Wir wünschen den Stand der Mitglieder des Ross-Labor zu erkennen, die das Protokoll für maximale Effizienz und die Erträge zu optimieren geholfen haben.

1. Mammalian Expression System zur Erzeugung von Influenza H3N2 VLP <ol><li> Subklon viralen Struktur Glykoproteine ​​Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Human Immunodeficiency Virus (HIV) Gag p55 in eukaryotische Expressionsvektoren, wie zuvor beschrieben pTR600. 7 </li><li> Amplify DNA in chemisch kompetente Escherichia coli (zB DH5a) und zu isolieren , die Transfektion-grade - Plasmid ein Plasmid - Reinigungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . DNA-Menge ist abhängig von Ertrag und Anforderungen des Benutzers. </li><li> Pflegen Säugerzelllinie, 293T, in Wachstumsmedium , enthaltend 10% fötales-Rinderserum (FBS) bei 37 ° C mit 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Zellen wachsen , so dass ein T-150 - Gewebekulturkolben 45-75 x 10 6 Zellen pro Kolben enthält , so dass Kolben vollständige Zellhaftung und 85-95% Zellkonfluenz durch die folgenden Tag erhält. Untersuchen Zellen unter dem Mikroskop für die gewünschte confluparenz. Hinweis: Hochzelldichte wird in der Regel eine optimale Proteinexpression mit minimaler Zytotoxizität ergeben empfohlen, wenn es um kommerzielle Transfektionsreagentien jedoch über Konfluenz unter Verwendung von Nebenprodukten in Akkumulation von zellulären Abfällen führen kann und die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren. </li><li> Am Tag der Transfektion vorbereiten Liposomen und DNA-Gemisch gemäß den Empfehlungen des Herstellers und DNA-Zellen mit einer DNA-Zusammensetzung von 1 transfizieren: 1: 2 von HA: NA: Gag mit einer Gesamt-DNA-Menge von 40 ug pro T-150-Kolben. Verdünnte DNA und Liposomen-Lösungen in serumfreiem Transfektionsmedium ohne Antibiotika, so dass jeder Kolben mit einem Gesamtvolumen von 20 bis 30 ml enthält. Hinweis: Verhältnis der Genkonstrukte können Benutzer Optimierung erfordern. 1-Verhältnis: Obwohl hier nicht gezeigt, eine ähnliche Transfektionsverfahren mit Respiratory Syncytial Virus (RSV) F und HIV Gag wurde bei einer 1 durchgeführt. Für DENV und CHIKV einzelnen Expressionsplasmide, insgesamt 20 &amp; mgr; g DNA pro T-150-Kolben werden für optimale e verwendetxpression. DNA: Transfektionsreagenz Verhältnisse sind Anwender optimiert. Verwendung empfohlen Transfektionsmedium basierend auf Transfektionsverfahren, dh polykationischen Lipids Transfektionen Reduktion oder Abwesenheit von fötalem Rinderserum empfehlen daher mit Wachstumshormonen und Spurenelemente ergänzt werden können Medien Wachstum in Abwesenheit von Serum zu unterstützen. </li><li> Rückkolben auf 37 ° C mit 5% CO 2 -Inkubator. Bei einem Volumen von 200 ml, verwenden 9 T-150 Flaschen. Die Zellen werden in der Transfektion Kulturmedium bis zum Tag der VLP Ernte gehalten. </li><li> Ernte-Kulturüberstand von Zellen nach 72-96 Stunden nach der Transfektion auf Antigen-abhängig, oder wenn die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auf 70-80% verringert, wie durch mikroskopische Untersuchung geschätzt. Übertragungsüberstand in 50 ml konische Röhrchen und spin die Zellen nach unten bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu pelletieren. Hinweis: Ersatz von 3 Tage Überstand mit frischem vorgewärmten, Serum-freien Transfektionsmedien zu adhärenten Zellen werden yielda zweite Menge von VLPs mit ähnlichen oder leicht verminderte Ausbeute und sollten durch Anwender optimiert werden. </li><li> Pool Überstand und filtriert durch ein 0,22 um Porenmembran vor der Sedimentation mittels Ultrazentrifugation. </li><li> Testen Sie die Hämagglutinationsaktivität der HA-exprimierenden VLPs durch Standard Hämagglutinationsassay 14 0,8% Pute oder roten Blutkörperchen von Säugetieren oder gehen Sie mit Antigen-spezifischen ELISA. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Ergebnisse. </li></ol> 2. CHIK VLP Expression unter Verwendung von Baculovirus / Insektenzellen-System <ol><li> Generieren rekombinanten Baculovirus exprimiert Chikungunya-Virus-Kapsid und Hüllproteine ​​(C-E3-E2-6K-E1) von S-27-Stamm Kommerzielle Baculovirusexpressionssystems verwenden. </li><li> Kultur Spodoptera frugiperda Sf9 - Zellen in serumfreiem Sf9 Wachstumsmedium mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 28 ° C. Verwenden Sie 3-5 x 10 5 c / ml Rührflasche Kulturen für suspens zu initiierenIonen-Zellwachstum. Passage routinemäßig , wenn sie erreichen Zelldichten von 2-4 x 10 6 c / ml (alle 3-4 Tage). </li><li> Kultur Sf9-Zellen in Suspension in Spinnerflaschen mit auf einem Mehr Rührerplatte System bei 130 Umdrehungen pro Minute gerührt. Für eine ordnungsgemäße Belüftung Kulturvolumina bei nicht mehr als die Hälfte des Volumens des Rührflasche halten. </li><li> Zur Expression von VLPs CHIK, Sf9 Zellen bei einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml mit rekombinantem Baculovirus mit einer Multiplizität der Infektion von 1 und zurück auf 28 ° C Inkubator infizieren. Typischerweise infizieren ein oder zwei Spinnerflaschen mit 250 ml Sf9-Zellen. Hinweis: Während wir diese Methode nicht verwenden, können Sf9-Zellen bei 28 ° C in Schüttelkolben kultiviert werden, einen Shaker-Plattform. </li><li> Ernte Kulturen nach 72-96 h nach der Infektion, oder wenn die Lebensfähigkeit der Zellen auf 70-80% verringert hat, wie durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt nach dem Protokoll des Herstellers. Anmerkung: Die Zellen fortzusetzen, während infizierte zu proliferieren, und es gibta ~ 80% Lebensfähigkeit in Sf9 Kulturen mit rekombinanten CHIK VLP Baculovirus infiziert bei 3 Tage nach der Infektion (dpi). Baculovirus-infizierte Zellen sind größer in Erscheinung. Morphologie kann auch von rund bis länglich ändern. In der späten Stadien der Baculovirus-Infektion begannen die Zellen zu lysieren. </li><li> Transfer Kulturen direkt aus Suspensionskultur in 50 ml konische Röhrchen und die Zellen des Abschaltens bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Sammeln Sie Stände und filtriert durch ein 0,22 um Porenmembran vor der Sedimentation über Ultrazentrifugation. </li></ol> 3. Sedimentation / Reinigung von VLP / SVP <ol><li> Sterilisieren 25 mm x 89 mm nach oben offenen Ultrazentrifuge Rohre mit 70% Ethanol in Biosicherheit Kapuze. Stellen Sie sicher, das Ethanol vor dem Gebrauch durchgetrocknet ist. </li><li> Legen Sie bis zu 32 ml Überstand in ein sauberes Röhrchen. Ein minimales Volumen von 25 ml wird empfohlen, von nicht ausreichend gefüllt Ultrazentrifugenröhrchen Kollaps und Schäden zu vermeiden. </li><li> Sorgfältig unterlegen Stände Witzh sterile 3 ml 20% Glycerin in PBS (v / v). Stellen Sie sicher, Rohre ausgeglichen sind. </li><li> Spin bei 135.000 xg für 4 h bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen, wird das Pellet gewährleisten nicht aus dem Rohr