We thank Nguyen H. Nguyen for her technical help and Audrey O&#8217;Neill for support with the Zeiss Cell Observer spinning-disk confocal microscope. This work was supported by a Department of Defense postdoctoral fellowship (W81XWH-11-01-0139) and the Weizmann Institute of Science-National Postdoctoral Award Program for Advancing Women in Science (to V.P.).

Alle beschriebenen Verfahren muss mit Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung durch die lokalen Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) entsprechend durchgeführt werden. 1. Erzeugung von Lungenmetastasen für Ex-Live-Imaging (Transgene oder Schwanzveneninjektion) vivo HINWEIS: Lungenmetastasen kann durch Verwendung gentechnisch veränderter Mausmodelle oder durch intravenöse (iv) Injektion von Krebszellen erzeugt werden. <ol><li> Generieren Lungenmetastasen für die Bildgebung durch eine gentechnisch veränderte Tumormausmodell in einer transgenen Reporter Maus überqueren, zum Beispiel, über die Brustkrebs-Mausmodell, Maus-Mammatumorvirus Long Terminal Repeat-Polyoma-Mitte-T-Antigen (MMTV-PyMT) 11 in ACTB-ECFP Mausmodell 12. HINWEIS: Das drückt ACTB-ECFP Modell cyan fluoreszierende Protein (ECFP) unter der β-act verbessertin Promotors, so dass alle Zellen fluoreszieren in dem blauen, CFP-Kanal. Jedoch sind die Krebszellen mit Abstand zu den führenden und als Hauptteil ECFP-positive Zellen unter dem Mikroskop erscheinen. Der MMTV-PyMT Mausmodell entwickelt sich eine progressive Erkrankung, bei der Mammatumorwachstum mit der Verbreitung von Krebszellen an die Peripherie zugeordnet ist, insbesondere an der Lunge. In MMTV-PyMT Mäuse auf dem FVB / n Hintergrund können Mikrometastasen um 10 bis 11 Wochen alt sind zu beachten. Im Allgemeinen werden diese Fortschritte zu Makrometastasen bei etwa 14 Wochen alt 13. ODER </li><li> Generieren experimentellen Metastasen mit Primärzellen oder syngenen Zelllinien. Verwenden in vitro manipuliert Primärtumorzellen oder Zelllinien (z. B. Transduktion), gefolgt von iv-Injektion 14. <ol><li> Ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimierenden (+) MMTV-PyMT Zelllinie in fluoreszierenden Reporter-Mäuse (ACTB-ECFP) oder Wildtyp-Mäusen Kurz gesagt, in diesem Protokoll injizieren. Dann,visualisieren diese als VO-PyMT Zellen 15 bezeichnet Zellen, die grün, GFP Kanal. HINWEIS: Die ursprüngliche VO-PyMT Zelllinie an der Vanderbilt Orthopädie in Nashville, TN abgeleitet wurde. VO steht für Vanderbilt Orthopädie. </li><li> Im Anschluss an die Injektion von 10 6 Zellen (in 200 ul), Krebszelle Extravasation sofort und bis zu ein paar Stunden nach der Injektion beobachtet; beobachten Mikrometastasen zwischen 1-3 Wochen nach der Injektion und erkennen Makrometastasen 3 Wochen nach der Injektion 15. HINWEIS: Weniger Zellen injiziert werden, die Zeit von der Injektion bis Metastasenwachstum zu verlängern. </li></ol></li></ol> 2. Markierung von interessierenden Komponenten in dem metastatischen Mikromilieu (Transgene und / oder Injektionspräparate) HINWEIS: Labeling kann durch transgenen Mäusen und / oder durch verschiedene Injektionen erreicht werden. Stellen Sie sicher, verschiedenen fluoreszierenden Farben für die Markierung von verschiedenen Zelltypen zu verwenden. <ol><li> Label-Komponenten des metastatischen Mikroumgebung unter Verwendung von transgenen Mäusen. Überqueren den zuvor genannten Maustumormodell (z. B. MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) in ein transgenes Mausmodell, in dem die stromalen Zellen von Interesse durch ein fluoreszierendes Protein markiert sind, die nicht ECFP ist, z. B., c-fms-EGFP 4,16. HINWEIS: Zusätzlich zu Visualisierung von Krebszellen in der GFP-Kanal ermöglicht diese Visualisierung von myeloischen Zellen in der GFP-Kanal 4. UND / ODER </li><li> Beschriften verschiedenen Komponenten des metastatischen Mikroumgebung mit Injektionen in transgene Mäuse oder fluoreszierenden Reporter (nicht fluoreszierenden) Wildtyp-Mäusen. HINWEIS: Mehrere Verbindungen können verschiedenen Komponenten des metastatischen Mikroumgebung, beispielsweise ein AF647-konjugierten Gr-1-Antikörper wird verwendet, hier zu beschriften Neutrophilen und Monozyten einige 13 und unterschiedlichem Molekulargewicht Dextrane zu beschriften werden injiziert werden verwendet,Lungenkapillaren zu kennzeichnen. Für die Herstellung dieser injizierbaren siehe Schritt 4. </li></ol> 3. Herstellung von Materialien vor Dissection <ol><li> 2% Agarose <ol><li> Wiegen 0,2 g Agarose und in den 10 ml 1 x PBS. Die Lösung wird die Agarose zu lösen. Agarose wird bei RT verfestigen, so halten sie in einem 37 ° C Wasserbad, bis die Inflation eingesetzt. </li></ol></li><li> CO 2 und Temperaturregler <ol><li> Prüfen ddH 2 O in die Befeuchtungskammer. Füllen Sie, wenn nötig. Legen Konfiguration Platte in Temperaturstufe Plattenhalter (Klimakammer). Schalten Sie den CO 2-Controller und setzen CO 2 bei 5%. Sicherstellen, dass die Luftdurchsatz bei 0,4 Nl / min eingestellt ist. </li><li> Öffnen Sie die Luft und CO 2 Ventile. Schalten Sie den Temperaturregler. Sicherstellen, dass die Temperatur der Klimakammer und der Deckel auf 37 ° C eingestellt sind. </li><li> Lassen Sie Luftdruck auf die CO 2 Meter. Prüfen CO 2 zu erhöhen, equilibration kann bis zu 30 Minuten dauern. </li></ol></li><li> Spinning Disk Konfokalmikroskop HINWEIS: Details des Mikroskops Set-up vorher 4,17 beschrieben wurden. <ol><li> Schalten Sie den Laser (Argon-Laser für 488 nm Anregung und der Festkörper 405 nm, 561 nm und 640 nm Laser). Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera, den Spinnplattensteuereinheit, die AOTF, die Laser-Steuereinheit und der Kamerasteuerung. </li><li> Öffnen Sie das Mikroskop Verschluss, schalten Sie den Computer das Mikroskop ausgeführt und die Software öffnen. </li></ol></li><li> Herstellung der Werkzeuge und Dissektion Plattform. <ol><li> Schalten Sie das heiße Perle Sterilisator und lassen Sie es 250 ° C erreichen. Saubere zwei Paare von chirurgische Scheren und Pinzetten mit Wasser und Seife. Sterilisieren Sie die Tools für mindestens 30 Sekunden. Lassen Sie die Werkzeuge abzukühlen. Verwenden Sie einen Polystyrol Deckel als Dissektion Plattform. Decken Sie sie mit einem Stück Labor Soaker. </li></ol></li></ol> 4. Herstellung von Injektionen HINWEIS: In Abhängigkeit von der Halbwertszeit und die bevorzugte Reaktion, spritzen fluoreszenzmarkierten Antikörpern und / oder fluoreszierende Moleküle entweder unmittelbar vor der Tieropfer oder ein paar Stunden bis Tage vor. <ol><li> Um das Bild zu Gr1-positive Neutrophile und Monozyten, eine Spritze mit 7 ul Lager AF647-konjugierte Gr-1-Antikörper (1 mg / ml) in 100 ul sterilem PBS unter der Haube vorzubereiten. Legen Sie eine 27 G ½ Nadel auf die Spritze. </li><li> Um die Bild Lungenkapillaren, bereiten eine zweite und dritte Spritze mit 100 ul von entweder 70 kD Rhodamin-konjugiertem Dextran (4 mg / ml) oder 10 kD AF647-konjugiertem Dextran (4 mg / ml). Legen Sie eine 27 G ½ Nadel auf den Spritzen. </li><li> Spritzen Sie die AF647-konjugierte Antikörperlösung iv 5 Stunden vor der Lunge &#39;Exzision. </li><li> Einspritzen eines oder beider Dextranlösungen iv unmittelbar vor der Lunge &#39;Exzision. </li></ol> 5. Herstellung von Lungen für Ex-vivo-Live-Imaging HINWEIS: Versuchen Sie, so steril und vorsichtig wie möglich zu arbeiten, um unnötige Herausforderungen der Immunzellen in der Lunge zu vermeiden. <ol><li> Spritzen Sie die Maus intraperitoneale (ip) mit einer tödlichen Überdosis eines Narkosemittels durch das Tier Protokoll von IACUC genehmigt erlaubt, z. B. 1 ml 2,5% Avertin. Warten, bis die Maus Atem anzuhalten und vollständig nicht mehr reagiert auf Schmerzreize (Hinterpfote Prise) sein. HINWEIS: Genickbruch und Euthanasie Kohlendioxid sollte, wie es nachteilig Lungenzelllebensfähigkeit beeinflussen vermieden werden können. </li><li> Immobilisieren die Maus auf einer Dissektion Bord und sterilisieren Sie die Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden chirurgische Scheren, zunächst einen quer im Oberbauch Schnitt durch die Haut zu machen, um einen ähnlichen Schnitt durch die Bauchfell gefolgt. Halten Sie die Dissektion Bord in einer vertikalen Position und schneiden Sie den absteigenden Aorta, so dass die Blutbäder nach unten in den Bauch und nicht in der Brusthöhle. </li><li> Sersticken eine kleine Öffnung in der Membran Vakuum freizugeben. Schneiden Sie entlang der 10. und 12. Rippe mit der Membran herauszuschneiden und visuellen Zugriff auf die Lunge gelangen. </li><li> Verwenden chirurgische Schere, um die Haut zu schneiden bis zur Luftröhre über den Brustkorb, aber lassen Sie den Brustkorb erhalten. Trennen Sie die Haut vor dem Brustkorb. Setzen Sie die Luftröhre durch das umgebende Bindegewebe zu entfernen, man