Die Pflege und Nutzung von Fischen in diesem Protokoll beschriebenen repräsentativen Ergebnisse generated in voller Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Boston Kinderkrankenhaus, Protokoll # 14-05-2673R festgelegten Leitlinien durchgeführt.

1. Rädertier Kultur <ol><li> Grundkomponenten eines Kultursystem mit einem 100 l Kulturgefäß <ol><li> Sammeln Sie alle Komponenten für die Rädertierchen Kultur Setup. Die Rotatorien Kultur Aufbau besteht aus einem Kulturgefäß (CV), um die Rotatorien wachsen; ein ähnliches Gefäß Zuführkopf Rädertierchen (Zuführkopf Kulturgefäß, FCV) aufrecht zu erhalten; ein Rundbrut jar (Feed-Reservoir, FR) für die Lagerung der Algen Futtermischung (AFM); eine Luftzufuhr (AS), um den Lebenslauf, FCV und der FR belüften; eine peristaltische Pumpe mit einem Messtimer (PMT), die Lieferung von Algen Zufuhr in den Lebenslauf und FCV zu steuern; und eine Zahnseide Partikelfilter (FPF), die innerhalb der CV sitzt. HINWEIS: Eine vollständige Liste mit Verbrauchsmaterialien und Komponenten in der Materialliste zur Verfügung gestellt. </li></ol></li><li> Konfiguration <ol><li> Heben die CV und FCV auf einem Ständer oder Tisch, so dass die Kulturen können bequem über eine Ablaufarmatur in einer Sammlung cont geerntet werdenainer (Abbildung 1). Verwenden flexible Luftzufuhrschlauch an den AS zu einer Länge von starren Rohr in jedem Kulturgefäß zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch lang genug ist, um Luft in den Boden des CV oder FCV zu liefern. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Leistungsluftleitung, um die AS auf eine Länge von starren Rohrleitung, die auf dem Boden der FR, die die AFM enthält sich zu verbinden. Installieren Sie ein Ventil in jedem Luftlinie um den Luftstrom zu regulieren. Verbinden Sie den FR in die PMT mit Futterförderrohr, und führen Sie den Schlauch von der PMT in ein Loch in der Seite des CV / FCV gebohrt, in der Nähe der Spitze. Abbildung 1. </li></ol></li><li> Anfang <ol><li> Füllen Sie das Kulturgefäß zu 90% des verfügbaren Volumens mit Umkehrosmose (RO). Wenn RO nicht verfügbar ist, verwenden Sie saubere, dechloriert kommunale Wasser; jedoch sollte ein biosecurity Risikobewertung durchgeführt werden, damit keine potentiell pathogenen Organismen im Quellwasser vorhanden sind. HINWEIS: Eine solche Analyse durchgeführt werden kannvon jedem qualifizierten Wasser Prüflabor. </li><li> Dosieren Sie das Kulturgefäß mit Wasser Aquarium Salz in einem Salzgehalt von 15 g / l zu erreichen. Gesetzt den Luftstrom in das Gefäß, so daß sie eine &quot;roll boil&quot; aufrechterhält und dann langsam die gemessene Menge an Salz zu dem Kulturgefäß, bis sie vollständig durch die Belüftung gelöst. Weiterhin Belüften des Wassers für&gt; 1 h, um sicherzustellen, dass sie vollständig mit Sauerstoff angereichert wird. </li><li> Machen Sie das Algenfuttermischung. Bis 3 l sauberem, frischem dechloriert (0 ppm) Wasser mit 100 g NaHCO 3 und 100 g Ammoniakneutralisationsmittel (Natrium hydroxymethylsulfonat). Diese letzte Reagenz bietet den zusätzlichen Vorteil, jede gegen restlichem Chlor aus dem Leitungswasser oder Bleich Rückstände aus Desinfektionskulturtechnik. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, daß diese Verbindungen vollständig gelöst. Dann fügen Sie 1 l Algenkonzentrat (Biomasse Trockengewicht ~ 15%). Fügen Sie die Futtermischung an den FR und bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie eine Starterkultur von 5-10000000 <em&gt; Brachionus plicatilis Rädertierchen mit dem CV mit dem belüfteten 15 g / l Salzgehalt Wasser. Wenn die Rotatorien haben während des Transports oder der Lagerung gekühlt worden ist, sollten sie nur langsam (während 30 min oder länger), um die Temperatur des Wassers in dem Kulturgefäß akklimatisiert (25-27 ° C). </li><li> Schalten Sie das PMT und beginnen Pumpen des Algen-Feed in das Rädertierchen Kulturgefäß. Verwendung des Zeitgebers Merkmal der PMT, setzen die Förderrate der Algen Futtermischung, so daß ~ 1,6 ml Algenbeschickungsmischung pro Million Rotatorien in der Kultur pro Tag geliefert. Verteilen der Fütterungen in kleinen Portionen in regelmäßigen Abständen über den Verlauf eines 24-Stunden-Zeitraum; desto häufiger Fütterungen, desto besser. </li><li> Kalibrieren der Fördermenge der Pumpe durch manuelles Einschalten der PMT für einen bestimmten Zeitraum (beispielsweise 1 min) und sammle die Algen, die es während dieser Zeit in einen Messzylinder oder Becherglas pumpt. Zum Beispiel, wenn die PMT Dosen 5 ml von Algen in 1 min, dann wird die