25 x 25 cm 2 Geltablett passen. Die erste Reihe von Gelspuren ist an der Spitze der Schale, die zweite Reihe bei 12,5 cm. </li><li> Bereiten Sie 300 ml Agarose für die zweite Dimension Gel (0,9% in 1x TBE mit 0,3 ug ml -1 Ethidiumbromid). Wenn der Agarose auf 50 ° C abgekühlt wird, das geschmolzene Agarose pipettieren um die Gelscheiben ihre Position zu verfestigen. Gießen Sie die restliche Agarose in die Schale bis zu einer Tiefe, die zumindest in Höhe der Gelschnitten ist. </li><li> Sobald das Gel erstarrt ist, Elektrophorese bei 4 ° C in TBE 1x , enthaltend 0,3 &amp; mgr; g ml -1 Ethidiumbromid bei 220 V , bis die DNA etwa 10 cm gewandert ist. Hinweis: 4 Stunden für ein 5,5-kb-Fragment ausreichend ist, aber ein kleineres Fragment wird weniger Zeit benötigen. </li><li> Excise die Blöcke, wo die genomische DNA vorhanden ist usingen den Rand eines Metalllineal, einschließlich dem Gel darüber die DNA enthalten , die nicht sichtbar sind (siehe Abbildung 3c). </li></ol> 5. Southern-Hybridisierung <ol><li> Herstellung der Lösung <ol><li> Bereiten Sie Depurinierung Puffer (0,125 M HCl-Lösung). Anmerkung: Dieser Puffer wieder verwendet werden kann und ist stabil bei Raumtemperatur für bis zu 1 Monat. </li><li> Bereiten Sie Denaturierungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH). Anmerkung: Denaturierungspuffer wiederverwendet werden kann, sobald und stabil für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Neutralisationspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Passen Sie auf pH 7,5 mit HCl. Anmerkung: Neutralisationspuffer einmal wiederverwendet werden kann und stabil für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten 10x Saline Sodium Citrate (SSC) Puffer (0,15 M Tri-Natriumcitrat, 1,5 M NaCl, pH-Wert 7 - 8) für die Verwendung in den Schritten 5.2.4 und 5.2.6. Von diesem Puffer, einen 2 × SSC Lager machen (für den Einsatz in Schritt 5.2.9). Hinweis: 10x SSC und 2x SSC einwieder stabil bei RT für 3 Monate. </li><li> Bereiten Modifizierte Church und Gilbert Hybridisierungspuffer 19 (0,5 M Phosphatpuffer [pH 7,2], 7% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM EDTA). Lassen bei 65 ° C gründlich vor auflösen zu verwenden. </li></ol></li><li> Übertragung <ol><li> Spülen Sie die ausgeschnittenen Gelblöcken in Depurination Lösung für 10 min bei RT auf einer Wippe oder Orbitalschüttler. Halten Sie die Bewegungsgeschwindigkeit niedrig zu vermeiden, die Agarose-Blöcke zu beschädigen. </li><li> Spülen Sie die Gelblöcken kurz mit destilliertem Wasser und dann mit einer Denaturierung Puffer für 30 min. Spülen Sie nochmals kurz in destilliertem Wasser und dann brüten die Gelblöcken in Neutralisierungspuffer für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Schneiden Sie eine Nylonmembran auf die genaue Größe des Gels (s). Schneiden Sie ein Nick in der oberen rechten Ecke bei der Ausrichtung der Membran in Zukunft Schritte zu unterstützen. Anmerkung: Zwei Gelblöcke (6 Proben) auf eine Membran sichtbar gemacht werden. </li><li> Gießen Sie genug 10x SSC in eine tray, so daß sie nicht über Nacht trocknen. Eine Plattform ca. 5 cm über dem Niveau des Puffers. Sättigen 3 Blatt 3 MM-Chromatographie-Papier mit 10x SSC und Platz auf der Plattform. Schneiden Sie die Chromatographie Papier so, dass es lang genug ist, an beiden Enden und breit genug, um in Puffer eingetaucht werden, um die Membran Gel zu passen. </li><li> Legen Sie das Gel (n) auf der Oberseite des gesättigten Chromatographie-Papier. Rahmen Sie das Gel mit Plastikfolie den Puffer unter Umgehung des Gels während der Übertragung zu verhindern. Vorsichtig legen die Schnitt Membran auf der Oberseite des Gels (s). Entfernen Sie Luftblasen zwischen der Membran und Gel durch eine Flasche oder serologische Pipette vorsichtig über die Membran rollen. </li><li> Schneiden drei Blatt 3MM Chromatographiepapier auf die gleiche Größe wie die Membran. Tränken Sie die Chromatographie Papierblätter mit 10x SSC und legen auf der Oberseite der Membran. Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich gebildet haben. </li><li> Stapel Papiertücher mindestens 5 cm hoch oben auf dem Löschpapier, gefolgt von einem festen Träger (approximate Gewicht von 1 kg für einen 23 x 16 cm-Membran). Lassen Sie den Transfer über Nacht ablaufen. </li><li> Belichten der Membran (DNA Seite nach oben) zu 1,200 J / m 2 UV die DNA an der Membran zu vernetzen. Sie nicht zu diesem Schritt vor spülen. </li><li> Spülen Sie die Membran gründlich in 2 × SSC zu hohen Hintergrund auf dem Blot Bilder verhindern. Verwenden Sie den Fleck sofort für die Hybridisierung (siehe 5.3) oder bei RT trocknen, wickeln Sie in der Plastikverpackung und lagern bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Hybridisation <ol><li> Vorheiz Hybridisierungsofen und Flaschen auf 55 ° C. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; g ml -1 Rinderserumalbumin (BSA) und 10 &amp; mgr; g ml -1 unspezifische DNA (beispielsweise Lachssperma - DNA) mit dem vorgewärmten Hybridisierungspuffer. </li><li> Um eine gleichmäßige Abdeckung des Hybridisierungspuffers ermöglichen, wenn die Membran aufgerollt wird, legen Sie den Fleck auf einen ähnlich großen Quadrat aus Nylon mit der DNA-gebundenen Seite der Membran Netz nach oben zeigt. Rollen Sie den Fleck entlang seiner langen Kante. Gleitender Blot / innen einer Hybridisierungsflasche ineinander greifen. Füge eine geeignete Menge vorgewärmten Hybridisierungspuffer des Blots (zB 30 ml für ein 23 x 16 cm 2 Membran) zu entrollen. </li><li> Inkubieren in einem vorgeheizten Ofen, um die Flaschen zu drehen, für 1 Stunde. </li><li> Bereiten Sie die Sonde durch 50 ng gereinigte PCR - Produkt homolog zu der Region von Interesse Mischen, 150 ng von zufälligen Hexamer - Primern, Puffer für Klenow - Fragment und H 2 O mit einem Volumen von 13 &amp; mgr; l zu machen. Kochen für 3 Minuten dann sofort auf Eis legen. 1 ul 1 mM dCTP / dGTP / dTTP - Mix, 1 ul Klenow - Fragment (5U) und 50 uCi Desoxyadenosin - 5&#39;-triphosphat radiomarkierten am alpha phosphat- (α 32 P-dATP). </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. 1 ul 1 mM dNTP mischen und 1 ul Klenow-Fragment. Inkubiere 20 min bei RT. </li><li> Boil-Sonde für 5 Minuten und fügen Sie sofort auf Hybridisierungsröhrchen. Hybridisierung über Nacht bei 55 ° C, mit einer Drehung. </li><li> Umfüllen probe von Membran. Anmerkung: Die Sonde der Lage ist, einmal wiederverwendet zu werden. </li><li> Spülen Sie die Membran kurz in vorgewärmten, niedriger Stringenz-Waschpuffer (2x SSC, 0,1% (w / v) SDS). In frischen niedriger Stringenz-Waschpuffer und Inkubation für 5 min bei 55 ° C mit Rotation. Wiederholen. </li><li> Zweimal waschen in mittlerer Stringenz-Waschpuffer (1x SSC, 0,1% (w / v) SDS) für 10 min bei 55 ° C mit Rotation. </li><li> Zweimal waschen in hoher Stringenz-Waschpuffer (0,1X SSC, 0,1% (w / v) SDS) für 5 min bei 55 ° C mit Rotation. </li><li> Entfernen Sie die Membran und tupfen mit Gewebe überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Wickeln in Plastikfolie sicherzustellen gibt es keine verbleibende Feuchtigkeit auf der Plastikfolie und in Belichtungskassette mit einer vorgeblendeten Speicherleuchtstofffolie. Schließen Sie die Kassette und setzen mindestens 2 Stunden vor der Visualisierung für eine Phosphor-Imager verwendet wird. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most common impediment to replisomes in living cells is a nucleoprotein block2. However, two longstanding difficulties in studying the collision of a replisome with a nucleoprotein blockage have been how to localize the event to a known position on the chromosome and how to make the event frequent enough to allow detailed analysis. The majority of the knowledge of how E. coli copes with stalled/collapsed replication forks comes from the use of UV as a DNA damaging agent. 