aufpassen, nicht die Luftröhre selbst (1A) zu beschädigen. </li><li> Snip eine kleine Öffnung in etwa 1 mm im Durchmesser in dem freigelegten Luftröhre parallel zu den Knorpelringe, so nahe wie möglich dem Kehlkopf (1B). Achten Sie darauf, nicht vollständig durch die Luftröhre zu schneiden. </li><li> Nehmen Sie eine 20 G-Nadel und legen Sie die Nadel langsam 4-5 mm in die Luftröhre ohne Gegenkraft (1D). Das Ende der Nadel wird durch die Luftröhre (1C) sichtbar. Verwenden einer Pinzette die Nadel in die Luftröhre zu stabilisieren. Alternativ kann ein Nahtmaterial gebunden around die Luftröhre, die Nadel in Position zu halten. HINWEIS: zu tief Einsetzen der carina traumatisiert werden können oder nur eine Seite der Lunge könnte aufgeblasen werden. </li><li> Füllen einer Spritze mit 400 ul von 37 ° C 2% niedrig schmelzende Agarose-Temperatur (direkt von einem Bad mit konstanter Temperatur entnommen). Achten Sie darauf, das Sezieren Board steht und vermitteln langsam die warme Agarose durch die Nadel in die Lunge, verwenden Sie ~ 400 &amp; mgr; l in die Lungen aufzublasen. Hinweis: Sehen Sie sich die Lunge in den Brustkorb Aufblasen. Nicht über-Aufblasen der Lunge, wie es reißt. </li><li> Sobald die Lunge aufgeblasen sind, füllen ~ ⅔ des Brustkorbs, die Spritze zu lösen und die Nadel in der Luftröhre halten zu einem Agarose nicht auslaufen. </li><li> Gießen ca. 50 ml 20 ° C PBS in den aufgeblasenen Lungen die Agarose in der Lunge zu ermöglichen, festzulegen und zu verfestigen. Die Nadel langsam entfernt und die Luftröhre mit einer Pinzette schließen Agarose jede nichtverfestigten nicht auslaufen. &lt;/ Li&gt; <li> Expose der Lunge durch eine Sternotomie durchführen und herauszuschneiden anschließend in die Lunge. Zum Herausschneiden der Lunge, halten, um die Luftröhre, während vollständig durch die Luftröhre zu schneiden. Ziehen Sie die Luftröhre auf, das Bindegewebe und Speiseröhre beim Ziehen die Lunge aus dem Brustraum weggeschnitten, bis die Lungen von der Maus (1E) getrennt ist. </li><li> Tauchen Sie in die Lunge in warmem RPMI-1640 übermäßiger Blut abzuwaschen und trennen Sie vorsichtig die Lappen von Schere und Pinzette die Lappen &quot;Hauptstamm Bronchien bei Nabel (1F) zu schneiden. </li><li> Legen Sie die Lappen, mit der flachen Oberfläche nach unten Abbildungsfläche zu maximieren, in eine Vertiefung einer 24-Well-Bildplatte (1G). Füge 100 &amp; mgr; l von 37 ° C RPMI-1640 auf der Oberseite der Lappen. Legen Sie mehrere 15 mm Kreis Mikroskop Abdeckung gleitet oben auf den Lappen, damit sie nicht schwimmen. </li><li> Gießen warmen PBS in die umgebenden Vertiefungen die RPMI-1640-Medium aus evap zu verhindernOrating. Legen Sie die 24-Well-Platte in der Klimakammer ins Gleichgewicht gebracht und unterhält die Lungenlappen bei 37 ° C mit Luft und 5% CO 2. Legen Sie die Klimakammer auf der Bühne des konfokalen Mikroskops. Hinweis: andere Gasgemische (beispielsweise 5% O 2, 5% CO 2 in N 2 Zellverhalten unter Bedingungen von Hypoxie / niedrigeren Sauerstoff zu untersuchen) ebenfalls berücksichtigt werden. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53741/53741fig1.jpg" /> Abbildung 1. Das Protokoll für die Vorbereitung der Lunge für die Live-Darstellung. (A) Die Exposition der Luftröhre nach der Herstellung der Maus. (B) kleine Schnipsel aus in die freiliegende Luftröhre parallel zu den Knorpelringe. (C) 20 G Nadel eingeführt 4-5 mm in die Luftröhre. (D) Instillation von 400 ul 2% niedrig schmelzende Agarose-Temperatur in die Lunge. (E) Inflated Lungen von der Maus getrennt. (F) Lobes nach dem Aufblasen getrennt. (G) Keulen in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen Bildgebung gestellt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/53741fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 6. Akquisition und Analyse der Bilder HINWEIS: Die Bilder können durch verschiedene Softwareprogramme unterstützt mit einer Vielzahl von Spinnplatten konfokalen Mikroskopen erworben werden. In diesem Protokoll entweder μManager mit einem maßgeschneiderten drehende Scheibe konfokalen Mikroskop oder Zen mit einem handelsüblichen Konfokalmikroskop drehende Scheibe ist für die Bildaufnahme verwendet, während Imaris für die Filmbearbeitung und Analyse verwendet wird. <ol><li> Erwerben Sie Bilder mit μManager. Eine detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Erfassung von Bildern μManager Software zuvor 18 beschrieben. ODER </li><li> erwerben Sie BilderVerwendung von Bildanalysesoftware wie Zen (siehe Abbildung S1). <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Suchen&quot; Registerkarte und wählen Ziel (10x oder 20x) in der &quot;Light Path &#39;Werkzeug (Abbildung S1A, roter Kasten). Anschließend klicken Sie auf &#39;Eyes - DAPI &quot;bei der GFP-Kanal durch das Okular schauen (Abbildung S1A, blauer Kasten). Lokalisieren Sie die Probe manuell das Mikroskop. Klicken Sie auf &quot;Alle Off&#39;after das Gewebe Mitte des Sichtfeldes ist. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte &quot;Übernahme&quot; für die Bildaufnahme alle Parameter einzustellen. </li><li> In der Werkzeug &#39;Channels&#39;, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;+&quot; (Abbildung S1B, roter Kasten). Ein Pop-up-Menü erscheint und für den Farbstoff (en), die in der Probe in der &#39;Dye Datenbank&#39; (Abbildung S1B) suchen. Wählen Sie den Farbstoff und klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;. HINWEIS: Das Programm wird eingestellt Alle Filter optimiert werden. Ein Farbstoff kann gelöscht werdenindem Sie sie anschließend das Papierkorbsymbol (Abbildung S1B, gelber Kasten) klicken. </li><li> Im Menü &quot;Erfassungsmodus&quot; gesetzt &quot;Binning&quot; zu 5x5. Klicken Sie doppelt auf ECFP in der Kanäle-Menü, um es auszuwählen. Senken Sie die Laserleistung auf 20%, so dass die Probe wird beim Einrichten der Parameter für die Bildaufnahme nicht gebleicht werden. </li><li> Aktivieren Sie das Feld &quot;Fliesen&quot; in der &quot;Experiment-Manager &#39;Abschnitt und die Fliesen Werkzeug erscheint in der&quot; Mehrdimensionale Bildaufnahme&#39; Werkzeuggruppe (Abbildung S1C). Klicken Sie auf &quot;Erweiterte Einstellungen&quot;, um das Live-Bild der Kamera zu sehen. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Hinzufügen&quot; im Bereich &quot;Position&quot; 4 bis 6 Positionen auf das Experiment hinzuzufügen. Um eine Position zu löschen, wählen Sie diese Position, und klicken Sie auf das Papierkorb-Taste. </li><li> In der Werkzeuggruppe &quot;Erwerb Parameter &#39;, öffnen Sie das Werkzeug&quot; Fokus-Strategie &quot;, und wählen Sie&quot; Absolute Fest Z-Position &quot;aus der Dropdown-Liste. </li><li> Schauen Sie sich die Z-Stapel-Box in der &#39;Experiment-Manager&#39; Abschnitt und dem Z-Stapel-Tool erscheint in der &quot;Mehrdimensionale Bildaufnahme &#39;Werkzeuggruppe (Abbildung S1D). Klicken Sie doppelt auf eine der Positionen in der &quot;Position&quot; Abschnitt und drücken Sie &quot;Live&quot;. manuell einstellen ersten und letzten Position des Abbildungsfeldes gesetzt. Legen Sie das Intervall auf 4 um. Hinweis: Das Programm wird die Anzahl der Scheiben für den gewählten Bereich und Intervall bestimmen. Im Idealfall sind 5-7 Scheiben praktisch ausreichende Visualisierung und schnelle Bildaufnahme zu ermöglichen. </li><li> Überprüfen Sie das Feld &quot;Time Series&quot; in der &quot;Experiment-Manager-Seite. Den gewünschten &quot;Laufzeit&quot; und &quot;Interval&quot; mal in der &quot;Time Series&quot; Tool, das in der &quot;Mehrdimensionale Bildaufnahme &#39;Werkzeuggruppe (Abbildung S1E) erschien. </li><li> In der &quot;Erwerbtion-Modus &#39;Menü einstellen &quot;Binning&quot; zu 2x2. Klicken Sie doppelt auf einem Fluorophor in den Kanälen Menü, um es auszuwählen und die Laserleistung auf 100% erhöhen. Drücken Sie &quot;Live&quot; und stellen Sie die &quot;Belichtungszeit&quot;. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fluorophor. </li><li> Überprüfen Sie die &quot;Enable Auto Save&quot; ein. Wählen Sie einen Ordner und geben Sie den Namen der Datei ein. Alle aufgenommenen Bilder automatisch in diesem Ordner gespeichert werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start Experiment &#39;im Abschnitt&#39; Experiment-Manager&quot; Bildaufnahme zu starten. </li></ol></li><li> Nach der Bildaufnahme, die Rohdaten in Imaris Software kompilieren. Konvertieren von Bildern in .IMS Dateien und Anpassungen vorgenommen werden können. Eine detaillierte Schritt für Schritt-Protokoll für die Konvertierung von Dateien, so dass Anpassungen und Speichern von Filmen Imaris verwendet, ist zuvor beschrieben 18. </li><li> Wenn Sie den Film zu speichern, setzen Sie die &quot;Frame Rate&quot; zu 5 Bilder pro Sekunde (fps). </li></ol>

