Name: using confocal analysis of xenopus laevis to investigate modulators of wnt and shh morphogen gradients
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
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この作品は、MEP（BB / H010297 / 1）、SARにBBSRCクォータの学生の身分、およびSWFへのMRC学生の身分にBBSRCの助成金によって賄われていました。

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The authors have no competing financial interests.

このプロトコールの重要な部分は、通常、加工分泌され、結合した蛍光部分を有するにもかかわらず、受容細胞における応答を誘発することができる生物学的に活性なリガンドを生成しています。これは、蛍光タグを付けた遺伝子産物は、適切なアッセイを用いて生物学的に活性であることを確立することが重要です。 Shh-GFPについては、PTC1の発現を活性化する能力は、16を確認しました。 Wnt8a単一腹側割球20-21に発現された場合、二次軸を誘導する非常に強力な能力を有しており、Wnt8a-HA-EGFPは、この生物学的活性を保持することが示されました。 Wnt11bは収斂伸長21-22を受けてから、アクチビン処理した外胚葉外植片を阻害し、Wnt11b-HA-EGFPはまた、その生物学的活性を保持している17。タグなしのタンパク質と同等の応答を誘導するためにタグ付けされたリガンドの能力は、蛍光性リガンドを用いた実験に基づいて結論をbになりますことを示唆しています通常のタンパク質に関連する電子。リガンドと蛍光タンパク質との間のHAエピトープの追加は、Wntがアクティブと蛍光の両方であることを構築することができるスペーサー領域を提供します。 分析のこの種類の主要な制限は、それが直接、内因性モルフォゲンの勾配に通知しないことです。例えば、アニマルキャップ内のセルのフィールド全体でのShhの拡散は、内因性のShhが胚における柱状の神経上皮内を移動する方法を反映しない場合があります。しかし、このプロトコルのシンプルさは、リガンドの分布に外因性調節剤の効果をテストすることができる実験を可能にします。これらのアプローチの結果は、in vivoでの分析より厳しいを使用して試験されるべき仮説の基礎を形成することができます。例えば、この論文に記載の方法を用いてのShh-GFPの分布を制限する過剰発現Sulf1の能力は、Shhのモルフォゲン卒業生の調節におけるSulf1の可能性を指摘ient。これは、直接テストおよびモルホリノSulf1のノックダウンと神経管16中の内因性のShh可視化するための免疫細胞化学、アンチセンスを使用して検証しました。我々と同様の方法は、リガンドの拡散を制御することができ、特定の機序を研究するために使用されています。スミスらは、GFPタグ付き結節（Xnr2）は、単純な拡散を使用し、勾配23を形成するための拡張機能（cytonemes）またはトランスサイトーシス（小胞を使用して）細胞ではないことを実証しました。 特定の経路を遮断する他のタンパク質は、シグナル伝達分子に対する応答を別のセルからの信号を中継するための仲介者として必要とされているかどうかを調べるために、標的細胞内で発現させることができる場合に、これらの方法のさらなる精緻が可能です。例えば、アクチビンのソースと応答細胞間のドミナントネガティブアクチビン受容体を発現することは、単純なリガンドの拡散は、いくつかの細胞直径離れ源Eからの応答を引き出すことができることを示しました24の間に非応答性細胞でVEN。この結論は、野生型細胞がリンパ節25に不可欠なコレセプターを欠く非応答変異細胞に囲まれているにもかかわらず、リンパ節のソースに対応することができるゼブラフィッシュでの作業によってサポートされていました。他の研究では、蛍光タグ付きリガンド28,29の拡散を調査するためにゼブラフィッシュを使用しています。いくつかの研究は、おそらくタンパク質の立体構造に貢献する高度に保存されたシステインの、シグナル伝達活性に影響を与える可能性がWntタンパク質のC末端にタグを付けエピトープことを観察しました。私たちの以前の研究は、（HAタグなど）のスペーサーを含むこと17生物学的に活性でタグ付けされたWntリガンドになることが示されています。スペーサーは、Wntシグナル-のFrzは30結合の親指人差し指モデルのように、リガンド-受容体相互作用のために必要な柔軟性を提供しますので、これは可能性があります。 私たちの研究を進めるための次のステップは、VISを含むことですシグナル伝達経路の活性化のためUAL読み出し。例えば、リガンドの供給源から離れた細胞におけるGFPタグ付きのDvl 26を発現するWnt11bを測定する信号能力を有する範囲を横切ることを可能にします。 Wnt8aシグナル伝達活性の範囲は、光源からの距離で細胞27中のB-カテニンの核局在化を測定するために、抗体染色を用いて示すことができました。実験のこれらのタイプは、このホワイトペーパーに記載された技術を使用して可能です。一つのリガンドの分布だけでなく、シグナル伝達経路の出力を測定し、このようにモルフォゲンの閾値範囲を決定しない場合にのみ、異なる蛍光タンパク質またはフルオロフォアの多様を採用することにより、情報の付加的なレベルが提供されます。 アフリカツメガエルは調達胚、mRNA合成、マイクロインジェクションおよび解剖する方法にGFPタグリガンドと更なる詳細を可視化するための有用なモデルでありますイオンは31利用可能です。

