Diese Arbeit wurde von einem BBSRC finanziert gewähren MdEP (BB / H010297 / 1), ein BBSRC Quoten studentship zu SAR und einen MRC studentship zu SWF.

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The authors have no competing financial interests.

Ein wesentlicher Teil dieses Protokolls erzeugt biologisch aktiven Liganden, die normalerweise bearbeitet werden, ausgeschieden wird, und fähig sind, eine Antwort in der Aufnahmezelle auslösen kann, obwohl sie eine fluoreszierende Gruppe gebunden. Es kritisch ist, nachzuweisen, dass das fluoreszenzmarkierte Genprodukt ist biologisch aktiv unter Verwendung eines geeigneten Assays. Für Shh-GFP wurde die Fähigkeit, die Expression von ptc1 aktivieren 16 bestätigt. Wnt8a hat eine bemerkenswert starke Fähigkeit, eine Nebenachse zu induzieren, wenn in einem ventralen Blastomere 20-21 ausgedrückt und Wnt8a-HA-eGFP wurde gezeigt, bewahren Sie diese biologische Aktivität. Wnt11b hemmt Activin behandelten ektodermalen Explantaten aus unterziehen konvergenten Verlängerung 21-22 und Wnt11b-HA-eGFP auch seine biologische Aktivität 17 beibehält. Die Fähigkeit der markierten Liganden, um Antworten entsprechen den unmarkierten Proteine ​​rufen legt nahe, dass die Schlussfolgerungen basierend auf Experimenten unter Verwendung der fluoreszierenden Liganden wird be, die für die normale Protein. Die Zugabe des HA-Epitop zwischen Ligand und das fluoreszierende Protein ein Spacer-Region, die die Wnt-Konstrukte sowohl aktive als auch fluoreszierend sein kann. Die Hauptbeschränkung dieser Art von Analyse ist, dass sie nicht direkt auf die endogene Morphogen Gradienten informieren. Zum Beispiel kann die Diffusion von Shh über das Feld von Zellen in Tierkappe nicht den Weg endogenen Shh bewegt sich durch den säulen neuralen Epithel im Embryo. Die Einfachheit dieses Protokoll erlaubt aber Experimente, bei denen die Wirkung von exogenen Regler auf die Verteilung von Liganden getestet werden. Die Ergebnisse dieser Ansätze bilden die Grundlage der Hypothesen unter Verwendung anspruchsvoller in vivo-Analysen überprüft werden. Zum Beispiel kann die Fähigkeit überexprimiert Sulf1 um die Verteilung der Shh-GFP unter Verwendung der in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren beschränken wies auf das Potential für Sulf1 beim Modulieren der Shh Morphogen gradient. Diese wurde direkt getestet und validiert mit Antisense-Morpholino-Knockdown von Sulf1 und Immunzytochemie, um endogene Shh im Neuralrohr 16 sichtbar zu machen. Ein ähnliches Verfahren, um uns wurde genutzt, um spezifische Mechanismen, die Liganden Diffusions regulieren könnte zu untersuchen. Smith und seine Kollegen gezeigt, dass eine GFP-markierten Knoten (Xnr2) verwendet einfache Diffusion, und Erweiterungen (Cytoneme) oder Transzytose (unter Verwendung von Vesikeln), um einen Gradienten 23 bilden keine Zelle. Weitere Ausgestaltungen dieser Verfahren sind möglich, bei denen andere Proteine, insbesondere Wege blockieren kann in Zielzellen exprimiert zu untersuchen, ob eine Antwort auf das Signalmolekül wird als Vermittler, um Signale von einer Zelle zur anderen Relais benötigt. Zum Beispiel kann eine dominant negative Activin-Rezeptor zwischen der Quelle von Activin und der antwortenden Zellen, die zeigte, dass einfache Ligand Diffusions könnte eine Antwort mehreren Zelldurchmessern weg von der Quelle E hervorrufenmit nicht-reaktiven Zellen zwischen 24 ven. Diese Schlussfolgerung wurde durch die Arbeit im Zebrafisch unterstützt, wo Wildtyp-Zellen können mit einer Quelle für Knoten obwohl sie von nicht mehr reagiert mutierten Zellen fehlt ein wesentlicher Co-Rezeptor für Knoten 25 umgeben reagieren. Andere Studien haben Zebrafisch verwendet, um die Diffusion von fluoreszenzmarkierten Liganden 28,29 untersuchen. Einige Studien wurde beobachtet, dass Tagging der C-Terminus von Wnt-Proteine ​​können auf der Signalaktivität möglicherweise wegen der hoch konservierte Cysteine, die Proteinkonformation beitragen auswirken Epitop. Die bisherige Arbeit hat gezeigt, dass auch ein Distanzstück (wie das HA-Tag) ergibt tagged Wnt-Liganden, die biologisch aktiv sind 17. Dies ist wahrscheinlich, weil der Abstandshalter liefert Flexibilität für Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung benötigt werden, wie in dem Daumen-Zeigefinger-Modell von Wnt-Frz Bindung 30. Der