<ol>
	<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+cancer+cell+metastasis.">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).</li><li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell+niche:+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells.">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).</li><li>Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li><li>Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li><li>Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+lung.">Live imaging of the lung.</a> Cur Protoc Cytom. , (2012).</li><li>Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+separated+antigen+uptake+by+alveolar+dendritic+cells+and+airway+presentation+to+T+cells+in+the+lung.">Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung.</a> J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).</li><li>Mendoza, A., Hong, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung.">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).</li><li>Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+cellular+dynamics+of+lung+immunity.">The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity.</a> Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Hadjantonakis, A. -. K., Macmaster, S., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+and+mice+expressing+different+GFP+variants+for+multiple+non-invasive+reporter+usage+within+a+single+animal.">Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal.</a> BMC Biotechnol. 2, (2002).</li><li>Casbon, A. -. J., Reynaud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+breast+cancer+reprograms+early+myeloid+differentiation+in+the+bone+marrow+to+generate+immunosuppressive+neutrophils.">Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenteral+injections.">Parenteral injections.</a> Curr Protoc Immunol. , (2006).</li><li>Halpern, J., Lynch, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+a+murine+bone+bioreactor+as+a+model+of+tumor:+bone+interaction.">The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction.</a> Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).</li><li>Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).</li><li>Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+myeloid+cells+dynamics+in+ApcMin/++intestinal+tumors+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer cell. 21 (4), (2012).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+transplantation+of+stromal+cells+and+carcinoma+cells+in+C57BL/6J+mice.">Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).</li><li>Wong, C. W., Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+location+of+breast+cancer+cells+after+spontaneous+metastasis+to+the+lung.">Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung.</a> Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).</li><li>Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ex+vivo+lung+perfusion+as+a+platform+for+transplantation+research.">Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research.</a> World J Exp Med. 4 (2), (2014).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28 (2), (2000).</li><li>Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+suppressor+cells+and+immune+modulation+in+lung+cancer.">Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer.</a> Immunotherapy. 4 (3), (2012).</li><li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia.">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).</li><li>Kreisel, D., Nava, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose. All animal experiments were conducted in accordance with IACUC approved protocols, UCSF.