Dosisleistung wäre5 ml Algen / min. </li><li> Berechnen Sie die erforderliche tägliche Förderrate durch Multiplikation der Zahl der anwesenden Rädertierchen, in Mio., um 1,6 ml. Zum Beispiel würde ein rotifer Kultur mit einer Populationsgröße von 100 Millionen Rotatorien ~ erfordern 160 ml Futter pro Tag (100 x 1,6 ml). </li><li> Stellen Sie die PMT, um die gesamte tägliche Futterbedarf in regelmäßigen Abständen während einer 24-Stunden-Zeitraum zu dosieren. Zum Beispiel könnte Lieferung einer gesamten täglichen Futtermenge von 160 ml in Portionen zugeführt werden, wenn alle 3 h über einen Zeitraum von 24 h unter Verwendung einer PMT Set mit einer Dosierpumpe Geschwindigkeit von 5 ml / min für 4 min, 8 Mal täglich (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 Fütterungen = 160 ml). </li><li> Lassen Sie die Kultur für 48 wachsen, bis es die gewünschte Population erzeugt, in der Regel - 72 h vor der Ernte. Bei 24 Stunden nach der Inbetriebnahme, die Zahnseide Partikelfiltern in den Kulturgefäß und beginnen normale Wartung. </li></ol></li><li> Instandhaltung HINWEIS: Die Kultur arbeitet auf einer kontinuierlichen Basis und erfordert routine Wartung, die im Idealfall zur gleichen Zeit jeden Tag durchgeführt werden, in der folgenden Reihenfolge. <ol><li> Füllen Sie den FCV zu 90% der zur Verfügung stehende Volumen mit sauberen, dechloriert frisches Wasser, mit 10 g / l Aquarien Salze dosiert. Sicherzustellen, daß das Wasser gut vermischt, und das gesamte Salz völlig aufgelöst ist. Stellen Sie den Luftstrom in den Behälter, so dass es eine &quot;rollenden kochen&quot; unterhält. Messen Sie den Salzgehalt mit einem Refraktometer und sicherzustellen, dass der Salzgehalt 10 g / l. Es ist kritisch, um dieses Ziel zu erreichen und es nicht zu überschreiten. </li><li> Probieren Sie die Rädertierchen im Lebenslauf: Stellen Sie sicher, dass die Kultur ist gut gemischt, dann sammeln Sie 3 Proben eines 2 - 3 jeweils mit einer Transferpipette oder autopipettor ml, aus verschiedenen Teilen der Kultur. Kombinieren Sie diese Proben in einem Rohr oder Fläschchen praktische Größe (zB 10 ml). </li><li> Transfer 1-2 ml der kombinierten Probe auf eine Petri-Schale, so dass es unter einem Präpariermikroskop visualisiert werden. Prüfen Sie die Qualität der Kultur (Schwimmverhalten derRädertierchen, Gegenwart abgelöst Eier, verunreinigen Protozoen). </li><li> Immobilisieren Rotiferen in dem verbleibenden kombinierten Probe durch Zugabe von 100 ul 50% Lugols Jodlösung auf die Probe. Innerhalb von Sekunden nach der Zugabe der Lugols, beachten Sie die Rädertierchen zum Schwimmen zu stoppen. Nun, leicht zu zählen die Rädertierchen. HINWEIS: Ethanol, verdünnte Bleichmittel, oder Essig kann anstelle von Lugols verwendet werden. Essig (2 Tropfen / 10 ml) hat den Vorteil, dass nicht gefährliche, Stärke nicht zu verlieren bei der Lagerung als Bleich und Jod-Lösungen, und nicht die Herstellung der Rädertierchen Vertrag, so dass die Korona der Zilien und der &quot;Fuß&quot; bleiben ausgefahren und der Tiere natürlicher aussehen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Probe gut gemischt (immobilisiert Rotatorien schnell absetzen), dann schnell einen ~ 2 ml Teilprobe in einer Plastikpipette und verzichten 1 ml in ein Sedgewick-Rafter Zählen Schieber (20 x 50 1-mm-Quadrate) (Abbildung 2 ). Mit Hilfe eines Sezieren oder zusammengesetzten Mikroskop, zählen Sie die intakte Rädertierchen und die tesamtanzahl Eier auf diese Rotatorien befestigt (Figur 2). Zählen Sie so viel von der Folienbereich wie nötig, um zu zählen ~ 100 Rädertierchen. Berechnen Sie die Anzahl der Rädertierchen pro ml, und notieren Sie diese in einer Tabellenkalkulation oder Logbuch. </li><li> Ernte ~ 30% des Volumens der Rädertierchen im Lebenslauf: Entfernen Sie die Luftversorgung und Zahnseide-Filter, das Ventil zu öffnen langsam an der Unterseite des CV und lassen Sie das Wasser in eine Planktonkollektor mit einer 53 &amp; mgr; m Sieb fließen. Sammeln das Wasser nach der Filterung in einen Eimer oder Drain aus der Unterseite des Kollektors fließt. Verwenden Sie einen sanften bis mäßige Strömung um eine Beschädigung der Rädertierchen. Erlauben nicht den Rädertierchen, um auf dem Bildschirm zu trocknen. </li><li> Aus Gründen der Einheitlichkeit ist es ratsam, das FCV mit einem Standard-Anzahl von Rädertierchen jeden Tag zu schaffen. Daher basierend auf der bekannten CV rotifer Dichte und Erntevolumen, einstellen FCV Gesamtvolumen auf eine konsistente Enddichte zu erreichen (z. B. 1.500 Rotatorien / ml). Fügen Sie die