nächste Schritt für die Erweiterung unserer Untersuchungen ist es, eine vis schließendet Auslesen für die Aktivierung des Signalwegs. Zum Beispiel, die GFP-markierten Dvl 26 in Zellen entfernt von der Quelle der Ligand die Reichweite, über die Wnt11b hat die Fähigkeit, das Signal messen zu können. Der Bereich der Wnt8a Signalaktivität konnte unter Verwendung von Antikörper-Färbung an Kernlokalisation von b-Catenin in den Zellen 27 in einem Abstand von der Quelle zu messen angezeigt. Derartige Experimente sind mit Hilfe der in diesem Dokument beschriebenen Techniken. Durch den Einsatz einer Vielzahl von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen oder Fluorophore, wäre eine zusätzliche Informationsebene bereitgestellt, in denen man misst nicht nur die Verteilung eines Liganden, sondern die auch den Ausgang der Signalwege, und auf diese Weise die Bestimmung der Schwellenbereich eines Morphogens . Xenopus laevis ist ein nützliches Modell zur Visualisierung von GFP-markierten Liganden und weitere Angaben zu den Methoden für die Beschaffung von Embryonen, die mRNA-Synthese, die Mikroinjektion und sezierenIonen sind 31.

Während der frühen embryonalen Entwicklung werden die Zellen schrittweise verpflichtet, bestimmte Abstammungslinien der Differenzierung zu folgen: dies bedeutet eine Gruppe von totipotenten (oder pluripotenten Zellen) werden auf die Schaffung Populationen von Vorläuferzellen bestimmt Anlass zu einem Zelltyp geben allmählich beschränkt. Zell-Zell-Signalisierung ist von zentraler Bedeutung für die Regulierung der Linienspezifikation während der embryonalen Entwicklung. Manipulation dieser Signale wird benötigt, um Stammzellen in Richtung besonderen Schicksale lenken, neue medizinische Behandlungen zu unterstützen. Eine relativ kleine Anzahl von Signalwegen, werden während der Entwicklung wiederholt, einschließlich Wegen als Antwort auf die TGF-Superfamilie (nodals und BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnt 4 und 5 Igel. Diese sekretierten Proteine ​​binden an der Zellmembran, die Signaltransduktion wodurch Genexpression und / oder das Verhalten der Zelle ändern aktivieren Rezeptoren. Die enge Regulation von ZellzeichenAlling ist essentiell für Zelllinie Spezifikation und eine normale Entwicklung. Während das Übersprechen zwischen diesen Bahnen ist bei der Bestimmung des Zellschicksals wichtig ist, kann ein einzelner Ligand selbst hervorrufen unterschiedliche Reaktionen in unterschiedlichen Konzentrationen. Morphogen Gradienten wurden vor über 100 Jahren als eine Theorie zu erklären, wie verschiedene Zelltypen können aus einem Feld von Zellen 6 abzuleiten beschrieben. Signalmoleküle durch eine Gruppe von Zellen hergestellt werden, können über einen gewissen Bereich zu diffundieren, Abnahme in der Konzentration mit einem größeren Abstand von der Quelle. Zellen auf das Signal ausgesetzt wird, um die lokale Konzentration an ihrer Position in dem Bereich der Zellen entsprechen, die sich Zellen an verschiedenen Positionen unterschiedlich reagieren auf verschiedenen Ebenen des Signals. Beweise für die Existenz von Morphogenen ergeben sich aus Studien der frühen Drosophila-Embryo 7 und der Flügelscheibe 8 sowie des Vertebraten Schenkel 9 und Neuralrohr 10. Verfahren sind in benötigtenvestigate wie Morphogen Gradienten etabliert sind und an andere Moleküle bei der Regulierung dieser Gradienten wichtig zu identifizieren. Elegante Experimente mittels Immunhistochemie auf endogenen Proteinen in vivo im Kontext von verschiedenen genetischen Hinter visualisiert wurden zur Morphogengradienten 11-12 untersuchen. , Gute Antikörpern und spezifischen Mutanten sind jedoch nicht immer zur Verfügung, so dass wir mit Überexpression von fluoreszierenden Liganden in Xenopus, um eine alternative, einfache Methode, um zu zerlegen, wie exogene Genprodukte Verteilung von Liganden, die über ein Feld von Zellen beeinflussen, bereitzustellen beschreiben hier eine Protokoll. Xenopus laevis bietet ein ausgezeichnetes System, um diese Arten von Experimenten durchzuführen, wie ihre Embryonen entwickeln, von außen, so dass sie in den frühesten Stadien zugänglich sind. Ihre Größe (1-1.5mm Durchmesser) vereinfacht die Mikroinjektion und chirurgischen Manipulation und durch Blastula Stufen die Zellen leicht zu Bild, da sie immer noch relativ groß ist (etwa 2081; m Durchmesser). Die Überexpression Studien in Xenopus sind einfach zu tun: mRNA in den frühen Embryo injiziert werden, um bestimmte Zellen gezielt und effizient umgerechnet. Die fluoreszenzmarkierten Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-Konstrukte wurden mit pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 und eGFP generiert. Der HA-Peptid ist wichtig, umfassen nicht nur eine zusätzliche molekulare Markierung zu schaffen, sondern auch, weil es wird angenommen, dass als Abstandshalter trennt die Wnt und eGFP-Proteinen so dass sowohl Genprodukte zu funktionieren handeln. Das zur Visualisierung von Shh verwendet Konstrukt wurde zuvor verwendet, um eine transgene Maus eine Shh-eGFP-Fusionsproteins 15 exprimieren, zu erzeugen; Dies wurde freundlicherweise von Andy McMahon zur Verfügung gestellt. Wichtig ist, dass das GFP-Tag für alle Konstrukte kloniert 3 &#39;zur Signalsequenz, so daß sie nach der Bearbeitung beibehalten. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die endgültige Protein enthält Sequenzen, die für Änderungen erforderlich sind, wie die addition von Lipiden, wie es der Fall für Shh und Wnt ligands.The cDNAs wurden in den pCS2 + Expressionsvektor, der für die prodution synthetischer mRNA optimiert ist subkloniert; es enthält einen SP6-Promotor und Polyadenylierungssignal (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors). Die hier beschriebene Arbeit bietet ein einfaches Protokoll für den Vergleich der Sekretion und Verbreitung von fluoreszenzmarkierten Wnt und Shh getaggt Liganden. Durch Einspritzen von definierten Mengen synthetischer mRNA, umrundet das Protokoll keine Probleme mit variabler Expression aus verschiedenen Vektoren mit verschiedenen Promotoren verbunden. Diese Methoden wurden kürzlich angewendet, um die Wirkungen von Heparansulfat endosulfatase Sulf1 auf Shh-eGFP und Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-Sekretion und Diffusion in Xenopus 16-17 untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Melford</td>
			<td>MB 1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>From Megascript SP6 Kit AM 1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicarbonate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>RC-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C13961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap analog (m7G(5&#39;))</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM 8050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C 2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F 4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image J software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>G 0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0400/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips, No.1.5&#160;</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Narishige PC -10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pull needles</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chronic gonadotropin (HCG)</td>
			<td>Intervet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/7500/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710 and Zen software (2008-2010)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>http://uk.mathworks.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 2819-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail varnish&#160;</td>
			<td>Boots</td>
			<td>Bar code 3600530 373048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Lab.tech International</td>
			<td>ND-1000 / ND8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (55mm)</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>391-0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>http://www.photoshop.com/products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High fidelity DNA polymerase and buffers&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>M0530S&#160; Buffer - M0531S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/4280/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC insulation tape</td>
			<td>Onecall</td>
			<td>SH5006MPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>S28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes buffers</td>
			<td>Roche</td>
			<td colspan="2">SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free DNAse</td>