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung von Lungenmetastasen in Maus-Modellen der Metastasierung. Diese Bildgebungsprotokoll stellt eine direkte Visualisierung der Dynamik und räumliche Tumorzell-Stroma-Interaktionen innerhalb der Lunge Mikroumgebung. Es ist eine relativ einfache und schnelle Methode, die für mindestens 4 h zuverlässige Abbildung von Lungenmetastasen ermöglicht. Filme aus diesen Experimenten erworben kann verwendet werden, um dynamische Prozesse wie Zellbeweglichkeit und zellulären Interaktionen zu verfolgen. Zwei Verfahren zur Erzeugung von Lungenmetastasen wurden beschrieben: eine gentechnisch veränderte Maus-Modell und die Verwendung eines manipulierten Zelllinie. Der MMTV-PyMT Mausmodell rekapituliert Brustkrebs Progression und spontanen Lungenmetastasen. Andere Techniken, die Metastasierung rekapitulieren stehen ebenfalls zur Verfügung, z. B. orthotope Transplantation von Zellen in der Brustdrüse 20. Eine intravenös injiziert VO-PyMT cell Linie dient Metastasierung nachzuahmen Säen und Auswuchs von Brustkrebs. Die Zeitvorgabe für VO-PyMT Zellauswuchs ist abhängig von der experimentellen Vorliebe für die Bühne von Lungenmetastasen. Abhängig von der Anzahl der injizierten Zellen, können Mikrometastasen innerhalb von einigen Tagen bis 2 Wochen nach der VO-PyMT Zellinjektion zu beachten. Für eine optimale Bildgebung der Lunge muss große Sorgfalt beim Aufblasen der Lunge entnommen werden. Für die richtige Inflation sollte die Nadel nur 4-5 mm in die Luftröhre eingeführt werden. Tiefer Einführen der Nadel kann in Teil, einseitige Aufblasen der Lunge führen. Darüber hinaus sollte die Lunge während der eigentlichen Inflation zu verhindern, dass über-Inflation, die sich ergeben können Gewebeschäden beobachtet werden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Lunge so steril wie möglich zu halten, so dass die Immunzellen in der Lunge wird nicht in Frage gestellt werden. Für jede Echtzeit-Bildgebung Experiment, die optimale Balance zwischen der Menge an Datenerfassung und the Potential von Gewebe durch zu hohe Laserbelichtung verursacht werden muss berücksichtigt werden. Es ist wichtig, die Einstellungen für die Bildaufnahme zu optimieren, indem Pilotversuche laufen. Außerdem empfiehlt es sich, die Laserleistung zu halten, während für eine optimale Sichtfeldern gesucht und / oder den Verschluss zu halten, wenn die Bilder nicht erworben. Die Beweglichkeit der Krebs und / oder Immunzellen in der Umgebung ist einer der Indikatoren für die Vitalität der Zellen. Motilität ist empfindlich gegenüber Temperatur, Sauerstoffgehalt, und Phototoxizität 7. Jedoch kann nicht die Hemmung oder das Fehlen von Motilität Abbildungsbedingungen oder technische Probleme in Beziehung gesetzt werden, sondern biologisch. Hemmung der Beweglichkeit kann aus einer bestimmten therapeutischen Wirkung führen oder von der Verhaftung von metastatischen Zellen unmittelbar vor deren Proliferation in der Mikrovaskulatur der Lunge und ihre Extravasation in das Lungenparenchym 21,22. Es kann daher wichtig sein, solche Daten zu untermauern mit zusätzlichenTechniken (wie Migrationsassays in 2D Kultur) 23. Darüber hinaus ist diese ex vivo Bildgebung der Lunge Methode ist ausreichend für eine Kurzzeitstudie, die nicht Lungenmikrozirkulation erfordert. Mit dieser Methode Bewegung von Krebs und / oder Immunzellen ist für mindestens 4 h beobachtet. Vor der Bildaufnahme, dauert es etwa 30 Minuten in die Lunge und 30-60 Minuten zu bereiten Positionen für den Erwerb zu finden. Obwohl der Zellbeweglichkeit über 4 Stunden beobachtet wird (bis zu 11 h, Movie 3) hängt längeren Bildgebung auf den jeweiligen Zelltypen untersucht, die verwendeten Bedingungen (z. B. reduzierte Sauerstoff) und sollte für einen bestimmten Versuchsaufbau bestimmt werden. Außerdem ist es aufgrund des Fehlens der Mikrozirkulation und die möglichen Auswirkungen von postmortalen Veränderungen oder, falls es ein Grund für die Notwendigkeit besteht, die Ergebnisse in der Anwesenheit eines intakten Mikrozirkulation, der Lunge Intravital Bildgebung mit einem Brust Ansaugfenster zu verifizieren, verwendet werden. Es ist jedoch still eine Herausforderung intravital Bildgebung der Lunge über mehrere Tage durchzuführen, ein bildgebendes Fenster unter Verwendung der in Gehirn, Brustdrüse und Bauchorgane 5 aufgrund von Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung ausreichender Unterdruck durchgeführt. Als ein alternatives Verfahren für die Perfusion von intakten ex vivo Lunge, der isoliert perfundierten Lunge Methode wurde bisher verwendeten Lungenmetastasen zu untersuchen. Jedoch wird dieses Verfahren oft für größere Tiere verwendet. Da Mäuse kleiner Brusthöhle haben, stellen sie eine echte Herausforderung für eine effektive Durchblutung 24. Aufgrund der Lichtstreuung, die Abbildungstiefe der Spinnplatten konfokalen Mikroskopie ist begrenzt. Infolgedessen Visualisierung von Zelldynamik und zelluläre Wechselwirkungen an oberflächlichen Lungenmetastasen beschränkt. Lungenmetastasen in der Lungenperipherie angereichert da metastatischen Zellen von den Kapillaren eingeschlossen sind, die 1 in der Größe zu den äußeren Rändern der Lunge zu verringern. Darüber hinaus ist es easier die Lebensfähigkeit der Zellen näher Oberfläche der Lunge zu erhalten, da sie Zugang zu Medien und Sauerstoff bevorzugt sind. Damit tiefer Visualisierung in die Lunge, kann die Live-Darstellung von Lungenschnitten durchgeführt werden. Allerdings sollte beträchtliche Menge an Zelltod zu erwarten. Alternativ können Multiphotonen-Mikroskopie werden größere Gewebepenetration durchgeführt, so dass. Zusätzlich erzeugt Multi Abbilden eines intrinsischen optischen Signals, genannt Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG), die die Visualisierung von nicht-zentrosymmetrischen Strukturen in der extrazellulären Matrix, wie Kollagen 1 Fasern ermöglicht. Wie in dieser Studie gezeigt, können Tumor und Immunzellverhalten in Lungenmetastasen folgen und analysiert fluoreszierenden Reporter Mäusen manipuliert Tumorzellen und fluoreszenzmarkierte Tracer oder Antikörpern. Diese Methode kann für die Untersuchung von anderen Zellen und Faktoren innerhalb des metastatischen Mikroumgebung modifiziert werden. Zu diesem Zweck gibt es verschiedene transgenic Reporter Mäusen für Stromazellen Studie unter anderem für Fibroblasten als FSP1-EGFP 4, alpha-SMA-RFP 25 und COL1A1-EGFP 25 oder Endothelzellen als Tie2-GFP 26. Zellfärbung von lebenden Lungenschnitten durchgeführt worden Populationen von Immunzellen 8 zu visualisieren. Diese Färbung Strategie kann für den Mehrfarbenbildaufnahme als Alternative angenommen werden. Jedoch Mehrzahl von Markern beschriften oft mehrere Zellpopulationen anstelle eines gesonderten Zellpopulation. Injektionspräparate, die von spezifischen Zellpopulationen 4 oder fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen zusätzliche Zellmarker aufgenommen werden, können verwendet werden, um zwischen Populationen zu unterscheiden. Die Verwendung von verschiedenen fluoreszierenden Farben die verschiedenen Zellen von Interesse zu kennzeichnen ist für die Bildgebung bevorzugt. In Fällen, in denen die Verwendung von verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen nicht durchgeführt werden kann (z. B. aufgrund der begrenzten Abbildungs ​​channels), ist es möglich, Bild verschiedenen Zelltypen mit der gleichen fluoreszierenden Reportern, solange sie durch Form und / oder anatomischen Lokalisation leicht unterscheidbar sind. Zusätzlich zu den verschiedenen Zelltypen zu studieren, sind mehrere Klassen von Chemotherapeutika schwach fluoreszierend (wie beispielsweise Doxorubicin). Diese Chemotherapeutika kann im Prinzip verwendet werden, um Arzneistoffabgabe und die Verteilung in Lungenmetastasen in ähnlicher Weise wie in Primärtumor 19 visualisieren. Andere zielgerichtete Therapeutika, die auch in Ex-vivo-Bildgebung der Lunge verwendet werden fluoreszenzmarkierte werden konnte. Bemerkenswert ist, könnten die Daten mit der Lungenbildgebung erworben sein informativer, über die Zellen, die diese Medikamente und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellen innerhalb des metastasierten Mikroumgebung zusätzlich zu den Austritt von dieser Therapeutika aus dem aktiven Blutgefäße Aufnahme. Diese Technik kann weiter für die Untersuchung von primären Lungenkrebs 27 oder für die Untersuchung von anderen Lungen angepasst werdenbezogene Pathologien, die die Lunge Mikroumgebung 28,29 beeinflussen können.