geerntet rotifers an den FCV: Behutsam die Rädertiere übertragen aus der Sammlung Bildschirm mit Hilfe einer Waschflasche mit sauberem Salzwasser gefüllt (10 bis 15 g / l). Kehren Sie die Bildschirm über den FCV und waschen Sie die Rädertierchen in den FCV mit einem sanften Strom von Salzwasser. Starten Sie das PMT zur Einspeisung in den FCV liefern (~ 1,57 ml pro Million Rädertiere pro Tag). </li><li> Scrub die gesamte Innenseite der CV mit einem sauberen, weichen Nylonbürste oder Scheuerpad. </li><li> Stellen Sie eine neue Mischung aus 15 g / L Wasser durch Zugabe der entsprechenden Menge des Salzes zu einer gemessenen Menge an sauberem RO-Wasser in einem 5-Gallonen-Eimer zu ersetzen, das Volumen des Wassers verloren bis zur Ernte. Fügen Sie das Salz in das Wasser in den Eimer und rühren Sie kräftig, bis es vollständig gelöst ist, und dann an den CV hinzuzufügen. </li><li> Mit Hilfe eines Hochdruck-Spray in einer Spüle, spülen Sie die Filterwatte, bis es frei von Abfall, und dann schicken Sie es an die CV. </li><li> Passen Vorschubgeschwindigkeiten von Algen an den CV durch Änderung der Dauer der einzelnen Dosierereignis geliefert, nach dem Tageszahl von Rädertierchen / ml.Verwenden der Berechnungen in Schritt 1.3.8 vorgesehen ist, über die entsprechende Futtermenge zugeführt werden zu bestimmen. </li><li> Etwa 24 Stunden später, wiederholen Sie den Vorgang. Starten durch Ernten der in der FCV (die nicht für den vorherigen Tag wurden benötigt) verbleibenden Rotatorien in der gleichen Weise wie oben beschrieben (Schritte 1.4.2 - 1.4.10). Konzentrieren sie in 2 l frischem, sauberem entchlortes Wasser (5 g / l Salz). Diese können bei 4 ° C als Sicherungsteil gespeichert werden, oder zur späteren Stadien von Fischfutter, das hinaus, was in diesem Protokoll beschrieben. Hinweis: Dieses Protokoll erlaubt bis zu 2 - 3 Tage von reduzierten Kulturpflege (mit normaler automatischer Zuführung), da die Rädertierchen in der CV können Unterlassung der Ernten ohne schwerwiegende Folgen zu tolerieren. </li></ol></li></ol> 2. Polyculture <ol><li> Konfiguration <ol><li> Sammeln Zebrafischembryonen aus einem Laichereignis durch Gießen hervorgebracht Embryonen durch ein Teesieb und dann sanft Spülen mit sterilem fish Wasser (oder einem anderen nicht-kontaminierten Quelle entsprechend aufbereiteter Lösung, zB Embryomedium, E3, etc.) aus einer Waschflasche in Petrischalen. </li><li> Die Embryonen bei 25 inkubieren - 28 ° C in Petrischalen in einer Dichte von 40 - 50 Embryonen pro Schale für 5 Tage. </li><li> Beginnen Sie den polyculture Phase am 5. Tag nach der Befruchtung, oder wenn mehr als 90% der geschlüpften Larven aktiv schwimmen in der Wassersäule. </li></ol></li><li> Impfung <ol><li> In 500 ml Rädertierchen Kultur direkt von der FCV zu einem 3,5 L Kindergarten Tank; Einbeziehung von Rädertierchen Kulturwasser bietet Algen Feed, den Nährstoffgehalt der Rädertierchen in polyculture hält. </li><li> Gießen Sie vorsichtig die Larven aus einer Petrischale in die Kinderstube Tank. Stellen Sie sicher, dass keine Larven in der Schale bleiben. </li><li> Gib 500 ml sauberem, konditioniert Fischwasser aus einem Kreislaufsystem oder dedizierten Wasserquelle zu dem Behälter, um ein Endvolumen von 1 l und eine endgültige s erreichenalinity von 5 g / L. HINWEIS: Dieser Salzgehalt ist kritisch, weil Zebrafischlarven überleben wird negativ beeinflusst, wenn Salzgehalt&gt; 7 g / l und Rädertierchen Überleben wird negativ beeinflusst werden, wenn Salzgehalt &lt;2 g / L. </li></ol></li><li> Polyculture Phase HINWEIS: Die Polykultur Phase sollte für bis zu 4 Tage nach der Inokulation dauern (insgesamt 5 Tage, entsprechend 5-9 Tage nach der Befruchtung). <ol><li> Mindestens einmal pro Tag während dieser Zeit beobachten die Polykultur Tank um sicherzustellen, dass Rädertiere und Fisch anwesend und wachsen. Stellen Sie sicher, dass die Rädertierchen in der gesamten Wassersäule sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die die fishs sind auch sichtbar in der Wassersäule, Schwimmen unter den Rädertierchen. </li><li> Starten normalen Wasserdurchfluss durch den Tank. Legen Sie einen Bildschirm oder Schallwand über die Ablauföffnung, dass die Larven zu gewährleisten sind nicht aus dem Tank ausgespült. HINWEIS: Am Ende dieser Phase, die Fische groß genug, um größere Beutetiere wie Artemia konsumierenNauplien oder verarbeitet werden Feed-Einträge in einem Größenbereich von 75 bis 125 &amp; mgr; m. HINWEIS: Die rotifer Populationsdynamik innerhalb eines repräsentativen Polykultursystems Tank wurden durch Abtasten gemessen / gezählt Rotatorien vom Tank in der gleichen Weise wie in den Schritten 1.4.2 - 1.4.5. Dies wurde einmal pro Tag ab dem Beginn des Mischkultur Phase durchgeführt, bis sie abgeschlossen war. </li></ol></li></ol>