The FROS protocol described here is a novel way of creating a site-specific nucleoprotein roadblock, similar to what the replisome will meet when it encounters proteins tightly bound to the chromosome during replication. The induced blockage and controlled release of this block allows the stages of DNA processing to be studied in discrete steps. The array of tetO sites used to block replication has previously been utilized to visualize chromosome organization9,10. While the array can be placed anywhere in the chromosome, for the purpose of the array described here, it should be distant from both the origin and the terminus to avoid complications in interpreting the signals observed from second rounds of initiation at the origin or from the replication fork proceeding around the opposite replichore. By optimizing the overproduction of TetR with the use of the dilute complex medium (protocol 1), we have found that sufficient TetR is produced to create a complete replication blockage that is stably maintained, while limiting the number of new rounds of replication that are initiated. The incorporation of replisome temperature sensitive mutations22 into the system ensures all replisomes are deactivated simultaneously and uncontrolled replisome reloading is prevented.
Whilst the number of foci per cell are useful for knowing the cell's replication status, the most enlightening data for DNA repair is from the analysis of the replication intermediates revealed by 2-D gel electrophoresis during an active replication blockage. Analysis of different genetic backgrounds can identify proteins involved in processing and restart of collapsed replication forks by the different patterns observed following the 2-D gel protocol. Further, intermediates from the processing of collapsed replication forks can be present at the array region or in the DNA upstream of the array, and can be visualized using 2-D gel electrophoresis. Creating duplicate agarose plugs (Protocol 3) has the advantage of allowing for digestion of the same sample with different restriction enzymes to be able to visualize replication intermediates in successive DNA regions. Therefore, the array region should be located in a position where appropriate restriction enzymes can be used to probe these regions of interest using Southern hybridization. 
The most common reasons that this technique may be unsuccessful are having either too little DNA which produces faint signals compared to background, or incomplete digestion of the DNA within the plugs. This can be caused by having too much DNA in the agarose plugs or the carry-over of some inhibitor from the lysis/washing steps. The number of cells taken for lysis within the agarose plugs may need to be varied from the protocol described here if modifications such as growth media are changed. However, it is futile to continue with the hybridization if the DNA in the plugs has not digested to completion. A repeat treatment of ESP may be required to better prepare the DNA (protocol 3.6). 
If the replication intermediates that are of interest are only transient, or are particularly rare within the cell, the DNA sample may need to be enriched for them, for example with the use of BND-cellulose which will bind short stretches of single stranded DNA, such as those found in replicating chromosomes23. Stabilization of replication intermediates by crosslinking with psoralen has also been used as a method of preserving DNA integrity24. When the intermediates are rare, it is important to optimize the probe and blocking of the membrane to prevent background signals from interfering. On completion of the blots the signals may be quantified with appropriate image processing software.
The protocol described here is an optimized system for creating a site-specific nucleoprotein blockage and analyzing replication intermediates when the replisome is unable to proceed through the blockage. With the establishment and optimization of this technique, the roles of various helicases and recombination proteins in processing the replication fork and in allowing the restart of replication can be identified. By varying the genetic background, the effect of the absence of these proteins can be analyzed. However, this technique is limited by requiring not only viable strains but strains that are also able to overproduce TetR at a rate that will create a stable nucleoprotein blockage.