The deadliest aspect of cancer is metastasis, which accounts for more than 90% of cancer-related morbidity and mortality1. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular mechanisms that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. To metastasize, tumor cells in the primary tumor must detach from their neighboring cells and basement membrane, cross through the extracellular matrix, intravasate, travel via blood or lymphatic vessels, extravasate at the secondary site, and finally, survive and establish secondary tumors. In addition to the properties of the tumor cells, the contribution from the microenvironment, which includes the adjacent stroma along with the normal counterparts of the cancer cells, is crucial for the seeding and establishment of metastatic lesions2.
Traditional methods to study metastatic seeding and growth examine static states, as tissues are excised and sectioned for histology. These data only generate a snapshot of this highly dynamic process. Although some useful information can be gained from these studies, the complicated process by which tumor and stromal cells interact during metastatic formation cannot be adequately assessed by these methods. Furthermore, it is not possible to gain insights into tumor or stromal cell migration patterns, which are important in establishing a colony at the distant site. In order to effectively study the metastatic process, it is essential to visualize various interactions between cancer cells and their microenvironment in a continuous manner and at real time. 
The lung is a common site for metastases from solid tumors as breast, colorectal, pancreatic cancer, melanoma and sarcoma3. Intravital imaging was previously used to study cell-cell interaction in various primary tumor and metastatic models4,5. Methods of lung imaging in mice, including intravital imaging, lung section imaging, and an ex vivo pulmonary metastasis assay have been published6&#8211;9. Intravital imaging of mouse lungs utilizes a thoracic suction window to stabilize the lungs6. This method is used for time-lapse imaging of the lung microcirculation and alveolar spaces. The anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. In order to access the lungs, the chest cavity must be opened which leads to loss of negative pressure and collapsed lungs. This method only allows the visualization of a small part of the lungs and is technically demanding; an unnecessary complication in studies that examine processes that are independent of blood flow. Moreover, this method also requires gating out movement caused by breathing. This is done either by collecting images between breaths or during post image acquisition analyses10. The alternative ex vivo lung section imaging provides stability and depth, and also prepares lung parenchyma for immunostaining7. However, the lengthy sectioning process leads to an extensive delay between the time of animal sacrifice and the start of the imaging session. Moreover, the process of sectioning a mouse lung causes considerable amount of cell death8, thus interfering with the quality and quantity of imaging samples and perhaps needlessly altering tumor-stroma interactions. In order to technically bridge between the methods of intravital imaging and lung section imaging, while exploiting the advantages of the two techniques, a relatively fast and easy method for ex vivo lung imaging was developed. This method was achieved by imaging of non-sectioned whole lung lobes. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MMTV-PyMT/FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>2374</td>
			<td>Female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB-ECFP/FVB mice</td>
			<td>UCSF Werb lab</td>
			<td></td>
			<td>Female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-fms-EGFP/FVB mice</td>
			<td>UCSF Werb lab</td>
			<td></td>
			<td>Female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>1800</td>
			<td>Female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP+ VO-PyMT cells</td>
			<td>UCSF Werb lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1818</td>
			<td>Dilute to&#160; 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20&#160; &#176;C. Use 0.4 mg per animal.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Dilute to&#160; 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20&#160; &#176;C. Use 0.4 mg per animal.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td>UCSF Monoclonal antibody core</td>
			<td></td>
			<td>Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>UCSF cell culture facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, USP sterile&#160;</td>
			<td>Amresco INC</td>
			<td>K813-500ML</td>
			<td>Ultra pure grade for i.v. injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will be used as dissection board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors sharp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td>Turn ON 30min before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td>UCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>UCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide</td>
			<td>UCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe without needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1/2 needle&#160;&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>for i.v. injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G x 1 needle, short bevel&#160;&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting-temperature agarose&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50111</td>
			<td>To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 &#176;C water bath until used for inflation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium without phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Imaging plate&#160;</td>
			<td>E&#38;K scientific</td>
			<td>EK-42892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides, 15 mm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-031-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CO2 and temperature controller</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>DGTCO2BX</td>
			<td>http://www.oko-lab.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Climate chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>http://www.oko-lab.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICCD camera</td>
			<td>Stanford Photonics</td>
			<td>XR-Mega-10EX S-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal scan-head</td>
			<td>Yokogawa Corporation</td>
			<td>CSU-10b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mManager</td>
			<td>Vale lab, UCSF</td>
			<td></td>
			<td>Open-source software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment

Metastasierung ist eine Hauptursache für krebsbedingten Morbidität und Mortalität. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess und aufgrund seiner Komplexität, die genauen zellulären und molekularen Prozesse, die metastatische Verbreitung und Wachstum sind immer noch schwer zu regieren. Echtzeit-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung der dynamischen und räumlichen Wechselwirkungen von Zellen und ihrer Mikroumgebung. Soliden Tumoren metastasieren häufig in die Lunge. Jedoch stellt die anatomische Lage der Lungen eine Herausforderung für die intravital Bildgebung. Dieses Protokoll stellt eine relativ einfache und schnelle Methode zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung Stroma in Lungenmetastasen. Mit dieser Methode kann die Motilität von Krebszellen als auch Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Stromazellen in ihrer Mikroumgebung für mehrere Stunden in Echtzeit visualisiert werden. transgenen fluoreszierenden Reporter-Mäuse Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Zelllinie, injizierbare fluoreszenzmarkiertenMoleküle und / oder Antikörper, mehrere Komponenten der Lunge Mikroumgebung visualisiert, wie Blutgefäße und Immunzellen werden. Um das Bild zu den verschiedenen Zelltypen, eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop, das langfristige kontinuierliche Bildgebung mit schnellen, vierfarbige Bildaufnahme ermöglicht verwendet wurde. Zeitraffer-Filme aus Bildern zusammengestellt mehrere Positionen und Brennebenen gesammelt über zeigen Wechselwirkungen zwischen Live-metastatischen und Immunzellen für mindestens 4 Stunden. Diese Technik kann weiter zu testen Chemotherapie oder gezielte Therapie verwendet werden. Darüber hinaus könnte dieses Verfahren für die Untersuchung von anderen Lungenbezogenen Pathologien angepasst werden, dass die Lunge Mikroumgebung beeinflussen.