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EG Henry wird von Reed Mariculture, Inc., einem Unternehmen, das Rädertiere, Algen Konzentrate und andere Lieferungen stellt der Aquakultur und Fischhobbymärkten beschäftigt.

Erfolgreiche Umsetzung der Rädertierchen polyculture Verfahren zum Zuführen frühen Larvenzebrafisch erfordert effektive Protokolle für zwei Aufgaben: die Schaffung und Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Rädertierchen Kultursystem, um die Fische zu füttern und das Züchten der ersten Fütterung Zebrafisch-Larven zusammen mit Rädertierchen in der gleichen Tank. Die Einrichtung für eine kontinuierliche salz rotifer Produktionssystem für Laboratorien Zebrafisch zuerst von Lawrence und Mitautoren 14 beschrieben wurde modifiziert und in einer Anzahl von Wegen verbessert es sowohl robuster und universell einsetzbar zu machen. Das neue Protokoll beinhaltet Verbesserungen sowohl in der Ausrüstung und Methodik. Das Speichersystem für die Algenfuttermischung beschäftigt heute Brut Gläser in Wels Produktionssysteme 15 verwendet. Lagerung des Futters in dieser Runddosen erleichtert eine Durchmischung der Algen Vorschub so dass es nicht zu schichten oder verklumpen und zu verstopfenging von Förderleitungen, ein Problem, das häufig geplagt das ursprüngliche Protokoll. Auch die Verwendung eines All-in-one programmierbaren Timer / Dosierpumpe reduziert jedoch die Anzahl der Bauteile und vereinfacht die dosierte Abgabe von Futter an die Rotatorien. Sie erlaubt auch die Dosierung von Beschickung zu Rotatorien stündlich über den Zeitraum von 24 Stunden, was bevorzugt zu weniger größere Fütterungen ist, weil das Futter effizienter assimiliert. Verfahren zum Zählen von Rädertierchen, die Feinabstimmung der Futtergabe an den Rädertierchen Kultur ermöglicht hat in diesem Protokoll aufgenommen worden. Die Fütterung der Rädertierchen auf der Grundlage einer genauen Echtzeitbewertung ihrer Bevölkerungsgröße stellt sicher, stabil, High-Level-Produktion. Eine Sekundär Zuführkopf Kulturgefäß wurde auch dem Protokoll hinzugefügt. Eine kontinuierliche Kultursystem kann einen täglichen Überschuss von zig Millionen von Rädertierchen hinaus, was selbst für einen großen Kindergarten Betrieb benötigt produzieren, aufgrund von Änderungen in der Baumschule Aktivität. Diese Zuführkopf Culture Fahrzeug wird zur Rädertierchen für die tägliche Inokulation von polycultures zu halten, und die verbleibenden Rädertierchen kann als hochwertige Nahrungsergänzungsmittel, die später Larven und frühen Jugendstadien der Fische gefüttert werden. Das reduziert den Salzgehalt (10 g / l) in der FCV auch vorge acclimates die Rädertierchen auf die Bedingungen in den polyculture Tanks, so dass sie kräftige Schwimmaktivität beizubehalten, wenn überführt. Wichtiger ist, diese Änderungen an die Rotatorien Kultivierungsprotokoll führen zu Verbesserungen in der Mischkultur Ansatz zu leiten, insbesondere in Bezug auf Arbeitsaufwand. Die bisherige Methode, mit besten und Co-Autoren beteiligt nicht nur eine anfängliche Inokulation von Rädertierchen an Tag 5, aber auch tägliche Zugaben von Rädertierchen, bis die statische polyculture Phase endete am Tag 9 12 veröffentlicht. Die mittlere Rädertierchen Dichten während dieser Zeit ihren Höhepunkt bei 333 Rädertierchen / ml am Tag der Impfung und am Ende unter 50 Rotatorien / ml bei der Beendigung des Mischkultur Phase am Tag 9 12. Im GegensatzDas aktuelle Protokoll hält viel höhere Dichten im gesamten, in der Regel ab ~ 665 Rädertierchen / ml, und endend mit ~ 481 Rädertierchen / ml an Tag 9. Es gibt zwei Faktoren, so dass diese viel höhere Dichten Rädertierchen. 