初期胚発生時には、細胞が徐々に分化の特定の系統に従うことを約束されています。これは、全能性（または多能性）の基を意味し、細胞が徐々に一つの細胞型を生じると判断前駆細胞の集団を確立するに限定となります。細胞間シグナル伝達は、胚発生時の系統仕様の規制の中心です。これらの信号の操作は、新規な治療法をサポートするために、特定の運命に向かって直接幹細胞に必要とされます。 シグナル伝達経路の比較的小さな数は、TGFスーパーファミリー（nodalsとのBMP）1-2、FGFの3、4のWnt、およびハリネズミ5への応答経路を含め、開発中に繰り返されます。これらの分泌されたタンパク質は、それによって遺伝子発現および/または細胞の挙動を変化させるシグナル伝達を活性化する細胞膜に存在する受容体に結合します。細胞標識の厳しい規制エイリングは、細胞系譜の仕様と正常な発達に不可欠です。これらの経路の間でのクロストークは、細胞の運命を決定するのに重要であるが、単一のリガンドは、それ自体、異なる濃度で異なる応答を誘発することができます。モルフォゲン勾配は細胞型はセル 6の分野から派生することができますどのように異なる説明する理論として100年以上前に説明しました。細胞の一つのグループによって生成シグナリング分子は、ソースからの長い距離と濃度の減少、一定の範囲で拡散することができます。信号に曝露された細胞は、異なる位置での細胞が信号の異なるレベルに対して異なる応答すると、電池の分野での位置で局所濃度に応答します。モルフォゲンの存在の証拠は、初期のショウジョウバエ胚7と翼のディスク 8と同様に、脊椎動物の四肢9と神経管10の研究から来ています。 方法は、中に必要とされています確立され、これらの勾配を調節する上で重要な他の分子を同定する方法をモルフォゲン勾配vestigate。異なる遺伝的背景との関連で、インビボで内因性タンパク質を可視化するために免疫組織化学を用いた上品な実験は、モルフォゲン勾配11-12を研究するために使用されています。しかし、優れた抗体および特定の変異体は、常に利用可能ではないので、我々は、代替、外因性遺伝子産物が細胞のフィールド全体でのリガンドの分布に影響を与えることができる方法を詳細に分析するための簡単​​な方法を提供することで、アフリカツメガエルにおける蛍光リガンドの過剰発現を使用して、ここでのプロトコルを記述します。 アフリカツメガエルは、彼らが最も初期の段階でアクセス可能であるので、その胚は、外部開発する実験のこれらのタイプに着手するための優れたシステムを提供します。サイズが大きい（直径1〜1.5ミリメートル）は、マイクロインジェクションおよび外科操作を簡素化し、胞胚によって、彼らはまだ約20（比較的大きいですように、細胞は、画像に簡単ですステージ81;）全体でmは。アフリカツメガエルにおける過剰発現の研究​​を行うのは簡単である：mRNAは、初期胚に注入し、特定の細胞を標的とすることができ、効率的に翻訳されています。 蛍光タグ付けWnt8a / Wnt11b-HA-EGFP構築物は、PCS2 Wnt8a-HA 13、PCS2 Wnt11b-HA 14およびEGFPを用いて作製しました。 HAペプチドは、追加の分子タグを提供するだけでなく、含まれることが重要であるが、それは両方の遺伝子産物が機能することを可能にするのWntおよびEGFPタンパク質を分離するスペーサーとして作用すると考えられるからです。 Shhの可視化のために使用される構築物は、以前のShh-EGFP融合タンパク質15を発現するトランスジェニックマウスを生成しました。これは親切にアンディ・マクマホンによって提供されました。重要なことは、すべての構築物について、GFPタグは、それが処理した後に保持されるようなシグナル配列の3 &#39;側にクローニングされます。そのようなadditio、最終タンパク質は、修正するために必要な配列を含むことを確実にするためにも不可欠です脂質のnが合成mRNAのprodution用に最適化されPCS2 +発現ベクターにサブクローニングしたのShhおよびWnt ligands.TheのcDNAの場合です。それは、SP6プロモーターおよびポリアデニル化シグナル（http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors）を含みます。 ここで説明する作業は、分泌および蛍光の拡散を比較するための単純なプロトコルがWntとのShhは、リガンドをタグ付けタグ付けています。合成mRNAの規定量を注入することにより、プロトコルが異なるプロモーターを使用して、異なるベクターからの変数式に関連するすべての問題を一周します。これらのメソッドは、最近のShh-EGFPおよびWnt8a /アフリカツメガエル16-17でWnt11b-HA-EGFP分泌および拡散にヘパラン硫酸endosulfatase Sulf1の影響を調査するために適用されています。