entfernen. </li><li> Resuspendieren sedimentiert VLPs an Boden der Röhrchen mit sterilem PBS durch kräftiges Pipettieren nach oben und unten. Die Menge an PBS benötigt VLPs zu suspendieren, hängt von VLP Gesamtproteinausbeute und Downstream-Anwendungen. Typischerweise resuspendieren jedes Pellet VLP in mindestens 100 &amp; mgr; l. </li><li> Store Proben 4 ° C für die kurzzeitige Lagerung und -80 ° C Lagerung für die Langzeitlagerung. </li></ol> 4. Bestimmung Proteinausbeuten und spezifische Antigen Ausbeuten <ol><li> Bestimmen Sie den Gesamtproteingehalt Kommerzielle Proteinquantifizierung Verfahren, wie BCA-Test gemäß Herstellerprotokoll. </li><li> Um spezifische Antigengehalt beurteilen, führen direkte Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) durch Beschichtung serielle Verdünnungen von Standard-Antigens und 2-51; g Gesamtproteinprobe auf einem ELISA-96-Well-Platte mit flachem Boden. <ol><li> Folgen mit antigen-spezifischen Antikörpern die Anwesenheit der Antigene auf der Platte zu sondieren und konventionellen ELISA Entwicklung Substrate verwenden, um nachweisbare Absorption für Mikrotiterplatten-Lesegerät herzustellen. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Ergebnisse von HA und ELISA - Test für eine Probe VLP-HA zum Ausdruck bringen; viele Kombinationen von HA und NA sind möglicherweise aber gibt bei der HA-NA - Kompatibilität 15 unterscheiden. Hinweis: Antigen-spezifischen Antikörper weisen variable Affinitäten und es wird empfohlen, dass Endpunktverdünnungs-Titration von Antikörpern vor der Durchführung VLP Quantifizierung bestimmt werden. Kommerzielle Antikörper haben vorgeschlagen, Konzentrations- oder Verdünnungsbereich für die Verwendung in ELISA sowie vorgeschlagenen Protokollen. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben die Techniken, die oben beschrieben erfolgreich verwendet, um auszudrücken und zu reinigen, SVP und VLPs aus mehreren Strukturproteine ​​für verschiedene Krankheitserreger. In der Regel verwenden wir Säugetier-Expressionssysteme unserer VLPs zu erzeugen. in unseren Händen, abgeleitet Säugetier-Zelle jedoch CHIK VLP Ausbeuten waren gering. CHIK VLP Ausbeute war robuster, wenn ein rekombinantes Baculovirus-Insektenzellsystem. Im allgemeinen Baculovirus-Insektenzellsysteme, ergeben höhere Mengen an rekombinanten Proteinen, die von den höheren Zelldichten führen kann, die in Spinnerflaschen im Vergleich zu Gewebekulturflaschen, und auch aufgrund der hohen Grad der Expression von Fremdgenen, während unter der Kontrolle kultiviert werden können jedoch des Baculovirus - Polyhedrin - Promotors. 16 ist ein Nachteil der Verwendung von Baculovirus ist die Anwesenheit von Baculovirus in VLP Zubereitungen, die Adjuvans - Aktivität hat und skew immunologische Ergebnisse in Impfstoffstudien 17 Wir fanden auch die Variabilität der Ausbeute von Influenza VLPs in Abhängigkeit von den HA- und NA-Kombinationen verwendet werden; H3N2 VLP2 hatten relativ Ausbeute reduziert im Vergleich zu H3N2 VLP1 möglicherweise aufgrund weniger effizient VLP Montage oder NA-compatibility 15 und bleibt weiter untersucht werden. Optimierung der DNA-Konstrukte und Transfektion Verhältnisse bleiben wichtige Schritte für eine optimale VLP Ausbeuten zu gewährleisten. Wir entschieden uns ein Säugetier-Vektor pTR600 konsequent bei unseren Säugetierbasierten VLPs zu verwenden, da die Expression im Allgemeinen effizient und Subklonierung ist bequem