1) Die Gesamt Robustheit der Rädertierchen Kultur für die Impfung verwendet wird, ist weit größer. Ferner der Schritt des revidierten Inokulieren der Mischkultur mit gleichen Volumina von Algen / Rotatorien bei 10 g / l Salzgehalt und ~ 0 g / l Salzgehalt Fischwasser, zu einer Zwischen Salinität von 5 g / L, die im gesamten Mischkultur gehalten wird. Beginnend mit einem größeren Volumen von Wasser (1 l) auch bessere Rahmenbedingungen für Rädertierchen Wachstum und Überleben in den polyculture Tanks. In der zuvor veröffentlichten Verfahren, niedrigere Anfangsrädertierchen Dichten in einem kleineren Volumen erforderte tägliche Zugaben von Rädertierchen, um Verluste durch Abrieb wieder aufzufüllen (vermutlich wegen der schlechten Wasserqualität) und Konsum durch die Entwicklung von Fischlarven. Die Ergebnisse dieser Anpassungen an den Protokoll dramattisch zu reduzieren Arbeitseinsatz (eine Fütterung über 4 Tage im Vergleich zu 4 Fütterungen in 4 Tage mit der bisherigen Methode). Larvenwachstum und Überleben Leistung über den ersten 5 Tag Polykultursystems Zeit ist vergleichbar mit der zuvor 12 bekannt. Die Produktivität der Rädertierchen Kulturen wird zwangsläufig durch die Vorschubeingabe beschränkt. Rotatorien Dichten von 2,000 - 3,000 / ml kann bei diesen Verfahren einfach durch Erhöhen der Futterlieferung erreicht werden kann. Wenn Rädertierchen Ertrag pro Einheit von Futter bekannt ist, kann Vorschubgeschwindigkeit eingestellt werden, um die Produktion Rädertierchen projiziert Bedürfnisse anzupassen. An Wochenenden und Feiertagen, können Fütterung vermindert und erntet für ein oder zwei Tage weggelassen ohne Schädigung der Rädertierchen, obwohl ihr Produktionspotenzial wird suboptimal, bis die normale tägliche Fütterung und ernten Routine fortgesetzt. Wenn es eine unerwartete Notwendigkeit für mehr Rotatorien als üblich, kann ein größerer Teil der Bevölkerung, ohne die cul geerntettur, aber abhängig von der Größe der Ernte die Kultur können eine oder mehrere Tage zu ihrer üblichen Dichte erholen. Wenn rotifer Bedarf für mehr als ein oder zwei Tage verringert werden, wird die Produktion besten durch Verringerung der Futterlieferung statt Verringern der Ernte verringert. Eine Ernte Rate von mindestens 25% / Tag unterhält eine jüngere Rädertierchen Altersprofil, so dass die Rädertierchen sind kräftig und fruchtbar, der Verbesserung ihrer Leistung in den polyculture Tanks. Dieses Protokoll wird leicht auf kleineren Skalen für kleinere Zebrafisch Einrichtungen angepasst. Zum Beispiel kann ein 15-l-Kultur, die sich in einer Standard-5 US-Gallonen (20 L) Eimer mit der Hand zu füttern zweimal täglich bequem eingestellt werden können, kann leicht zu erreichen eine Dichte von 1,000 Rädertierchen / ml. Verwendung einer Förderpumpe ermöglicht Dichten von 2000-3000 / ml. Eine einzige Schaufel bei 30% / Tag geerntet kann deshalb 5-15000000 Rädertierchen / Tag, genug, um 10 beginnen - 30 polycultures. Zwei Eimer kann in der gleichen CV + FCV-Protokoll, wie beschrieben, verwendet werden, einBove. Ein Algen + Ammoniak-Controller + pH-Puffer-Vormischung Feed ist verfügbar (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Verbrauchsartikel), die praktisch für kleinere Anwendungen ist. Es hat eine ausreichende Viskosität, daß die Algenzellen nicht absetzen und schnell, damit es nicht kontinuierlichem Mischen in der Zuführungsbehälter erforderlich. Wenn Rädertierchen Kultur Produktivität sinkt, oder eine ungewöhnliche Anhäufung von toten Rädertierchen in der Kultur gefunden, alle Wasserqualitätsparameter (Temperatur, Salzgehalt, pH-Wert, NH3-Konzentration) überprüft werden. Brachionus plicatilis trägt normalerweise seine Eier, bis sie ausbrüten, und die Gegenwart vieler nicht befestigten Eiern (die normalerweise nicht schlüpfen weiß) in der Kultur ist ein Anzeichen von Stress, am häufigsten durch Ansammlung von Ammoniak. Wenn die Rädertierchen Kultur Wasser ist ein intensiver grüner als sonst, dann entweder die Vorschubgeschwindigkeit ist zu hoch oder die Rädertiere sind nicht dem Konsum von Lebensmitteln in ihrem üblichen Rate. Ist in der Regel diese caentweder durch einen Stressfaktor oder der Kultur verwendet wurde, ohne Anpassung Vorschubrate entsprechend der reduzierten Population overharvested worden. In dichten Kulturen ist es normal, eine Braunfärbung im Wasser anreichern als Algenpigmente werden von den Rädertierchen metabolisiert. Die Verwendung von Salzwasser-Rädertierchen in der ersten Zuführungsphase wurde in großem Stil über den Zebrafisch-Forschung, da das Verfahren wurde erstmals im Jahr 2010 12 veröffentlicht angenommen. Die an die Polykultur Aufzuchtmethode, die in diesem Protokoll beschriebenen vorgenommen Änderungen werden eine noch größere Anzahl von zu ermöglichen Laboratorien, diesen Ansatz zu übernehmen, unabhängig vom Maßstab. Diese Fortschritte sind rechtzeitige; Entwicklungen in der Gen-Knockout-Technologie (z. B. CRISPR, Talens, etc.) für die Zebrafisch wird straffer und effizienter Aufzucht Protokolle erfordern, um Tausende von neuen Sorten von gentechnisch verändertem Fisch für den Einsatz in verschiedenen Bereichen der Wissenschaft zu wachsen.