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Ambion</td><td>From Megascript SP6 Kit AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>Cap analog (m7G(5&#039;))</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J software</td><td></td><td></td><td>Free download http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips, No.1.5&amp;nbsp;</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glass needle puller</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>Glass pull needles</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Human chronic gonadotropin (HCG)</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Lithium chloride (LiCl)</td><td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 and Zen software (2008-2010)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr><tr><td>Molecular grade water&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail varnish&amp;nbsp;</td><td>Boots</td><td>Bar code 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (55 mm)</td><td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>Phenol-chloroform</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop software</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>High fidelity DNA polymerase and buffers&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&amp;nbsp; Buffer - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>PVC insulation tape</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>Gel extraction kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzymes buffers</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free DNAse</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>Steel back single edge blades</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needles</td><td></td><td></td><td>homemade</td></tr><tr><td>Zen lite software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Free download&amp;nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

using confocal analysis of xenopus laevis to investigate modulators of wnt and shh morphogen gradients

このプロトコルは、電池の分野にわたって分散リガンドを可視化する方法を説明しています。一緒に初期胚での細胞のサイズが大きいと、外因性タンパク質を発現の容易さは、 アフリカツメガエルは 、GFPタグ付きリガンドを可視化するための有用なモデルを アフリカツメガエル 作ります。合成mRNAは効率的に早期 アフリカツメガエル胚に 注入した後に翻訳され、注射は、単一の細胞を標的とすることができます。このような膜つながRFPとして系統のトレーサーと組み合わせると、過剰発現されたタンパク質を産生している細胞注入（とその子孫）を容易に追跡することができます。このプロトコルは、注入されたmRNAからWntおよびShhのリガンドをタグ付けされた蛍光を製造するための方法を説明します。方法はマイルを伴います外胚葉外植（アニマルキャップ）と、複数のサンプル中のリガンド拡散の解析のCRO解剖。共焦点イメージングを用いて、細胞のフィールド上のリガンドの分泌および拡散についての情報を得ることができます。共焦点画像の統計分析は、リガンド勾配の形で定量的データを提供します。これらの方法は、モルフォゲン勾配の形状を調節することができる因子の効果を試験する研究に有用であり得ます。