			<td>Promega</td>
			<td>ME10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel back single edge blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>66-0403-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>27810.364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SHE 2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen lite software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download&#160; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using confocal analysis of xenopus laevis to investigate modulators of wnt and shh morphogen gradients

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Liganden über ein Feld von Zellen verteilt visualisieren. Die Leichtigkeit der exprimieren exogene Proteine, zusammen mit der Größe ihrer Zellen in frühen Embryonen, stellen Xenopus laevis ein nützliches Modell für die Visualisierung von GFP-markierten Liganden. Synthetischer mRNAs effizient nach der Injektion in die übersetzte frühzeitig Xenopus-Embryonen und Injektionen können auf eine einzelne Zelle gezielt werden. Wenn sie mit einer Linie Tracer wie Membranbunden RFP kombiniert werden, kann der eingespritzte Zelle (und ihre Nachkommen), die Herstellung des überexprimierten Proteins leicht verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzmarkierten Wnt und Shh Liganden aus injizierten mRNA. Die Verfahren die micro Dissektion der ektodermalen Explantate (animal caps) und der Analyse der Liganden Diffusion in mehreren Proben. Durch konfokale Bildgebung können Informationen über Ligand Sekretion und Diffusion über ein Feld von Zellen erhalten werden. Statistische Analysen der konfokalen Bilder liefern quantitative Daten über die Form des Liganden Steigungen. Diese Methoden können nützlich für Forscher, um die Auswirkungen der Faktoren, die die Form der Morphogen Gradienten regulieren kann testen wollen.

Konfokale Analyse animal cap Explantate exprimieren fluoreszent markierte Proteine ​​bietet ein wirksames System zur Visualisierung Ligand Verteilung unter unterschiedlichen Versuchsbedingungen. In einem Beispiel kann die Verteilung von GFP-markierte Shh dargestellt (Abbildung 1). In 2-Zellen-Stadium werden Xenopus-Embryonen in die beiden Zellen, die entweder mit einem Kontroll-mRNA oder mRNA, die für Sulf1, ein Enzym, das die Zelloberflächen Heparansulfat verändert und beeinflusst die Shh Morphogen Gradienten 16 kodierende injiziert. Diese Embryonen werden kultiviert, bis die 32-Zellen-Stadium und eine einzelne Zelle koinjiziert mit mRNAs für Shh-GFP und memRFP Codierung (als Linie Tracer). Dies schafft ein Klon von Zellen Shh-GFP, das mit der Zellmembran gebunden RFP markiert exprimieren. Im Blastula-Stadium werden animal cap Explantate für die Analyse durch konfokale Mikroskopie entnommen. 1 zeigt, dass unter Kontrollbedingungen, Shh-GFP sekretiert und diffundiert außerhalb des Wiedergion Expression der mRNAs injiziert. Jedoch in Gegenwart Sulf1 ist Shh-GFP eingeschränkteren in seiner Verteilung und in diesem Beispiel wird nicht außerhalb der Klon von Zellen festgestellt. Die Auswirkungen der Sulf1 auf Shh-GFP-Verteilung wurde vollständiger 16 analysiert. Wenn sie in Xenopus-Embryonen exprimiert wird, fluoreszenzmarkierten Liganden Wnt sezerniert werden, sammeln sich an der Zellmembran und diffundieren über das Feld von Zellen. In Figur 2 kennzeichnen wir die quantitaive und qualitativen Eigenschaften der zwei verschiedenen fluorecently tagged Wnt-Liganden in Zellen injiziert und die Proteine ​​exprimieren. 2A-H sind Beispiele für Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP sammeln sich auf der Membran der animal cap Zellen . Durch Vergleichen Platten 2B und 2F ist klar, dass Wnt8a-HA-eGFP akkumuliert effizienter auf der Zellmembran als Wnt11b-HA-eGFP. Quantitative Informationen aus den konfokalen Bildern mit einem com extrahiertKombination von Bild und Schrift-Analyse-Software (Zusatzcode-Datei). 