mit mehreren Restriktionsenzymen. Die Verhältnisse der Plasmide können für Anforderungen des Benutzers angepasst werden VLP Ausbeuten zu verbessern. Wie jedoch erwähnt, bleiben die jeweiligen Einschränkungen der Säugetier-VLP-Produktion mit Kosten für die Transfektion und die Fähigkeit, das Zellwachstum in den Flaschen Kultur aktuellen Gewebe. Obwohl es nicht in diesem Protokoll durchgeführt wird , haben wir in transfizierten Zellen weitere erfolgreiche Produktion von VLPs beobachtet , wenn Medien mit frischem Wachstumsmedium (zB OptiMEM) nach den Tannen aufgefüllt wirdt 72 Stunden Ernte und anschließende Sammlung von VLPs nach weiteren 72 Stunden, obwohl Ausbeuten können geringfügig im Vergleich zu der ersten Sammlung von VLPs reduziert werden. Wir zeigen ein Verfahren für Kulturen in entweder Insekten- oder Säugerzelle viralen Strukturproteine ​​exprimieren VLPs in dem Überstand freizugeben für halb Reinigung durch Ultrazentrifugation. Die SVP / VLPs sind im allgemeinen stabil für den Einsatz in Antigen - Immunoassays und Impfung Studien und weniger Sicherheit Bedrohungen darstellen , im Vergleich Viruspartikel zu leben, vor allem für ausgewählte Agenten oder hoch Erreger der Aviären Influenza (HPAI) Stämme 8,18, das Biosafety Level erfordern 3 (BSL-3) Laborbedingungen 19. VLP Herstellung ist relativ einfach und häufig ergibt Teilchen, die von Antikörpern erkannt werden können gegen natives viralen Strukturproteine ​​hervorgerufen, nicht ausschließlich denaturierten lineare Epitope. VLPs dienen als nützliche Plattform für spezifische Immunreaktionen gegen das Antigen hervorzurufen und kannein vielversprechender Kandidat in der Impfstoffentwicklung sein. Dieses Protokoll zeigt, zwei Ansätze für die virale Gene in Säugetiersystem transfizieren. In dieser Darstellung sind zwei Influenza-Gene HA und NA werden co-transfiziert mit dem HIV-Gag ein VLP zu erzeugen, das ein Gag inneren Kern aufweist, wobei HA und NA auf der Oberfläche zusammengesetzt. Die Substitution von Gag anstelle von Influenza Matrix 1 (M1) veranschaulicht die Flexibilität des Gag-basierten VLPs mit nicht verwandten viralen Glykoproteine, wie RSV F und möglicherweise andere. Alternativ verwendet die Synthese von CHIKV eine strukturelle Genkassette, die die notwendigen Komponenten für die SVP Selbstmontage, mit CHIKV E Proteinen präsentiert auf der Oberfläche eines Zentrums, bestehend aus C-Protein exprimiert. Diese beiden Ansätze zeigen die Flexibilität der VLP-Synthese, die minimale strukturelle Virusproteine ​​erfordert aus transfizierten Zellen zu montieren. Schließlich, während präsentierten wir allgemeine Protokolle und Vertreter Results für die Expression und Reinigung von H3N2, RSV, DENV und CHIKV sind diese Verfahren leicht zugänglich für die Erzeugung von VLPs anderer viraler Proteine ​​verwenden. Diese Verfahren wurden von unserer Gruppe in der Erzeugung von anderen Subtypen des Influenzavirus einschließlich H1, H5 und H7-Viren erfolgreich eingesetzt. Darüber hinaus ist die einzige Plasmid, prM / E Entwurf für die Erzeugung von DENV SVP verwendet wird, kann zur Erzeugung von SVP für andere Mitglieder der Flavivirus-Familie angepasst werden, dass West-Nil und Japanische Enzephalitis-Viren enthalten. Auf ähnliche Weise können Methoden der CHIK VLP Produktion für andere Mitglieder der Familie Togaviridae verwendet werden, einschließlich der venezolanischen, Ost- und West-Pferde-Enzephalitis-Viren.