蛍光タグ付きタンパク質を発現アニマルキャップの外植片の共焦点分析は、異なる実験条件の下でのリガンド分布を可視化するための効果的なシステムを提供します。一例では、GFPの分布のShhは、（ 図1）が示されているタグを付けました。 2細胞期では、 アフリカツメガエル胚は対照mRNAとまたはmRNAはSulf1、細胞表面ヘパラン硫酸を変更し、Shhのモルフォゲン勾配16に影響を与える酵素をコードするとのいずれかで、両方の細胞内に注入されます。これらの胚は32細胞期まで培養し、単一のセルが（系統のトレーサーとして）のShh-GFPとmemRFPをコードするmRNAとの同時注入です。これは、細胞膜つながRFPでマークされているのShh-GFPを発現する細胞のクローンを作成します。胞胚段階で、アニマルキャップの外植片を、共焦点顕微鏡による分析のために採取される。 図1は、制御条件下でのShh-GFPが分泌されることを示し、再外の拡散します祇園は、注入されたmRNAを発現しています。しかし、Sulf1の存在下では、Shhは、GFPは、このサンプルでは、​​それを産生する細胞のクローンの外側で検出されず、その分布においてより制限され、。 Shh-GFP分布にSulf1の効果をより完全に16分析されています。 アフリカツメガエル胚で発現させると、蛍光細胞膜上に蓄積し、細胞のフィールドを横切って拡散、Wntリガンドが分泌されているタグ付けされています。 図2では 、我々はfluorecently注入された細胞におけるWntリガンドをタグ付けし、タンパク質を発現する二つの異なるのquantitaiveと定性的な性質を特徴づける。 図2A-Hは Wnt8aおよびWnt11b-HA-EGFPは、アニマルキャップ細胞の膜に蓄積する方法の例を示しています。パネル2Bおよび2Fを比較することにより、Wnt8a-HA-EGFPは、Wnt11b-HA-EGFPよりも細胞膜上に、より効率的に蓄積することが明らかです。定量的情報は、COMを使用して共焦点画像から抽出されました画像やスクリプト解析ソフトウェア（補足コードファイル）のbination。 図2Iは、Wnt11b-HA-EGFPと比較して、細胞膜上のWnt8a-HA-EGFPの相対的蓄積を示しています。データは、各画像内の細胞膜の画素とのWnt-HA-EGFP画素共局在の合計数を決定するコンピュータ・スクリプトを使用して得ました。別のアプローチでは、細胞膜との共局在のWnt-HA-EGFPの涙点の総数は、画像解析ソフト（ 図2J）を使用して計数します。個々の涙点のサイズ及び形状に関する定性的情報は、画像解析ソフトを用いて、データから抽出することができます。 Wnt11b-HA-EGFPは、涙点の細胞膜（ 図2J）これらの涙点との共局在化する少数のに加えて、Wnt8a-HA-EGFPの斑点（ 図2K）より小さい平均サイズを有します。また、Wnt11b-HA-EGFPの斑点は、Wnt8a-HA-EGFPの斑点（ 図2L）に比べて減少真円度を持っています。 CIRCularityは、オブジェクトが1が真円と0.1細長い非円形の形状を表すと、真円に似ているか、密接の尺度です。このアプローチでは、Wntリガンドの拡散の任意の候補調節因子を試験するために使用することができます。これを行うには、コントロール細胞は、候補調節剤や、β-ガラクトシダーゼ遺伝子 （lacZ）などの無関係なタンパク質の不活性形態の制御のmRNAのコーディングで注入する必要があります。これは単純に、レギュレータを注入しないよりも有効な制御を提供します。これらの実施例のデータは、ノンパラメトリック検定マンホイットニーU 18-19を用いて分析しました 。統計分析プログラムは、テストを実行するために使用しました。 図3では 、我々は、Wntリガンドの拡散を調査します。単一割球は、動物キャップ外植片が一部のみの細胞はWnt8a-HA-EGFPまたはWnt11b-HA-EGFPのいずれかを発現する細胞のフィールドを表すように、4細胞期で注入しました。細胞系譜のトレーサーを含むことによって、我々はexpreを識別することができます非発現細胞に対してssingこれはWnt8a-HA-EGFPと離れて分析するソース細胞からWnt11b-HA-EGFPリガンド拡散（ 図3Bおよび3C）の範囲を可能にします。動物キャップ外植片の湾曲に、確実に、このアッセイを用いて測定することができる最大距離は、リガンド拡散の絶対距離を測定するのに十分ではなかった160μmでした。しかし、（ 図3D）のWnt-HA-EGFPのモルフォゲン勾配の全体の形状を解析することができる共焦点分析、画像分析や科学分析とグラフ作成ソフトウェアの組み合わせを使用することによって。このデータは、同じ細胞内でタグ付けされたリガンドと一緒に別のタンパク質を過剰発現するのWnt分泌または拡散に影響を与えることができるかどうかを調査するために使用することができます。実験の別のタイプ（ 図3E-3J）で細胞を受信することに潜在的な調節因子の効果は、細胞の元の隣接セルのクローンにおいて候補タンパク質を過剰発現させることによって測定することができます。Wnt8aまたはWnt11b-HA-EGFPを押します。これは、Wnt-HA-EGFPリガンド拡散上のレギュレータの任意の非細胞自律的な効果を検討することができます。 図2と一致し、より多くのWnt8a-HA-EGFPは、両方の拡散実験においてWnt11b-HA-EGFPよりも細胞から離れて拡散して検出することができます。 この論文に記載される実験の種類は16,17シグナリングのShhおよびWntのSulf1の影響を分析するために使用されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig1.jpg" /> Shh-GFPの分布図1変調はアフリカツメガエルのアニマルキャップの共焦点分析により検出することができます。 （A）の胚は、最初のmRNAがSulf1や制御のmRNAをコードを注射する実験的アッセイを描いた漫画、同じ胚は、後にmRNAが1つのセルにのShh-GFPをコードすると32細胞期で注入されている。（BC）アニマルキャップ外植Sはステージ8で採取し、4時間後に画像化しました。画像は、細胞のクローンを発現しているのShh-GFP + memRFPの端に示されています。コントロールの胚（B）は 、Shhは、GFPは、離れて、信号産生細胞のmemRFP著しいクローンから配布されています。 Sulf1（C）を発現する胚では、Shhの-GFPは、よりその分布が制限され、16を参照してください 。 memRFPは緑色で、マゼンタとのShh-GFPに示されています。スケールバーは20μmでを表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53162/53162fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig2.jpg" /> 図2.定量的および細胞膜上Wnt8aおよびWnt11b-HA-EGFP涙点の定性分析。 （AH）胚は、mRNAは、2つの細胞段階で動物半球にmemRFP（500頁）をコードすると、双横方向にマイクロインジェクションしました。さらに、胚は、MRを注射しました<html> （AD）Wnt8a-HA-EGFP（500頁）または[EH] Wnt11b-HA-EGFP（1ng）をコードするNA。