Während der DNA-Replikation, steht die replisome Hindernisse auf der DNA, die ihr Fortschreiten beeinträchtigen. DNA - Schäden , einschließlich Läsionen und Lücken sowie anomale Strukturen können die replisome , fortzusetzen 1 zu verhindern. Vor kurzem wurde gefunden , dass an die DNA gebundenen Proteine ​​die häufigste Quelle für Hindernis sind 2 fork Progression Replikation. Das Wissen über die Ereignisse im Anschluss an die Begegnung der replisome mit einem Nukleoprotein Block an einem bekannten Ort durch die Unfähigkeit beschränkt zu induzieren einen solchen Block in das Chromosom einer lebenden Zelle vorher. In - vitro - Analyse unser Verständnis der kinetischen Verhalten wurde verbessert einer aktiven replisome , wenn es eine Verstopfung Nukleoprotein 3, sowie die mechanistischen Details der replisome selbst 4,5 erfüllt. Das aktuelle Verständnis der Reparatur der Replikation wird in der Regel mit UV als schädigende Mittel vorgenommen und untersucht in vivo unter Verwendung von Plasmid - DNA 6-8 </sup&gt;. Während die Proteine ​​, die in der Reparatur von DNA beteiligt sein können , nachdem er eine in vivo - Nukleoprotein Block begegnet werden in der Regel aus diesen Studien verstanden, ob es Unterschiede in den molekularen Vorgänge innerhalb der Reparaturwege aufgrund der deutlichen Ursache in der Replikationsblock sind noch noch ist bestimmt werden. Hier beschreiben wir ein System, das ein Nukleoprotein Block ermöglicht in einer bestimmten Stelle des Chromosoms hergestellt werden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS). Wir verwenden einen Stamm von E. coli , das ein Array von 240 tetO - Stellen in das Chromosom eingebaut 9 hatte. Jede tetO - Stelle innerhalb des Arrays hat eine 10 bp Zufallssequenz flankieren sie die Stabilität der Anordnung zu erhöhen durch RecA-vermittelte Rekombination innerhalb des Arrays zu verhindern. Dieses Array, und Variationen davon, wurden ursprünglich verwendet , um E. verstehen coli Chromosom Dynamik 10,11 aber wurden dann preve angepaßtnt in vivo - Replikation 12. Das Array wurde gefunden, stabil aufrechterhalten werden und nahezu 100% der Replikationsgabeln zu blockieren , wenn sie von TetR 10,12 gebunden. Die Verwendung des ähnlichen lacO Array in vitro hat , so wenig wie 22 gefunden Seiten ausreichend waren 90% der Replikation zu blockieren, obwohl dies kürzere Anordnung weniger effektiv war in vivo 13. Um das Array anzupassen eine Nukleoprotein Blockade zu schaffen, muss das Repressor-Protein hoch werden unter optimierten Bedingungen überproduzierte wo es dann an das Array bindet eine Straßensperre zu schaffen. Die Bildung der Blockade, und seine anschließende Freisetzung können durch die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden, wenn ein fluoreszierend markiert Variante des Tet-Repressor verwendet wird. Der Status der Replikation in jeder Zelle wird durch die Anzahl der Foci gesehen angedeutet, wo ein einzelner Brennpunkt bedeutet nur eine Kopie des Arrays innerhalb der Zelle vorhanden ist und mehrere Brennpunkte sind kennzeichnend für aktive Replikation. Diese aktive Wiederdung wird aktiviert, wenn das Nukleoprotein Blockierung durch die Zugabe des gratuitous Induktor umgekehrt wird, die die Bindungsaffinität von TetR für die Operatorstelle abnimmt ausreichend für die replisome durch das Array fortzufahren. Das Repressor-Protein ist noch in der Lage mit einer ausreichend hohen Affinität an die DNA zu binden, die nun mehrere Kopien der Array sichtbar gemacht werden kann. Weitere komplizierten Details der Ereignisse können an der Nukleoprotein Blockade 14-16 mit neutral-neutral zweidimensionalen Agarose - Gelelektrophorese und Southern - Hybridisierung werden entdeckt. Diese Techniken erlauben die Analyse von DNA-Strukturen in der Bevölkerung. Die Replikationszwischenprodukte, die während des Ereignisses gebildet sind und bleiben potentiell unrepaired können visualisiert werden. Durch Variation der Restriktionsenzym und die Sonde verwendet wird , können die Zwischenprodukte dargestellt werden , nicht nur in dem Feldbereich , sondern auch stromaufwärts des Arrays , wenn der Replikationsgabel 17,18 zurückbildet. DasRegression nimmt an den replisome Dissoziation nachfolgenden platzieren; die führenden und hinken im Entstehen begriffenen Stränge getrennt von den Template-Stränge und Ausheilen miteinander, wie die Template-Stränge gleichzeitig erneut Glühen in einer DNA-Struktur Vier-Wege resultierende (a Holliday). Unter Verwendung dieses Systems hat sich gezeigt , dass der Replikationsgabel nicht stabil ist , wenn es diesen Block 18 stößt. Darüber hinaus können Derivate von replisome Komponenten empfindlichen Temperatur Neuladen der Replikationsgabel zu verhindern, verwendet werden, wenn es zusammengebrochen ist. Sobald ein Block hergestellt wird, kann die Belastung auf eine nicht-permissive Temperatur verschoben werden, um ein synchrones Abschalten der replisome und eine kontrollierte Prävention Nachladen zu gewährleisten. Diese temperaturbedingten Deaktivierung gewährleistet alle der Gabeln in der Bevölkerung zu einer gegebenen Zeit zusammengebrochen sind und ermöglicht die Bewertung dessen, was geschieht, wenn der replisome kollabiert, wie die DNA verarbeitet wird, und dem, was erforderlich ist, um wiederden Prozess der DNA-Replikation starten. Ein Vorteil der hier beschriebenen System ist, dass das Nukleoprotein Block vollständig reversibel ist; Daher wurde die Fähigkeit der Zellen aus dem Nukleoprotein Block wiederherzustellen der Lage ist, zu folgen. Die Zugabe von Anhydrotetrazyklin zu den Zellen wird die enge Bindung des Repressor entlasten, so dass eine Replikationsgabel zu gehen durch und die Lebensfähigkeit der Zellen wieder zu erlangen. Das Relief der Blockade kann durch neutrale neutralen zweidimensionalen Agarose-Gelelektrophorese nach 5 min, und durch Mikroskopie innerhalb von 10 min sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus kann die Lebensfähigkeit Analyse die Fähigkeit des Stammes offenbaren aus der Replikations Blockade zu erholen und weiter zu vermehren. Durch Veränderung des genetischen Hintergründe der in dem experimentellen Verfahren verwendeten Stämme hier beschrieben, können die Reparaturwege für diese Art von Blockierung erläutert.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>For induction of TetR-YFP production</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Release of replication bloackage</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>eYFP filter set</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualization of YFP</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp; Software (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>For agarose plug manufacture</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, TBE buffer component</td></tr><tr><td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bacteriostatic agent</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE buffer component</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Cell lysis and ESP buffer component</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP buffer component</td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Electrophoresis system</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE component</td></tr><tr><td>Hybond-XL nylon memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td></tr><tr><td>3MM Whatman chromatography paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Crosslinking of DNA and hybridization</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Denaturation buffer component</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wash buffer component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Random Hexamer Primers</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualization of blot</td></tr><tr><td>Hybridization bottle</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