Virus-ähnliche Partikel (VLPs) sind eine bewährte Technologie für die menschliche Impfung. In der Tat beschäftigen einige der contemporarily zugelassene Impfstoffe, einschließlich der humanen Papillomviren (HPV) und Hepatitis Β (HepΒ) Impfstoffe diesen Ansatz. VLPs sind in der Lage die Selbstorganisation von Strukturproteinen gebildet. Die zusammengesetzten Teilchen nachahmen viral Morphologien, kann aber nicht infizieren oder zu replizieren, weil sie viralen Genomen fehlt. VLPs können aus einer Reihe von prokaryotischen und eukaryotischen Systemen exprimiert und gereinigt werden. Eine Überprüfung der Literatur ergab , dass unterschiedliche Expressionssysteme mit den folgenden Raten eingesetzt werden: Bakterien - 28%, Hefe - 20%, Pflanzen - 9%, Insekten - 28%, und Säuger - 15% 1. Zu beachten ist , Protein - Impfstoffe HPV basierend auf L1 - Kapsid in Hefe (Gardasil) oder in einer Insektenzellsystem (Cervarix) 2 hergestellt. HepΒ Impfstoffe, Recombivax und Engerix-Β, werden auch in Hefe hergestellt und bestehen aus HepΒ Oberflächenantigen 3, 4. Wir verwenden Säuger- und Insektenzellexpressionssysteme VLPs herzustellen erfordern Coexpression von mehreren Strukturproteinen für die Montage. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Gestaltung, Herstellung und Reinigung von VLP-basierte Impfstoffe gegen humanpathogene Erreger: Influenza-Virus, Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), Dengue-Virus (DENV) und Chikungunya-Virus (CHIKV). Unsere Verfahren sind flexibel genug , um die Coexpression der mehreren Strukturproteinen aus mehreren Expressionsplasmiden oder einem einzigen Expressionsplasmid (Figur 1) zu ermöglichen. Zuvor produzierten wir und gereinigter H5N1 VLPs zusammengesetzt aus der Co-Expression von Plasmiden codiert , Influenza - Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrix (M1) in humane embryonale Nierenzellen 293T 5,6. Die Gene wurden für die Expression in Säugerzellen-Kodon-optimierten und kloniert in pTR600, einem eukaryotischen Expressionsvektor, der Cytomegalovirus-immediate-early-Promotor und Intron A zum Initiieren umschrift enthaltendription von eukaryotischen Einsätze und das Rinderwachstumshormon - Polyadenylierungssignal für die Beendigung der Transkription 7. Ein ähnlicher Ansatz der drei Plasmid Co-Expression von HA, NA (1A) und eine alternative virale Matrix - Protein, HIV Gag p55, wurde unter Verwendung von für die Erzeugung von menschlichen saisonalen Influenza - Subtyp H3N2 VLPs in dieser Studie verwendet und wurde zu generieren gezeigt VLPs von ähnlicher Größe wie Influenza Partikel 8. Obwohl überwiegend Influenza - Impfstoffe Anti-HA - Antikörper hervorzurufen, vermittelt die Zugabe von Influenza - Neuraminidase Sialidaseaktivität VLP zu ermöglichen , von transfizierten Zellen 9 und auch vorhanden zusätzliche immunogene Ziele Knospung. Um RSV VLPs herzustellen, wählten wir auch die in keinem Zusammenhang Kern von HIV - Gag zu prototypische Impfstoffe entwickeln , die weiter ausschließlich RSV Oberfläche Glykoproteine ​​präsentieren Flexibilität der VLP - Bildung zeigen , unter Verwendung von HIV - Gag, wie zuvor durch Elektronenmikroskopie 6,10 beschrieben und charakterisiert. AndereVerwendung zusammengebaut werden verschiedene virale Komponenten von Newcastle Disease Virus (NDV) 11, und Influenza - Matrix 12 , dass VLPs präsentiert RSV - Glykoproteine ​​können zuvor gezeigt haben. Voller Länge Oberfläche Glykoprotein-Sequenzen wurden in dieser Studie verwendet, um nativen Konformationen behalten, die für funktionelle Rezeptorbindung und Antikörper-Erkennungs Assay durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) notwendig sein kann. Unsere Beispiele für die Verwendung von einzelnen Plasmid-Expressionssysteme Partikel sind DENV und CHIKV zu erzeugen. Im Falle von DENV können wir subvirale Partikel (SVPs) ohne Kapsid in 293T - Zellen aus einem einzelnen Plasmid , das ein prM / E - Strukturgens Expressionskassette enthält 13 herzustellen. Der Begriff SVP wird verwendet, um das Fehlen eines Kerns oder Kapsidprotein in der Montage von viralen Strukturproteine ​​zu bezeichnen. CHIK