胚はまた、mRNAの潜在的な調節因子の効果を分析する場合、追加のmRNA /タンパク質のための制御を提供するためにLacZをコード注射しました。 （C）及び（G）の白いボックスは、それぞれのパネル（D）に拡大した領域と、（H）をマークします。 Wnt-HA-eGFP蛍光は、細胞膜との共局在合計量は、画像、スクリプト解析ソフトウェアを用いて計算され、（I）を正規化しました。定性的情報は、画像解析ソフトを用いて抽出しました。 Wnt8aおよびWnt11b-HA-EGFP punctaeは粒子数（J）、粒子サイズ（K）および粒子円形度（L）について分析しました。マン・ホイットニーのU（** P &lt;0.01）、N =胚の数。 memRFPはマゼンタで示され、Wnt8a / 11B-HA-GFPは緑で表示され、スケールバーは20μmで表します。ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53162/53162fig3.jpg" /> 蛍光の拡散の範囲を測定図3は、Wntリガンドをタグ付け。 （A）図離れ発現細胞からWnt8aおよびWnt11b-HA-EGFP分泌および拡散を測定するために使用したアッセイを示します。 （BC）をコードするmRNA（B）memCerulean（600頁）は、LacZの（4ng）およびWnt8a-HA-EGFP（2NG）または（C）memCerulean（600頁）、のLacZ（4ng）およびWnt11b-HA-EGFP（2 NG ）の4つの細胞段階で1割球の動物半球に注入した。（D）Wnt8a-HA-EGFPおよびWnt11b-HA-EGFPの拡散の範囲はコントロールの背景を介して測定した。使用したアッセイを描いた（E）図LacZをを表現する背景を通してWnt8aおよびWnt11b-HA-EGFP拡散を測定するために、DETのための方法を参照してください<html>不振の解決策は、（FG）mRNAはWnt11b-HA-EGFPは4で1割球の動物半球に注入したmemCerulean（600頁）と（FおよびH）Wnt8a-HA-EGFP（2 NG）または（GおよびI）をコードします 。細胞段階。隣接する割球は、バックグラウンドLacZを発現を通して測定したmemRFP（600頁）およびLacZ（4 ngの）詳細については、キーを参照してください。（J）Wnt8a-HA-EGFPおよびWnt11b-HA-EGFP拡散の範囲をコードするmRNAを注入しました。データを定量化し、共焦点解析、画像解析、科学分析やグラフ作成ソフトウェアを使用してプロットしました。 memCerulean（ブルー（CD）、イエロー（FおよびH））は、Wnt-HA-EGFP（緑）、memRFP（マゼンタ）、スケールバーが20μmを表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53162/53162fig3large.jpg" target="_blank">このファイルの拡大版をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> ファイル/ ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg &quot;/&gt; 表1のプライマーは、PCS2にWnt8a / Wnt11b-HA-EGFPとのShh-GFPをサブクローニングするために使用されます。 <table><tbody><tr><td> 反応 </td><td> コンポーネント </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>例CS2 +ダイジェスト</td><td> PCS21.5μgの+ </td><td></td></tr><tr><td></td><td>制限酵素1の2μlの</td><td></td></tr><tr><td></td><td>制限酵素2を2μl </td><td></td></tr><tr><td></td><td>制限酵素バッファーを5μl（10X） </td><td></td></tr><tr><td></td><td>分子グレードの水で50μlに作ら</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>例mRNA合成</td><td> 2μlの直線化テンプレート</td><td></td></tr><tr><td></td><td>2μlの10倍MEGASCRIPT TRXミックス</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2μlの50mMのATP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2μlの50mMののCTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2μlの50mMのUTPケーブル</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2μlの5mMのGTP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5μlの40mMのキャップアナログ（M7G（5 &#39;） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2μlのSP6酵素​​ミックス</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5μlの分子グレードの水</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>例えばPCR反応</td><td> 0.5μlの高忠実度DNAポリメラーゼ（2000単位/ ml） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2 ngのテンプレートDNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5前方のμLおよびリバースプライマー（10μM） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0.5dNTPのμL </td><td></td></tr><tr><td></td><td> DNAのploymeraseバッファーを5μl（10X） </td><td></td></tr><tr><td></td><td>分子グレードの水で50μlに作ら</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>例えばPCR条件</td><td> 98℃でのIntial変性2分</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15秒98℃、 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15秒、65℃ </td><td> 30サイクル </td></tr><tr><td></td><td> 40秒72℃ </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 