Hindernisse, die auf DNA, einschließlich fest gebundene Proteine ​​und verschiedene Läsionen, kann das Fortschreiten der Zelle Replikationsmaschinerie stark hemmen. Das Abwürgen eines replisome kann aus dem Chromosom zu seiner Dissoziation führen, entweder teilweise oder vollständig, um den Zusammenbruch der Replikationsgabel führt. Die Erholung von diesem Zusammenbruch ist eine Notwendigkeit für die Zelle genau vollständige Chromosomen Vervielfältigung und anschließend unterteilen. Daher wird, wenn der Zusammenbruch auftritt, hat die Zelle verschiedene Mechanismen entwickelt, die stattfinden, um die DNA Gabel und erlauben die Replikation wiederherzustellen mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden. Zuvor wurden diese Replikationsreparaturwege in Bakterien unter Verwendung von UV-Schäden untersucht, was den Nachteil hat, nicht auf einen bekannten Ort lokalisiert ist. Dieses Manuskript beschreibt ein System mit einem Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS) unter Verwendung eines ortsspezifischen Protein Block zu erstellen, die ein Abwürgen und Zusammenbruch der Replikation induzieren kann foRKS in Escherichia coli. Protokolle Detail, wie der Status der Replikation kann in einzelnen lebenden Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und DNA-Replikationszwischenprodukte dargestellt werden kann durch 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden. Temperaturempfindlichen Mutanten von replisome Komponenten (zB DnaBts) können in das System eingebaut werden , um einen synchronen Kollabieren der Replikationsgabeln zu induzieren. Ferner sind die Rollen der Rekombinationsproteine ​​und Helikasen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, können unter Verwendung von genetischen Vorprägungen in diesem System untersucht werden.