VLPs können auch ein einzelnes Plasmid, das ein CHIKV strukturelle Gen-Kassette, die Codierung Kapsid und Hüllproteine ​​gewonnen werden, enthält, oder in insect Zellen mit einem rekombinanten Baculovirus codiert , die gleiche strukturelle Genkassette optimiert für Insektenzellexpressions (1B - C) zu infizieren. Das Endergebnis des Ausdrucks oben diskutierten Ansätze ist die Freisetzung von VLPs in den Zellkulturmedium, das dann über Ultrazentrifugation durch einen 20% Glycerin Kissen leicht gereinigt werden. In diesem Bericht stellen wir Methoden, um diese VLPs aus Säugetier- und Insektenzellsysteme, zum Ausdruck zu bringen und zu reinigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:167px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12163</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DMEM</td>
			<td style="width:167px;">Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>L3000075</td>
			<td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10359-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyclear ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Seton</td>
			<td style="width:119px;">7025</td>
			<td>Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate citrate buffer</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">o-phenylenediamine dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.22 &#956;m vacuum filter top (500 mL)</td>
			<td style="width:167px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">H2SO4</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">339741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sf-900 II SFM</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression and purification of virus-like particles for vaccination

Virus-ähnliche Partikel (VLPs) und subvirale Partikel (SVPs) sind ein alternativer Ansatz zu viraler Impfstoff-Design, das die Vorteile der erhöhten biologischen Sicherheit und Stabilität gegenüber der Verwendung von lebenden Pathogenen bietet. Nicht-infektiös und selbstorganisierenden, VLPs werden verwendet, Strukturproteine ​​als Immunogene darzustellen, wodurch die Notwendigkeit für lebende Pathogene oder rekombinanter viraler Vektoren für die Antigenabgabe umgehen. In diesem Artikel zeigen wir die verschiedenen Stadien der VLP-Design und Entwicklung für zukünftige Anwendungen in der präklinischen Tierversuche. Das Verfahren umfasst die folgenden Phasen: Auswahl des Antigens, die Expression von Antigen in Zelllinie der Wahl, Reinigung von VLPs / SVP und Quantifizierung für Antigen Dosierung. Wir demonstrieren den Einsatz beider Säugetier- und Insektenzelllinien zur Expression unserer Antigene und zeigen, wie Methoden der Ausbeute unterscheiden. Die Methodik dargestellt kann auf eine Vielzahl von Pathogenen anwendbar und kann durch Einsetzen der Antigene mit immunogenen str erreicht werdenuctural Proteine ​​des Mikroorganismus von Interesse des Benutzers. VLPs und SVP unterstützen mit Antigen Charakterisierung und Auswahl der besten Impfstoffkandidaten.

VLP Ausbeuten waren variabel durch virale Antigen-Konstrukt-Design. In diesem Protokoll haben wir die Verwendung von Insekten- und Säugerzellen für die Produktion von VLPs SVP oder in Überstand und die Reinigung durch Ultrazentrifugation demonstriert. Vier Subtypen von DENV prM / E - Strukturgens Expressionskassetten wurden verwendet , um die Versionen von DENV SVPs zu konstruieren (wie abgegrenzte 1-4) in Tabelle 1 und zeigen einen Bereich zwischen 1,1 bis 2,6 mg Gesamtprotein in 0,6 ml Volumen. Für VLPs, die ein drei Genkonstrukte erfordern, fanden wir die optimierte DNA-Transfektion Verhältnis von 1: 1: 2 HA: NA: Gag bzw. Influenza-VLPs zu synthetisieren; Im Gegensatz dazu exprimieren multiple chikungunya viralen Proteine ​​war ausreichend für die Erzeugung von rekombinantem Baculovirus und Säuger CHIK VLP ein einzelnes Plasmid. Zusätzlich ist ein Dual-Plasmid-Transfektionsverfahren ist auch möglich, mit Säugerzellen, die als solche mit RSV F und Gag bei einem 1 transfiziert: 1-Verhältnis und ergibt approxirungsweise 0,01 mg / ml des gesamten Zellkulturüberstand. Wie in der Tabelle 1 kann