Mit Spinnen-Scheibe konfokalen Mikroskopie, verschiedene Mausmodellsystemen und Injektionen kann der metastatischen Mikroumgebung sichtbar gemacht und im Laufe der Zeit verfolgt werden. Mit Hilfe eines MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP dreifach transgenen Mausmodell, verschiedenen zellulären Komponenten werden fluoreszenzmarkierten (2A, Film 1). Die typische Struktur des Lungenparenchym kann in der GFP-Kanal sichtbar gemacht werden, da alle Zellen unter der β-Actin-Promotors exprimieren ECFP. Größere / vielzelligen Lungenmetastasen leicht gelöst werden, da diese als Masse der Zellen innerhalb der organisierten Lungenstruktur angezeigt. Myeloischen Zellen werden in der GFP Kanal durch c-fms visualisiert -EGFP Ausdruck, der das Transgen für CSFR-1 ist 12. Myeloischen Zellen sind sehr dynamisch, da sie während des Abbildungsfeldes migrieren. C-fms -EGFP-positive Zellen reichlicher und Migrations in Lungenparenchym sind in engem Kontakt mit der Lunge im Vergleich zu denenMetastasierung. Die Dynamik der myeloischen Zellen und ihre Wechselwirkungen mit Lungenmetastasen kann in Echtzeit über mehrere Stunden eingehalten werden. Um zu untersuchen, wird metastasierendem Aussaat und Wachstum, eine experimentelle Metastasierung Modell (2B, Movie 2). Die GFP + VO-PyMT Tumorzellen wurden in ein Wildtyp, nicht-Reporter Maus injiziert und man ließ sie für 2 Wochen Saatgut und zu wachsen. Die Struktur der Lunge ist deutlich sichtbar in der GFP-Kanal durch Autofluoreszenz der Lunge. Jedoch sind die VO-PyMT Zellen immer noch leicht von der Lungenstruktur, da sie eine runde Form und eine höhere EGFP Expressions so heller erscheinen, verglichen mit dem Lungenparenchym haben. VO-PyMT zellulären Beweglichkeit innerhalb des etablierten metastatischen Läsion beobachtet werden. Zellulären Interaktionen zwischen metastasierten und Immunzellen in der Lunge Mikroumgebung kann auch mit Hilfe der experimentellen Metastasierung Modell untersucht werden. Zwei Wochen nachInjektion von VO-PyMT Zellen fluoreszierend markierten Gr-1 647 konjugierten Antikörper sind iv 5 h vor der Lunge Exzision (2C, Movie 3) injiziert. Auf der linken Seite des Abbildungsfeldes, zwei Gr-1 + myeloiden Zellen interagieren mit einer VO-PyMT Zelle. Eine metastatische Läsion ist auf der rechten Seite des Abbildungsfeldes beobachtet. Im Laufe der Zeit, Gr-1 + Zellen werden dem metastatischen Läsion rekrutiert. Unterhalb der metastatischen Läsion, einer der Gr-1 + Zellen in enger Wechselwirkung mit einem PyMT-VO Zelle. Schließlich löst die VO-PyMT Zelle, von der + Zelle Gr-1 löst. Immunzellen Kennzeichnung transgenen Mausmodellen mit der experimentellen Metastasen-Modell und injizierbare Antikörpern führt zu einem Drei-Farben-Film Reporter kombiniert wird. Eine Woche nach der Injektion von VO-PyMT Zellen in eine ACTB-ECFP Reporter Maus, fluoreszenzmarkierten Gr-1 647 konjugierten Antikörper sind iv 5 Stunden vor der Gewebeentnahme injiziert (2D, Film4). Gr-1 + Zellen wandern kräftig innerhalb des Sichtfeldes, während ein einzelner GFP + metastatischen Zellen in der Mitte des Abbildungsfeldes sichtbar ist. Injizieren verschiedenen fluoreszierenden Dextrane in Reporter-Mäuse, die mit metastatischen Zellen zuvor injiziert wurden, kann ein Vier-Farben-Film (2E, Filme 5-6) ergeben. Frühe Ereignisse in der Aussaat von Metastasen untersucht werden, wenn VO-PyMT Zellen sichtbar gemacht werden sofort und 4 Stunden nach iv Injektion in ACTB-ECFP Reporter Mäusen. Die Injektion von Rhodamin-konjugierten, 70 kD und 10 kD Dextran Dextran an eine fluoreszierende Markierung konjugiert ist 647 ermöglicht die Visualisierung von Lungenkapillaren. Die Verwendung von niedrigeren und höheren Molekulargewicht Dextrane könnte möglicherweise Änderungen genutzt werden in der Permeabilität der Kapillaren in der Lunge zu erkennen, da die niedermolekularen Molekülen extravasieren schneller im Vergleich zu den hochmolekularen diejenigen 19. Obwohl Cellul<html> ar Ereignisse können immer noch effektiv untersucht werden, Film 5 ist ein Beispiel für ein Gewebe Drift. Falls erforderlich und in dem Fall kann das Gewebe während der Bildgebungssitzung neu positioniert werden, kann dies während des POST Bild korrigiert werden Erfassung analysiert. Dieses System ermöglicht eine schnelle, Vierfarbenerfassung kontinuierlichen Bild unterschiedlichen fluoreszierend markierten Zelltypen innerhalb der Lunge Metastasen Mikroumgebung zu folgen. Dieses Protokoll ermöglicht auch die Darstellung von Metastasen verschiedener Größen von Ereignissen zum Animpfen einzelner Krebszellen etablierten Metastasen im Zusammenhang. Außerdem Bewegung Tumorzellen und Stromazellen können zusammen mit Blutgefäßen in der Lunge Mikroumgebung visualisiert werden. Typischerweise kann zelluläre Bewegung für mindestens 4 Stunden vom Beginn der Bildgebungssitzung zu beobachten. Die Beobachtung von verschiedenen metastatischen Mikroumgebungen innerhalb der gleichen Lungengewebe hilft Maus-zu-Maus-Variabilität zu vermeiden. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53741/53741fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Bilder aus Filmen von Echtzeit-Bildgebung erworben. (A) Schnappschuss eines fusionierten Z-Stack von Film 1 myeloischen Zellen, die mit einer Lungenmetastasen (gelb-Einlage) im Vergleich zu denen, die mit dem Lungenparenchym (rot Einsatz) zeigt. (B) Schnappschuss eines fusionierten Z-Stack aus Film 2 zeigt GFP + metastatischen Zellen in einem experimentellen Metastasen-Modell. Pfeilspitze zeigt auf eine bewegliche metastatischen Zelle. (C) Snapshot einer Z Stapel von Film 3 zeigt Kolokalisation von Fluoreszenzsignalen von einer GFP + Metastasierung und Gr-1 + durch eine Gr-1-Antikörpers an einen 647-Tag konjugiert visualisiert Zellen (rote Pfeilspitze). Grün Pfeilspitze zeigt auf eine GFP + metastatische Zelle, die von der metastatischen Masse verdrängt. Weiße Pfeilspitze zeigt auf eine Gr-1 + Zellen, die mit dem beweglichen GFP + VO-PyMT Zelle interagiert. (D) Schnappschusseine fusionierte Z-Stack von Film 4 GFP + VO-PyMT Zellen zeigt, in ACTB-ECFP Maus. Eine einzelne VO-PyMT Zelle ist sichtbar in der Mitte (grün Pfeilspitze). Das Tier wurde mit Gr-1 647 konjugierte Antikörper injiziert. (E) repräsentative Z-Stapel der Filme 5 und 6 die Blutgefäße in der Lunge von Mäusen zeigt, das unmittelbar nach der Injektion von 70 kD Rhodamin-Dextran (rote Pfeilspitze) zusammen mit den GFP + VO-PyMT Zellen (grün). Maßstabsbalken sind 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/53741fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Ergänzende Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53741/53741supfig1.jpg" /> Ergänzende Abbildung 1. Screenshots von ZEN-Kamera-Software für die Erfassung von Bildern. (A) zunächst in der &quot;Light Path &#39;Werkzeug das richtige Ziel (rotes Feld) und th gewählt werden sollte,e Gewebe im Mikroskop lokalisiert werden. (B) Konfigurieren Kanäle für die Bilderfassung, in die kann &#39;Channels&#39; Werkzeug Kanäle gelöscht (rotes Feld) werden oder hinzugefügt (gelber Kasten). (C) In der &quot;Fliesen&quot; Werkzeug können verschiedene Positionen des Experiments zugegeben werden. (D) In der &quot;Z-Stack &#39;Tool können die Z-Stapel gesetzt werden und die Dicke der Scheiben kann eingestellt werden. (E) in der &quot;Time Series&quot; -Tool, die Dauer und Intervall eingestellt werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/53741supfig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53741/53741movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/Movie1.mov">Film 1. (Rechtsklick zum Herunterladen).</a> Wechselwirkungen zwischen einer Lungenmetastasen und sur. unter Verwendung von Immunzellen transgener Mäuse Reporter Rundungs ​​Dieser Film zeigt eine Metastase in der Lunge von einer Dreifach-transgenen MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP Maus in dem alle Zellen mit ECFP und myeloide Zellen markiert sind, mit EGFP markiert. Die Metastasierung kann als ein Großteil der Zellen in blau im Gegensatz zu der normalen Lungenarchitektur zu beachten. C-fms + myeloiden Zellen im gesamten Bildfeld wandern. Dieser Film ist ein 2 Std 1 Min Akquisition. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53741/53741movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/Movie2.mov">Film 2 (Recht auf Download klicken).</a> Krebszellbeweglichkeit in einem experimentellen Metastasen-Modell. Dieser Film zeigt eine Lunge nach intravenöser Injektion von GFP + VO-PyMT (grün) Zellen in ein Wildtyp, nicht-Reporter, Maus erzeugt Metastasierung. Lungen wurden zwei Wochen nach Injektion von VO geerntet-PyMT Zellen. GFP + Zellen innerhalb des metastasierten Masse bewegen. Dieser Film ist ein 4 h 40 min lang Akquisition. <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/53741/53741movie3.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/Movie3.mov">Film 3 (rechts zum Download anklicken).</a> Die Rekrutierung von Immun visualisiert Zellen durch fluoreszenz konjugierte Antikörper zur Metastasierung experimentell ermittelt. Dieser Film zeigt eine Lungenmetastasen, die durch iv Injektion von GFP + VO-PyMT Zellen (grün) in einem Wildtyp, nicht Reporter, Maus. Die Lungen wurden zwei Wochen nach der VO-PyMT Zellen geerntet injiziert. Gr-1 + Zellen werden mit Gr-1 647 konjugierter Antikörper und beobachtet im nahen Infrarotkanal (white) markiert. Beachten Sie, dass Gr-1-Zellen mit dem GFP + Metastasen rekrutiert werden. Dieser Film ist ein Beispiel für eine Langzeiterfassung, insgesamt 11 h 27 min. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/Movie4.mov">Film 4. (rechts zum Download anklicken).</a> Motilität von Immun visualisiert Zellen durch fluoreszenz konjugierte Antikörper in einer transgenen Reporter Maus mit metastatischen Zellen injiziert. Dieser Film zeigt eine einzelne GFP + VO-PyMT Zelle in der Lunge, die durch iv Injektion von VO- PyMT Zellen (grün) in ein ACTB-ECFP Maus. Die Lungen wurden eine Woche nach der VO-PyMT Zellen injiziert wurden geerntet. Gr-1 + Zellen werden mit Gr-1 647 konjugierter Antikörper und beobachtet im nahen Infrarotkanal (white) markiert. Dieser Film ist ein 2 h 40 min lang Akquisition. <img alt="Film 5" src="/files/ftp_upload/53741/53741movie5.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/Movie5.mov">Film 5. (rechts klicken</a>k zum Download). metastatischen Zellen und Kapillaren visualisiert durch Fluoreszenz Dextrane unmittelbar nach iv Injektion in einer transgenen Reporter Maus. Dieser Film zeigt experimentelle Metastasierung, die durch iv Injektion von GFP + VO-PyMT Zellen (grün) in ein ACTB-ECFP Maus zusammen mit der Injektion von Rhodamin-konjugierten, 70 kD Dextran (rot) und 10 kD Dextran mit einem Fluoreszenz-Tag 647 (weiß) konjugiert ist, Blutgefäße zu markieren. Dieser Film ist ein Beispiel für ein Gewebe Drift und ist eine 18 min lange Akquisition. <img alt="Film 6" src="/files/ftp_upload/53741/53741movie6.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53741/Movie6.mov">Film 6. (Rechtsklick zum Herunterladen).</a> Metastatischen Zellen und Kapillaren von fluoreszierenden Dextrane mehrere Stunden nach iv visualisiert Injektion in einer transgenen Reporter Maus. Dieser Film zeigt experimentelle Metastasierung erzeugend durch iv Injektion von GFP + VO-PyMT Zellen (grün) in ein ACTB-ECFP Maus zusammen mit der Injektion von Rhodamin-konjugierten, 70 kD Dextran (rot) und 10 kD Dextran zu einer 647 fluoreszierende Markierung konjugiert (weiß), zu markieren Blutgefäße. Lungen wurden 4 Stunden nach der Injektion der VO-PyMT Zellen abgerufen. Dieser Film ist eine 19 min lange Akquisition.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment at JoVE.com