Die FROS ein induzierbarer, ortsspezifische Nukleoprotein Block, der Replikationszwischenprodukte ermöglicht 12,18 in lebenden Zellen visualisiert werden. Eine allgemeine experimentelle Design für Zellen Abtasten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Zeitpunkt der Probenahme und Variationen in der genetischen Hintergrund dieses machen ein vielseitiges System für die Reparatur eines solchen Blocks zu studieren. Die schematische veranschaulicht , wie temperaturempfindlichen Mutanten, wie dnaB ts und dnaC ts , die in diesem System bisher 18, verwendet werden kann , verwendet wurden. Die Induktion der FROS wurde in einem E. durchgeführt coli - Stamm , wie in Figur 1 gezeigt für nicht-temperaturempfindliche Stämme. Um zu bestätigen, dass ein Nukleoprotein Block wurde bereits festgelegt wurden die Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie nach 1 Stunde von Wachstum in 0,1% Arabinose sichtbar gemacht. DiesZeitraum ist in der Regel ausreichend, um den Block in einem Wildtyp-Stamm zu produzieren, aber anspruchsvoller Stämme können Optimierung erfordern. Die Mehrzahl der Zellen enthalten 1 Fokus (2A + ara), innerhalb der Zelle nur eine Kopie des Arrays entspricht , wodurch die Replikation anzeigt , blockiert worden waren. Die Zahl der Zellen mit 1 Fokus, 2 Herde oder mehr als 2 Foci wurden in einer Bevölkerung von mehr als 100 Zellen gezählt. 92% der Zellen wurden Fokus haben 1 mit dem restlichen 8% mit 2 Herde gefunden. Es wurde angenommen, dass Zellen, die zwei Brennpunkte weit voneinander beabstandet waren, die zwei Kopien des Arrays würden blockiert die nächste Runde der Replikation haben. Zellen, die mit zwei Brennpunkten bedeuten nahe beieinander, dass das Array vor kurzem repliziert wurde und das Nukleoprotein Block noch nicht erreicht hat. Der Nukleoprotein Block wurde durch Zugabe von Anhydrotetracyclin (AT) und nachfolgende Vervielfältigung des Arrays wie die visualisierten umgekehrtAnreicherung von Zellen mit mehreren Brennpunkten (2A + ara / AT). Mehrere Brennpunkte innerhalb einer Zelle durch Fluoreszenz sichtbar gemacht Mikrokopie des Arrays bedeuten wurde erfolgreich repliziert und genügend Zeit vergangen ist die Orte zu ermöglichen auseinander zu bewegen, jede Schwester-Chromosom Zusammenhalt zu überwinden, die vorhanden war. In diesem Fall 10 Minuten nach der Zugabe von AT, 94% der Zellen wiesen zwei oder mehr Brennpunkte und bis zu 8 Foci pro Zelle sichtbar gemacht wurden. Um sicherzustellen , dass das Nukleoprotein Block tatsächlich Replikation hemmte, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen untersucht (Figur 2B). Zellen, die von den FROS inhibiert die Replikation hatten zeigen eine etwa 1000fache Abnahme der koloniebildenden Einheiten im Vergleich zu den Zellen bilden, die nicht in Gegenwart von Arabinose gezüchtet wurden. Zellen, die wurden anschließend in Gegenwart von Anhydrotetrazyklin zeigen Umkehrung dieses Wachstumshemmung gewachsen. Wenn die Zellen nicht in der Lage waren, die DNA nach der Freigabe zur Reparaturder Nukleoprotein Blockade würde eine Verringerung der Lebensfähigkeit. Zur Visualisierung können die Replikationszwischenprodukte, Zellen in Agarose-Stopfen lysiert werden und das Protein und RNA entfernt. Die DNA kann dann mit einem geeigneten Restriktionsenzym für die interessierende Region verdaut werden. DNA dargestellt in 3A wurde mit EcoRV verdaut , die die DNA unmittelbar vor der Anordnung schneidet, innerhalb der Anordnung und nach dem Array 5,5 kb und 6,7 kb Fragmente in dem interessierenden Bereich (3B) zu ergeben. Die Fragmente sind ideal ~ 3-7 kb für das Protokoll hier beschrieben. Fragmente außerhalb dieses Bereichs können eine Veränderung der Agarose-Konzentrationen verwendet, und die Elektrophorese-Bedingungen erfordern eine gute Trennung zu erzielen. Die DNA wurde in der ersten Dimension und visualisiert (3A) elektrophoresiert. Wenn die DNA vollständig verdaut hat, haben alle Bahnen laufen gleichmäßig, und es wirdeine hohe Menge an niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 3 kb, auf dem Restriktionsenzym abhängig). DNA, die in der gut schlägt vor, unvollständige Zell-Lyse und eine Menge hochmolekulare