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein herausragender Labortier in einer wachsenden Zahl von wissenschaftlichen Disziplinen verwendet, einschließlich, aber nicht Entwicklungsgenetik, Toxikologie, Verhalten, Aquakultur, Regenerationsbiologie und der Modellierung von vielen menschlichen Erkrankungen 1 begrenzt - 5. Obwohl die Spezies ist relativ einfach im Labor zu erhalten, gibt es eine Anzahl von Management-Herausforderungen mit ihrer Kultur 6 verbunden. Der prominenteste von ihnen ist Larvenaufzucht, vor allem, wenn der Fisch zuerst beginnen zu füttern im Anschluss an Gasblase Inflation 7. Unter normalen, kontrollierten Bedingungen erfolgt diese Entwicklungs Ereignis bei ~ 5 Tage nach der Befruchtung (DPF), mit den folgenden 3-5 Tagen Wachstum besonders kritisch 7. Die zentrale technische Schwierigkeit in dieser Phase ist es, die ernährungsphysiologischen Anforderungen der ersten Fütterung Larven adäquat zu begegnen - Futterteile müssen von geeigneter Größe sein, Digesvereinbar, attraktiv, und auf einem nahezu kontinuierlichen Basis, ohne dass übermäßige Abfälle in Kultivierungstanks. Historisch gesehen hat sich in der Regel durch die Bereitstellung von zahlreichen kleinen Futtermengen, um die Fische in Tanks, zusammen mit Routine Wasseraustausch 8,9 erreicht. Während diese Methoden sind zu einem gewissen Grad erfolgreich, sind sie ineffizient, erfordern einen hohen Arbeitseinsatz, und kehren nur variabel und begrenzten Wachstumsraten und Überlebensrate 10. In der Natur, Zebrafisch-Larven ernähren sich vermutlich in der Wassersäule 11 reichlich kleines Geschenk Zooplankton. Aus diesem Grund larviculture Protokolle, die Live-Feeds, wie Paramecium, Rädertierchen und Artemia übernehmen in der Regel die effizienteste 7. Im Jahr 2010, Top und Co-Autoren gezeigt, dass es möglich war, Larven Zebrafisch in statischen, Brackwasser sowie Salzwasserrädertierchen für die ersten 5 Tage exogene Fütterung 12 wachsen. Dieser Ansatz, der nutzbares die natürliche hohe Produktivität der Rädertierchen Kulturen zu reichlich, sehr nahrhaft Beute belasten das Wasser nicht zu schaffen, die Renditen sehr hohe Larven Wachstum und Überleben mit niedrigen Arbeitseinsatz 12,13. In den letzten Jahren haben immer mehr Labors auf der ganzen Welt Variationen dieses Protokoll anzuwenden sind, und viele jetzt Kultivierung Rädertierchen in einer kontinuierlichen Weise in den Kindergarten-Systeme 14 zu unterstützen. In den vergangenen Jahren wurden Methoden für die beiden Rädertierchen / Zebrafisch polyculture und Rädertierchen Produktion verfeinert und verbessert, um mehr standardisiert und leicht skalierbar sein. Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für 1) stetig und robust Rädertierchen Produktion und 2) die Einrichtung der Rädertierchen / Zebrafisch Polykultursystems verwendet werden, um ein robustes Wachstum der Fische für die ersten 5 Tage von exogenen Zuführung zu unterstützen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Infrastructure</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">100 Liter Culture Vessel</td>
			<td style="width:135px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td style="width:264px;">Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">5 Gallon Culture Bucket Kit</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">CCS Starter Kit</td>
			<td style="width:264px;">Small volume culture vessel for small facilities</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing 1/2&#34; O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Mesh tube</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">RT444X</td>
			<td style="width:264px;">Mesh tube support for floss filter</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rotifer Floss</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotifer floss 12&#8221; x 42&#8221;</td>
			<td style="width:264px;">Particulate waste trap</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD</td>
			<td style="width:135px;">Grainger</td>
			<td style="width:119px;">38M003&#160;</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture)</td>
			<td style="width:135px;">Coral Vue</td>
			<td style="width:119px;">SKU: IC-LQD-DSR</td>
			<td style="width:264px;">Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Silicone Tubing&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;">Tubing for algae delivery to rotifer vessel</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing &#34; O.D.,36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for air delivery to algae paste</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Rigid Clear Tubing O.D., 36&#8221;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">16025</td>