2I zeigt die relative Anreicherung von Wnt8a-HA-eGFP auf der Zellmembran im Vergleich zu Wnt11b-HA-eGFP. Die Daten wurden mit einem Computer-Skript, das die Gesamtzahl der Wnt-HA-eGFP Pixel Co-Lokalisations mit Zellmembran Pixel in jedem Bild bestimmt, erhalten. In einem anderen Ansatz, die Gesamtzahl der Wnt-HA-eGFP puncta, dass die Zusammenarbeit lokalisieren, mit der Zellmembran gezählt unter Verwendung von Bildanalyse-Software (2J). Qualitative Informationen über die Größe und Form der einzelnen puncta können auch aus den Daten unter Verwendung der Bildanalyse-Software extrahiert werden. Zusätzlich zu weniger Wnt11b-HA-eGFP puncta Co-Lokalisierung mit der Zellmembran (2J) diese puncta haben auch eine kleinere mittlere Größe als Wnt8a-HA-eGFP puncta (2k). Darüber hinaus haben Wnt11b-HA-eGFP puncta eine reduzierte Kreis Vergleich zu Wnt8a-HA-eGFP puncta (Abbildung 2 l). Circrität ist ein Maß dafür, wie genau ein Objekt ähnelt einem perfekten Kreis, wobei 1 für einen perfekten Kreis und 0,1 ein länglicher nichtkreisförmiger Form auf. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um jeden Kandidaten Regulator des Wnt-Liganden-Diffusionstest. Um dies zu tun, sollten die Kontrollzellen mit einem Steuer mRNA für eine inaktive Form des Kandidaten Regler oder ein irrelevantes Protein, wie beta-Galactosidase (lacZ) kodierende injiziert werden; Dies sorgt für eine gültige Steuer als einfach nicht das Einspritzen des Reglers. Daten in diesen Beispielen wurde unter Verwendung des nicht-parametrischen Test Mann-Whitney U 18-19 analysiert. Ein statistisches Analyseprogramm wurde verwendet, um den Test durchzuführen. In 3 untersuchen wir Wnt-Liganden Diffusion. Ein einzelner Blastomere wurde im 4-Zell-Stadium injiziert, so dass die Tier Kappe Explantate stellen einen Bereich der Zellen, in denen nur einige Zellen exprimieren entweder Wnt8a-HA-eGFP oder Wnt11b-HA-eGFP. Indem eine Zelllinie Tracer, können wir expre identifizierenssing versus nicht-exprimierenden Zellen, und dies erlaubt der Bereich der Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP Ligand Diffusion weg von der Quelle zu analysierenden Zellen (3B und 3C). Aufgrund der Krümmung der animal cap Explantate, die maximale Entfernung, die zuverlässig unter Verwendung dieses Tests gemessen werden konnte, war 160 um, was nicht genug ist, um den absoluten Abstand von Ligand Diffusion zu messen war. Jedoch kann durch Verwendung einer Kombination von konfokaler Analyse, Bildanalyse und wissenschaftliche Analyse und grafische Software die Gesamtform des Wnt-HA-eGFP Morphogen Gradienten könnte analysiert werden (Abbildung 3D). Diese Daten können verwendet werden, um zu untersuchen, ob ein anderes Protein überexprimieren, zusammen mit den markierten Liganden in den gleichen Zellen Wnt Sekretion oder Diffusion zu beeinflussen. In einer anderen Art von Experiment (3E bis 3J) die Auswirkungen eines möglichen Regler in Aufnahmezellen kann durch die Überexpression des Proteins in Kandidaten-Klone von Zellen angrenzend an Zellen ex messDrücken Wnt8a oder Wnt11b-HA-eGFP. Hierdurch kann jeder nicht-zell autonome Wirkungen des Reglers auf Wnt-HA-eGFP Ligand Diffusion untersucht werden. In Übereinstimmung mit Abbildung 2 können mehr Wnt8a-HA-eGFP erkannt Diffundieren von Zellen als Wnt11b-HA-eGFP in beiden Diffusionsexperimente werden. Die Arten der in diesem Dokument beschriebenen Experimenten verwendet wurden, um die Wirkung von Sulf1 auf Shh und Wnt-Signal 16,17 analysieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Modulation der Shh-GFP Verteilung kann durch konfokale Analyse von Xenopus animal caps erkannt werden. (A) Eine Karikatur, die experimentellen Test, wo Embryonen zunächst mit mRNA für Sulf1 oder einer Kontroll mRNA kodierenden eingespritzt wird, sind die gleichen Embryonen später an der 32-Zell-Stadium mit mRNA-Codierung für die Shh-GFP in eine einzelne Zelle injiziert. (BC) Tierkappe Explantats wurden auf Stufe 8 entnommen und nach 4 h abgebildet. Bilder werden auf dem Rand eines Shh-GFP + memRFP exprimierenden Klon von Zellen gezeigt. In Kontrollembryos (B) wird Shh-GFP vom memRFP markierten Klon von Signalerzeugungszellen verteilt. In Embryonen exprimieren Sulf1 (C) wird Shh-GFP mehr in seiner Verteilung beschränkt, siehe 16. memRFP ist in magenta dargestellt und Shh-GFP in grün. Skalenbalken stellen 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53162/53162fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig2.jpg" /> Figur 2. Die quantitative und qualitative Analyse der Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP puncta auf der Zellmembran. (AH) Die Embryonen wurden bilateral mit mRNA memRFP (500 pg) in das Tier Hemisphäre an den beiden Zell-Stadium mikroinjiziert. Darüber hinaus wurden die Embryonen mit Herrn injiziert<html> NA-Codierung (AD) Wnt8a-HA-eGFP (500 pg) oder [EH] Wnt11b-HA-eGFP (1 ng). Die Embryos wurden mit mRNA kodierenden LacZ injiziert für eine Steuerung für zusätzliche mRNA / Protein bei der Analyse der Auswirkungen jeglicher Potentialregler bereitzustellen. Die weißen Felder in (C) und (G) um die Bereiche, in Platten (D) vergrößert und (H) sind. Die Gesamtmenge Wnt-HA-eGFP-Fluoreszenz Co-Lokalisierung mit der Zellmembran wurde unter Verwendung von Bildanalysesoftware und Script und dann normiert (I) berechnet. Qualitative Informationen wurde mit Bildanalyse-Software extrahiert. Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP Pünktchen wurden für die Partikelzahl (J), Partikelgröße (K) und Kreisförmigkeit der Teilchen (L) analysiert. Mann-Whitney U (** P &lt;0,01), N = Anzahl der Embryonen. memRFP ist in magenta dargestellt und Wnt8a / 11b-HA-GFP wird grün dargestellt, repräsentieren Maßstabsbalken 20 um.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig3.jpg" /> Abbildung 3. Mess den Bereich der Verbreitung von fluoreszenzmarkierten Wnt-Liganden. (A) Diagramm, das den Test verwendet, um Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP-Sekretion und Verbreitung von exprimierenden Zellen zu messen. (BC) codierende mRNA (B) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) und Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) oder (C) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) und Wnt11b-HA-eGFP (2 ng ) wurde in den Tierhemisphäre einer Blastomere des Vier-Zellen-Stadium injiziert. (D) den Bereich der Diffusion Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP wurde durch eine Steuer Hintergrund gemessen wird. (E) Schematische Darstellung der Assay verwendet um Wnt8a und Wnt11b-HA-eGFP Diffusion durch eine Hintergrund messen die lacZ exprimieren, siehe Methode für det<html> fehlt. (FG) codierende mRNA memCerulean (600 pg) und (F und H) Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) oder (G und I) Wnt11b-HA-eGFP wurde an den vier in den Tierhemisphäre einer Blastomere spritzt Zell-Stadium. Eine angrenzende Blastomere wurde mit mRNA injiziert memRFP (600 pg) und LacZ (4 ng) zu sehen Key für Details. (J) Die Palette der Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP Diffusions codiert, wurde durch einen Hintergrund Ausdruck LacZ gemessen. Die Daten wurden quantifiziert und aufgezeichnet mittels konfokaler Analyse, Bildanalyse und wissenschaftliche Analyse und grafische Software. memCerulean (blau (CD) und Gelb (F und H)), Wnt-HA-eGFP (grün), memRFP (magenta), Maßstabsbalken repräsentieren 20 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53162/53162fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Datei downloaden.</a> Dateien / ftp_upload / 53.162 / 53162table1.jpg &quot;/&gt; Tabelle 1. Primer verwendet, um Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP und Shh-GFP in pCS2 subklonieren. <table><tbody><tr><td> Reaktion </td><td> Components </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispiel CS2 + Digest </td><td> 1,5 ug von pCS2 + </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ul Restriktionsenzym 1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ul Restriktionsenzym 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 ul Restriktionsenzym-Puffer (10x) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aufgefüllt auf 50 ul mit Wasser molekularen Grad </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispiel mRNA-Synthese </td><td> 2 ul linearisiert Vorlage </td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 ul 10x Megascript trx mix </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ul 50 mM ATP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ul 50 mM CTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ul 50 mM UTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 &amp; mgr; l 5 mM GTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 ul 40 mM Cap Analog (m7G (5 &#39;) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ul SP6 Enzymmix </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 ul Molecular-Wasser </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispiel PCR-Reaktion </td><td> 0,5 ul High Fidelity DNA-Polymerase (2.000 Einheiten / ml) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ng