DNA (über 10 kb) impliziert unvollständige DNA-Verdauung. Die DNA von Interesse in jeder Spur herausgeschnitten wurde. In 3A wurde DNA über 5 kb enthalten. Die anschließende zweite Dimension des Gels wurde elektrophoresiert, was zu einer Diagonale von linearen DNA (3C). Die Array - DNA innerhalb dieses Gel wurde dann durch Southern - Hybridisierung (Figur 3D) sichtbar gemacht . In der unblockierten (- ara sample), zwei Flecken können entsprechend den 5,5 kb und 6,7 kb Fragmente der Anordnung zu sehen ist, werden, wie erwartet. Die Probe, die die Replikation (+ ara) blockiert waren, zeigten eine Abnahme der 5,5 kb Stelle im Vergleich und die Zugabe eines elliptischen Signal, eine Anhäufung von Y-förmigen DNA in der Probe anzeigt. Das Signal istlokalisiert auf eine Position, was bedeutet, die Replikationsgabeln in der Bevölkerung in einer ähnlichen Stelle verhaften. Bei Zugabe von anhydrotetracyline kann das Y-förmige DNA-Signal nicht mehr gesehen werden. Eine kürzlich Neustart wird durch das Vorhandensein eines Signals des gesamten Y-arc angegeben, darstellend die Gabeln durch die Region migrieren. Es ist wichtig, die DNA innerhalb jedes Agarose Stecker zu normieren die Signale der Proben selbst zu gewährleisten. Die Signale können mit entsprechenden Imaging-Software quantifiziert werden. Ein weiteres gemeinsames Zwischen gesehen ist, dass anzeigt, Holliday (HJ) Bildung. A HJ als Kegel - Signal an der Oberseite des Y-Lichtbogens und einer Spitze von der linearen DNA am Ende des Y arc (Abbildung 3D) sichtbar gemacht . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig2.jpg" /> Abbildung 2: Fluoreszenzmikroskopie und Viab<html> ility. (A) Ein E. coli Stamm , der die tetO - Array trägt , wurde bei 30 ° C in Gegenwart von 0,1% Arabinose (+ ara) für 1 h gezüchtet und dann Anhydrotetracyclin (AT) wurde für 10 min auf eine Subpopulation hinzugefügt , um den Replikationsblock freizugeben. Repräsentative mikroskopische Aufnahmen sind für YFP Produktion (oben) gezeigt. Maßstabsbalken = 2 &amp; mgr; m. Der Anteil der Zellen, die 1, 2 oder mehr als 2 Foci wurden aufgezählt und sind als Prozentsatz (unten) dargestellt. (B) Zellen in Abwesenheit von Arabinose gezüchtet (- ara) mit Arabinose (+ ara) und beide mit Arabinose und Anhydrotetracyclin (AT; 10 min) wurden seriell verdünntem 10fache und entweder spotted oder verteilt auf Agar Ampicillin nur die ( - / + ara Proben) oder Ampicillin mit Anhydrotetracyclin (+ aT Probe) und bei 30 ° C gezüchtet die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Oben: repräsentative Platte zum angegebenen Verdünnungen Wachstum zeigt. Unten: Diagramm, das die durchschnittliche KBE / ml +/- SEM zeigt.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig3.jpg" /> . Abbildung 3: Visualisierung der DNA - Replikation Intermediates bei einem Nucleoprotein - Block (A) genomischer DNA aus Zellen (1, - ara, 2, + ara, 3, + ara / AT) , die in Agarose - Stecker und verdaut mit EcoRV Restriktionsenzym lysiert wurde auf einem 0,4% Agarosegel aufgetrennt (55 V, 16 h). 3 kb, 5 kb und 10 kb Banden sind angegeben. Die DNA über dem 5 kb Marker wurde durch die weißen Felder wie angegeben ausgeschnitten. (B) Schematische Darstellung des EcoRV Digest der Array - Region. Replikationsgabeln das Array vom Ursprung innerhalb des 5,5 kb-Fragments blockiert werden eintritt, wenn die Zellen in Gegenwart von Arabinose angebaut. Die Restriktionsstellen durch Pfeile angegeben genutzt und der array ist als Kasten mit Linien dargestellt. (C) Die ausgeschnittene DNA wurde um 90 ° gedreht und in einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt (220 V, 4 h). Das weiße Feld zeigt die Exzision der DNA nach der Trennung. (D) Der Anordnungsbereich wurde anschließend durch Southern - Blot - Analyse unter Verwendung einer radioaktiven Sonde mit dem Anordnungsbereich visualisiert. Zellen , die mit einem Replikationsblock an dieser Position wird das Signal entsprechend dem 5,5 - kb - Fragment auf der Y-Bogen gelegen haben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54434/54434fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54434/54434fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