zwischen 0,008-0,016 mg Gesamtprotein / ml Überstand Volumen, während die Produktion durch Säugetier - 293T erhält man eine 10-fache Reduktion von Protein aus Sf9 Zellen SVP Ausbeute CHIK gezeigt liegen. Zwischen den beiden Versionen von H3N2 VLPs mit verschiedenen Wildtyp, in voller Länge HA Plasmide, hatte das H3N2-VLP-Probe 2 eine reduzierte Ausbeute von sowohl Gesamtprotein und spezifischen HA-Gehalt. Andere Proben VLP HA Mengen sind in den 2 und 3 gezeigt und zeigen , wie HA und ELISA verwendet Oberfläche Inhalte auf den VLPs abzuschätzen. Wie bei einem herkömmlichen Verfahren direkten ELISA wird eine Standardkurve erzeugt H3 VLPs auf eine ELISA-Platte geladen unter Verwendung von bekannten Konzentrationen eines rekombinanten HA zu vergleichen ELISA-Reaktivität abzutasten. ELISA oder ähnliche Immunoassay werden zur Quantifizierung von VLPs empfohlen, die leicht verfügbar monoklonalen Antikörpern mit bekannter Kreuzreaktivität zu einer gut konservierten EPIT habenopes, aber möglicherweise nicht für alle Antigene zur Verfügung stehen. RSV F ist gut charakterisierten, daher ein ELISA monoklonalen anti-RSV-F-Antikörpers ist auch anwendbar für die Quantifizierung der Oberfläche F auf pelle RSV F VLPs. Zusätzlich zu Antigen Funktionalität und Antigenerkennung durch spezifische Antikörper, VLP Präparationen strukturell werden kann durch Elektronenmikroskopie bewertet. 4 ist ein repräsentatives Bild zeigen , daß HA (Gag-core) influenza VLPs sind erfolgreich exprimiert, zusammengesetzt, und gereinigt , wie VLPs. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Beschreibung </td><td> Kultur Vol (ml) </td><td> Ernte ein </td><td> Volle Lautstärke </td><td> Total Protein Ausbeute (mg) </td><td> Ausbeute (mg) / Vol (ml) </td><td> Spezifische Antigengehalt </td></tr><tr><td> DENV1 SVP </td><td> 293T186 </td><td> 4 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 1,115 </td><td> 0,006 </td><td> nd </td></tr><tr><td> DENV2 SVP </td><td> 293T / 186 </td><td> 4 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 2.5 </td><td> 0,0134 </td><td> nd </td></tr><tr><td> DENV3 SVP </td><td> 293T / 186 </td><td> 3 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 1,536 </td><td> 0,0083 </td><td> nd </td></tr><tr><td> DENV4 SVP </td><td> 293T / 186 </td><td> 4 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 2,613 </td><td> 0,014 </td><td> nd </td></tr><tr><td> CHIK VLP </td><td> Sf9 / 186 </td><td> 3 dpi </td><td> 0,6 ml </td><td> 1,503 </td><td> 0,0081 </td><td> nd </td></tr><tr><td> CHIK VLP </td><td> Sf9 / 500 </td><td> 4 dpi </td><td> 2,0 ml </td><td> 8,276 </td><td> 0,0166 </td><td> nd </td></tr><tr><td> CHIK VLP </td><td> 293T / 186 </td><td> 3 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 0,296 </td><td> 0,0016 </td><td> nd </td></tr><tr><td> H3N2 VLP 1 </td><td> 293T /216 </td><td> 3 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 1,25 </td><td> 0,0058 </td><td> 1,9 ug HA / ul </td></tr><tr><td> H3N2 VLP 2 </td><td> 293T / 216 </td><td> 3 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 0,956 </td><td> 0,0044 </td><td> 0,96 &amp; mgr; g HA / ul </td></tr><tr><td> H3N2 VLP 3 </td><td> 293T / 216 </td><td> 3 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 1.6 </td><td> 0,0074 </td><td> 1,2 ug HA / ul </td></tr><tr><td> H3N2 VLP 4 </td><td> 293T / 216 </td><td> 3 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 1,54 </td><td> 0,0071 </td><td> 0,98 ug HA / ul </td></tr><tr><td> RSV-F-VLP </td><td> 293T / 216 </td><td> 3 d </td><td> 0,6 ml </td><td> 2.3 </td><td> 0,0106 </td><td> 0,15 &amp; mgr; g RSV F / ul </td></tr><tr><td colspan="7"> a d = Tage nach der Transfektion dpi = Tage nach der Infektion </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: subviraler und v<html> irus artige Partikel Ausbeuten durch Konstrukt. Repräsentative Daten von VLP Volumen, Gesamtproteinausbeute (durch herkömmliche BCA - Test bestimmt) oder spezifische Antigengehalt (bestimmt durch ELISA) wird unter einer Vielzahl von SVP / VLP - Konstrukte gezeigt. Die Renditen sind variabel aufgrund der Differenz in SVP / VLP Montage und Zelltyp