			<td style="width:264px;">Rigid clear tubing for algae delivery</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifers</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Type L 5 million</td>
			<td style="width:264px;">Rotifer stock culture for system startup</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Feed</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Sodium hydroxymethylsulfonate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">ClorAm-X&#174; 1lb tub</td>
			<td style="width:264px;">Ammonia reducer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S25533B</td>
			<td style="width:264px;">pH buffer for algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:305px;">Microalgae concentrate</td>
			<td style="width:135px;">Reed Mariculture</td>
			<td style="width:119px;">Rotigrow Plus&#174; 1 liter bag</td>
			<td style="width:264px;">Nutritionally optimized rotifer feed</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Water Preparation</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:305px;">&#160;Reef Crystals Reef Salt</td>
			<td style="width:135px;">That Fish Place</td>
			<td style="width:119px;">198210</td>
			<td style="width:264px;">Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Refractometer</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SR6</td>
			<td style="width:264px;">measuring salinity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Rotifer Culture Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Plankton Collectors 12&#34; Dia, 53 microns</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">BBPC20</td>
			<td style="width:264px;">Mesh screen for collecting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Scrub Pads</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">SCR-58</td>
			<td style="width:264px;">Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Scrub Brush</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:264px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Bucket</td>
			<td style="width:135px;">Grainger Supply&#160;</td>
			<td style="width:119px;">43Y530</td>
			<td style="width:264px;">Graduated bucket for mixing culture water</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Hatching Jar</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Ecosystems</td>
			<td style="width:119px;">J30</td>
			<td style="width:264px;">Storage of algae feed mix</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Lugol&#8217;s Solution, Dilute</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S99481</td>
			<td style="width:264px;">Agent used to immobilize live rotifers for counting</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Pentair Aquatic Eco-Systems</td>
			<td style="width:119px;">M415</td>
			<td style="width:264px;">Counting rotifers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:305px;">Miscelleneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:305px;">Tea Strainer</td>
			<td style="width:135px;">Kitchenworks</td>
			<td style="width:119px;">971972</td>
			<td style="width:264px;">Used for collecting zebrafish embryos after spawning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Die hier beschriebene kontinuierliche Rädertierchen Kultursystem ist dynamisch, und es ist normal, Rädertierchen Nummern zu einem geringen Teil im Laufe der Zeit schwanken, wenn Variationen in der täglichen Fütterung und Ernteraten. Die Bevölkerung der Rädertierchen in einem der aktiven Kulturen in den Aquakulturanlagen an der Boston-Kinderklinik, in der oben beschriebenen Weise gehalten wurde, wurde für 30 Tage (Abbildung 3) überwacht. Die Durchschnittskulturdichte in diesem Zeitraum bei 932 Rotatorien / mL, mit einem Maximum von 1.330 Rotatorien / ml und ein Minimum von 510 Rotatorien / ml. Dies stellt die typische Leistung einer rotifer Kultur in Übereinstimmung mit diesem Protokoll erhalten. Die Dynamik der Rotatorien Population in einer Mischkultur-Tank mit Zebrafisch ist in Abbildung 4 dargestellt. Ein 3,5 L Fischtank wurde mit 500 ml rotifer Kultur von FCV, 500 ml sterilisiertem f inokuliertish Wasser und 40 5-Tage alten Wildtyp (Tübingen Stamm) Larven, zu demonstrieren, wie Rädertierchen und Zebrafisch durchzuführen in einem typischen polyculture Tank. Die Rotatorien Bevölkerung in der Mischkultur Tank erreichte am zweiten Tag mit einer Dichte von 747 Rotatorien / ml (Figur 4). Die Dichte der Rotiferen in dem Mischkultur Tank sank über die 