Template-DNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 ul Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 uM) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0,5ul dNTPs </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 ul der DNA ploymerase Puffer (10x) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aufgefüllt auf 50 ul mit Wasser molekularen Grad </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B. PCR-Bedingungen </td><td> Anfänglichen Denaturierung 2 min bei 98 ° C </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 sec 98 ° C </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 sec 65 ° C </td><td> 30 Zyklen </td></tr><tr><td></td><td> 40 sec 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Letzte Verlängerung 10 min bei 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispiel PCR-Produkt Digest </td><td> 28 ul des PCR-Produkts </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ul Restriction enzyme 1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ul Restriktionsenzym 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 ul Restriktionsenzym-Puffer (10x) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 &amp; mgr; Molecular-Wasser </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispiel T4-Ligation </td><td> 1 ul Cut CS2 + </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 &amp; mgr; l PCR-Produkt 1 Cut </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 &amp; mgr; l PCR-Produkt 2 Cut </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 ul T4 DNA Ligase </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 ul T4 DNA-Ligase-Puffer (10x) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 &amp; mgr; Molecular-Wasser </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beispiel Vorlage verdauen </td><td> 5 ug Plasmid-DNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 ul Restriktionsenzym-Puffer (10x) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 ul Not1 (außer Shh-GFP, Kpn1 verwendet wird) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aufgefüllt auf 100 ul mit Wasser molekularen Grad </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Beispiel Reaktionsbedingungen für die Subklonierung und Herstellung synthetischer mRNA für Wnt8a-HA-eGFP verwendet. <table><tbody><tr><td> Lösung </td><td> Components </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Cystein-HCl </td><td> 0,1X NAM </td></tr><tr><td></td><td> 2,5% L-Cystein-Hydrochlorid-Monohydrat (pH 7,8) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM Salze </td><td> 110 mM NaCl </td></tr><tr><td></td><td> 2 mM KCl </td></tr><tr><td></td><td> 1 mM Ca (NO3) 2 </td></tr><tr> &lt;td&gt; </td><td> 0.1 mM EDTA </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 2 </td><td> 0,5X NAM Salze </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM HEPES pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td> 0,25 mM Bicarbonat </td></tr><tr><td></td><td> 25 ug / ml Gentamycin </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 3 + Ficoll </td><td> 0.33X NAM Salze </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM HEPES pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td> 0,25 mM Bicarbonat </td></tr><tr><td></td><td> 2 5 ug / ml Gentamycin </td></tr><tr><td></td><td> 5% Ficoll </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 10 </td><td> 0,1X NAM Salze </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM HEPES pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td> 25 ug / ml Gentamycin </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Lösungen bei der Herstellung und die Mikroinjektion von Xeno verwendetpus laevis Embryonen.

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

11.1K Aufrufe.  The Bateson Centre, University of Sheffield.  Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann. 

Serie: Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

The use of reporter mice coupled to whole mount and section staining, microscopy and in vivo assays facilitates the analysis of mechanisms underlying the normal patterning of the respiratory tract. Here we describe how these techniques contributed to the analysis of Wnt signaling during tracheal development.

Studieren Wnt Signaling Während Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...