und maximale Erträge können Benutzer Optimierung erfordern. Die verschiedenen Versionen von entweder DENV1-4 basierend auf Serotyp unterscheiden, während die CHIK VLPs die gleiche Reihenfolge verwenden, aber Präparate unterscheiden sich in entweder Volumen oder Zellkultur Typ. Die verschiedenen Versionen von H3N2 VLPs (1-4) ausdrücken vier einzigartige HA-Sequenzen, die ein HA-spezifischen ELISA reaktive Epitop teilen und wurden mit dem gleichen NA und gag Kern coexprimiert. Die RSV F VLP, das aus einem Dual-Plasmid-Transfektion von RSV F und Gag erzeugt wird, wurde synthetisiert und RSV F-Gehalt wurde unter Verwendung von RSV F-spezifischen ELISA-Assay approximiert. .jpg &quot;/&gt; Abb . 1: Approach - VLP Design, die Synthese und Reinigung Schematische Darstellung von Plasmid - Gen - Designs für die Expression viraler Strukturproteine ​​, die VLPs bilden: (A) Co-Expression von mehreren Strukturproteinen durch Cotransfektion von drei Plasmiden in 293T - Zellen , (B) Expression der Strukturproteine ​​von einem einzelnen Gen - Kassette in einem einzigen Plasmid in 293T - Zellen codiert, und (C) rekombinanten Baculovirus Codierungs CHIK Strukturproteine ​​verwendet , Sf9 - Zellen, die in Spinnerflaschen zu infizieren hoher Dichte das Zellwachstum in Suspension zu fördern , . Die VLPs werden aus den Zellkulturmedien geerntet, von Zelltrümmern geklärt und aus Nicht-Partikel über Sedimentation durch Ultrazentrifugation auf einem Kissen 20% Glycerin abgetrennt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54041/54041fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54041/54041fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> . Abbildung 2: Beispiel Hämagglutinationstest von H3 VLPs Ein herkömmlicher Hämagglutination - Assay wurde an einer repräsentativen Probe des H3N2 VLP und seine entsprechende geklärte Überstand durchgeführt wird ; H3N2 HA-Assay durchgeführt werden kann, 0,8% Türkischrotöl Blutkörperchen oder Meerschweinchen roten Blutzellen (nicht gezeigt) verwendet wird. Gesamtproteingehalt wird mit dem Standard-BCA-Test auf dem gereinigten VLP geschätzt und wurde nicht für geklärte Überstand durchgeführt oder empfohlen. ELISA wurde auf dem gereinigten VLP durchgeführt und HA - Gehalt wurde eine rekombinante HA - Standard bekannter Konzentration geschätzt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54041/54041fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54041/54041fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54041/54041fig3.jpg" /> Abbildung 3: Ex<html> reichlich H3 ELISA zur Quantifizierung von H3 - Gehalt in H3 VLPs. Ein ELISA - Platte wurde mit Reihenverdünnungen eines rekombinanten HA - Standard bekannter Konzentration und verdünnt H3N2 VLP Proben aus verschiedenen HA - Sequenzen (Proben 1-9) erzeugt beschichtet. Korrelieren der Konzentration (ug / ul) des Standards an die optischen Dichtewerte bei 492 nm erhalten (OD) sind Konzentrationen, die durch den x-Wert abzuleiten, der den linearen Teil der Standardkurve schneidet. Verdünnungen von rekombinanten HA-Standard und unbekannten Proben wurden in zweifacher Ausfertigung in Vertiefungen A &amp; B oder C &amp; D bzw. geladen. Die endgültige Konzentration der VLP - Probe durch Multiplikation der Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor des VLP Probe bestimmt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54041/54041fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54041/54041fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 4041 / 54041fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4: Elektronenmikroskopie von HA-VLPs mit Gag-Core Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahme von gereinigtem Influenza - HA - VLPs.. VLPs montieren zu kugelförmigen Teilchen mit HA beschichtet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54041/54041fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54041/54041fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

21.7K Aufrufe.  University of Georgia.  Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren. 

Serie: Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.