5 Tage Polykultursystems Periode auf ein Minimum von 481 Rotatorien / ml am Tag 5 Jedoch war die mittlere rotifer Dichte über den gesamten Zeitraum betrug 589,4 Rotatorien / ml, und der Minimalwert von 481 Rotatorien / ml ~ 10-fache der Rotatorien Dichte am Ende der Mischkultur Periode früher veröffentlichten Arbeit 12. Zebrafisch-Wachstum im Zeitraum von fünf Tagen wird in Abbildung 5 dargestellt. Die Fische zeigten stetiges Wachstum jeden Tag, von einer mittleren Länge von 3,904 mm ± 0,063 SEM, als sie auf die Polykultur Tank auf eine mittlere Gesamtlänge von 5,423 ± 0,063 SEM hinzugefügt amder letzte Tag des polyculture Phase. Überleben war 95% (38/40). Wasserqualitätsparameter wurden täglich in der repräsentativen Polykultursystems Behälter gemessen und sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Werte dieser Parameter ähnlich wie zuvor veröffentlichten Arbeiten 12 und stellen Bedingungen, die förderlich für das Wachstum und Überleben der beiden Rädertiere und Fische sind während der 5-Tage-Frist der polyculture. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Tag </td><td> Tag </td><td> Salzgehalt </td><td> BRÄUNEN </td><td> NO 2 </td><td> NO 3 </td><td> pH </td><td> Alkalinität </td><td> Härte </td><td> Temperatur </td></tr><tr><td> (Tatsächlich) </td><td> (nach der Befruchtung) </td><td> g / L </td><td> mg / L </td><td> mg / L </td><td> mg / L </td><td></td><td> mg / L (CaCO 3) </td><td> mg / L (CaCO 3) </td><td> ° Celsius &lt;/ td&gt; </tr><tr><td> Montag </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 8.4 </td><td> 120 </td><td> 425 </td><td> 23.2 </td></tr><tr><td> Dienstag </td><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 8.4 </td><td> 180 </td><td> 425 </td><td> 23,3 </td></tr><tr><td> Mittwoch </td><td> 7 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 8.3 </td><td> 240 </td><td> 425 </td><td> 22,3 </td></tr><tr><td> Donnerstag </td><td> 8 </td><td> 6 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 8.4 </td><td> 240 </td><td> 425 </td><td> 22,8 </td></tr><tr><td> Freitag </td><td> 9 </td><td> 7 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 7.9 </td><td> 240 </td><td> 425 </td><td> 22.2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Wasserqualitätsparameter ina Vertreter Zebrafisch Polyculture Panzer. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53629/53629fig1.jpg" /> Abbildung 1. Rädertier Kultur Setup-Legende:. Kulturgefäß (KG), Zuführkopf Kultur Fahrzeug (FCV), Luftversorgung (AS), Floss Partikelfilter (FPF), Algenfuttermischung (AFM), Feed-Reservoir (FR), programmierbare Mess Timer (PMT). Gezogenen Linien Algenfutterlieferung. Gestrichelten Linien Luftzufuhr. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53629/53629fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53629/53629fig2.jpg" /> Abbildung 2. Füllen eines Sedgewick Rafter-Counting Slide. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53629/53629fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick</a>Größere Version der Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53629/53629fig3.jpg" /> . Abbildung 3. Rotifer Bevölkerungsdynamik in Kultur über einen Zeitraum von 30 Tagen Legende: Die Anzahl der gezählten Rädertierchen (Weibchen Eier +) pro ml ist auf der x-Achse. Die Anzahl der Tage in der Kultur ist auf der y-Achse. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53629/53629fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53629/53629fig4.jpg" /> Abbildung 4. Rotifer Bevölkerungsdynamik während einer 5-tägigen Polyculture Legend:. Der Anzahl der gezählten Rädertierchen (Weibchen Eier +) pro ml ist auf der x-Achse. Die Anzahl der Tage in polyculture ist auf der y-Achse. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53629/53629fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um vi</a>ew eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53629/53629fig5.jpg" /> . Abbildung 5. Zebrafisch-Wachstum während einer 5-tägigen Polyculture Legende: Werte sind Mittelwerte Gesamtlänge in mm; Fehlerbalken stellen Standardfehler des Mittelwertes (SEM). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53629/53629fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Die vollständige und aktualisierte &quot;Rädertier Polyculture-Methode&quot; für die Aufzucht Erste Fütterung Zebrafisch

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.3K Aufrufe.  Boston Children's Hospital. Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Serie: The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...