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen.

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

ex-vivo-live-imaging-of-lung-metastasis-and-their-microenvironment

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

12.3K Aufrufe.  University of California.  Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen. 

Serie: Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Forschung

Medizin

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, the preservation of pulmonary vessels that truly represents physiological conditions still presents challenges. In addition, the delicate configuration of murine lungs result in technical challenges preparing samples for high-quality images that preserve both cellular composition and architecture. Similarly, cellular contractility assays can be performed to study the potential of cells to respond to vasoconstrictors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these technical issues, the precision-cut lung slice (PCLS) method can be applied as an efficient alternative to visualize lung tissue in three dimensions without regional bias and serve as a live surrogate contractility model for up to 10 days. Tissue prepared using PCLS has preserved structure and spatial orientation, making it ideal to study disease processes ex vivo. The location of endogenous tdTomato-labeled cells in PCLS harvested from an inducible tdTomato reporter murine model can be successfully visualized by confocal microscopy. After exposure to vasoconstrictors, PCLS demonstrates the preservation of both vessel contractility and lung structure, which can be captured by a time-lapse module. In combination with the other procedures, such as western blot and RNA analysis, PCLS can contribute to the comprehensive understanding of signaling cascades that underlie a wide variety of disorders and lead to a better understanding of the pathophysiology in pulmonary vascular diseases.

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Presented here is a protocol for preserving the vascular contractility of PCLS murine lung tissue, resulting in a sophisticated three-dimensional image of the pulmonary vasculature and airway, which can be preserved for up to 10 days that is susceptible to numerous procedures.

Präzisionsschnitt-Lungenschnitte als effizientes Werkzeug für Ex-vivo-Studien zur Struktur und Kontraktilität von Lungengefäßen

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate personalized patient treatment. However, the absence of tumor-specific microenvironment in currently used models, e.g., patient-derived cell lines and xenografts, only allows limited predictive insights. Organotypic slice cultures (OTSCs) comprise intact multicellular tissue, which can be rapidly used for the spatially resolved drug response testing.
This protocol describes the generation and cultivation of viable tumor slices of pancreatic cancer and its metastasis. Briefly, tissue is casted in low melt agarose and stored in cold isotonic buffer. Next, tissue slices of 300 &#181;m thickness are generated with a vibratome. After preparation, slices are cultured at an air-liquid interface using cell culture inserts and an appropriate cultivation medium. During cultivation, changes in cell differentiation and viability can be monitored. Additionally, this technique enables the application of treatment to viable human tumor tissue ex vivo and subsequent downstream analyses, such as transcriptome and proteome profiling.
OTSCs provide a unique opportunity to test the individual treatment response ex vivo and identify individual transcriptomic and proteomic profiles associated with the respective response of distinct slices of a tumor. OTSCs can be further explored to identify therapeutic strategies to personalize treatment of primary pancreatic cancer and metastasis.

This protocol describes the preparation of organotypic slice cultures (OTSCs). This technique facilitates the ex vivo cultivation of intact multicellular tissue. OTSCs can be used immediately to test for their respective response to drugs in a multicellular environment.

Organotypische Schnittkulturen als präklinische Modelle der Tumormikroumgebung bei primärem Pankreaskarzinom und Metastasierung

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

Normotherme Unterdruckbeatmung ex situ Lungenperfusion: Beurteilung der Lungenfunktion und des Lungenstoffwechsels

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...