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Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

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Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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Genetik

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Biotechnik

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite this similarity, these bacteria show extreme variations in characteristics like growth behavior, intensity of light emission or regulation of bioluminescence. The method presented here is a newly developed assay that combines recording of cell growth and bioluminescent light emission intensity over time utilizing a plate reader. The resulting growth and light emission characteristics can be linked to important features of the respective bacterial strain, such as quorum sensing regulation. The cultivation of a range of bioluminescent bacteria requires a specific medium (e.g., artificial sea water medium) and defined temperatures. The easy to handle, non-bioluminescent standard-research bacterium Escherichia coli (E. coli), on the other hand, can be cultivated inexpensively in high quantities in laboratory scale. Exploiting E. coli by introducing a plasmid containing the whole lux operon can simplify experimental conditions and additionally opens up many possibilities for future applications. The expression of all lux genes utilizing an E. coli expression strain was achieved by construction of an expression plasmid via Gibson cloning and insertion of four fragments containing seven lux genes and three rib genes of the lux-rib operon into a pET28a vector. E. coli based lux gene expression can be induced and controlled via Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) addition resulting in bioluminescent E. coli cells. The advantages of this system are to avoid quorum sensing regulation restrictions and complex medium compositions along with non-standard growth conditions, such as defined temperatures. This system enables analysis of lux genes and their interplay, by the exclusion of the respective gene from the lux operon, or even addition of novel genes, exchanging the luxAB genes from one bacterial strain by another, or analyzing protein complexes, such as luxCDE.

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent bacteria regulate light production through a variety of mechanisms, such as quorum sensing. This novel method allows the in situ investigation of bioluminescence and the correlation of light emission to cell density. An artificial bioluminescent Escherichia coli system allows the characterization of lux operons, Lux proteins, and their interplay.

In Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von Biolumineszenten Bakterien

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Biochemie

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Biologie

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Live-Cell-Bildgebung der Transkriptionsaktivität an DNA-Doppelstrangbrüchen

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

CRISPR Interference-Based Gene Silencing: A Technique for Targeted Repression of Gene Function in Pathogenic Leptospira

Source: Fernandes, L. G. V., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62631">Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a CRISPR interference-based gene silencing in pathogenic Leptospira. Targeted repression of gene expression using a CRISPR/Cas system that blocks mRNA formation helps identify candidate genes for pathological and pharmacological studies.

CRISPR-Interferenz-basiertes Gen-Silencing: Eine Technik zur gezielten Unterdrückung der Genfunktion in pathogenen Leptospiren

Source: Fernandes, L. G. V., et al. Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira. J. Vis. Exp. ...

Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in

Zusammenfassung

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