72℃での最終伸長10分</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>例PCR産物ダイジェスト</td><td> PCR産物の28μlの</td><td></td></tr><tr><td></td><td>制限eの2μlのnzyme 1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td>制限酵素2を2μl </td><td></td></tr><tr><td></td><td>制限酵素バッファーを5μl（10X） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13μlの分子グレードの水</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>例のT4ライゲーション</td><td> 1μlのカットCS2 + </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3μlのカットPCR産物1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3μlのカットPCR産物2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> T4 DNAリガーゼ1μlの</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1μlのT4 DNAリガーゼ緩衝液（10X） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1μlの分子グレードの水</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>例テンプレートダイジェスト</td><td> 5μgのプラスミドDNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10μlの制限酵素バッファー（10X） </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3μLのNotI（のShh-GFPを除き、のKpn1が使用されています） </td><td></td></tr><tr><td></td><td>分子グレードの水で100μlに作ら</td><td></td></tr></tbody></table> サブクローニングおよびWnt8a-HA-EGFPのための合成のmRNAを生成するために使用される表2の実施例の反応条件。 <table><tbody><tr><td> 溶液 </td><td> コンポーネント </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td>システインHCL </td><td> 0.1X NAM </td></tr><tr><td></td><td> 2.5％L-システイン塩酸塩一水和物（pH7.8） </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM塩</td><td> 110のNaCl </td></tr><tr><td></td><td> 2のKCl </td></tr><tr><td></td><td> 1 mMのCA（NO 3）2 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; </td><td> 0.1mMのEDTA </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 2 </td><td> 0.5X NAM塩</td></tr><tr><td></td><td> 5 mMのHEPES pH7.4の</td></tr><tr><td></td><td> 0.25 mMの重炭酸塩</td></tr><tr><td></td><td> 25 UG / mlのゲンタマイシン</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 3 +フィコール</td><td> 0.33X NAM塩</td></tr><tr><td></td><td> 5 mMのHEPES pH7.4の</td></tr><tr><td></td><td> 0.25 mMの重炭酸塩</td></tr><tr><td></td><td> 2 5ugの/ mlのゲンタマイシン</td></tr><tr><td></td><td> 5％フィコール</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> NAM / 10 </td><td> 0.1X NAM塩</td></tr><tr><td></td><td> 5 mMのHEPES pH7.4の</td></tr><tr><td></td><td> 25 UG / mlのゲンタマイシン</td></tr></tbody></table> Xenoのの生産およびマイクロインジェクションの間に使用される表3.ソリューション膿は、胚をアフリカツメガエル。

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

using-confocal-analysis-xenopus-laevis-to-investigate-modulators-wnt

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

11.2K ビュー.  The Bateson Centre, University of Sheffield.  ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。 ...

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

発生生物学

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

This video article details a straightforward in vivo methodology that can be used to systematically and efficiently characterize components of complex signaling pathways and regulatory networks in many invertebrate embryos.

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

からの神経外植文化<em&gt;アフリカツメガエル</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

神経科学

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

生物学

Flow Cytometry and Confocal Imaging Analysis of Low Wnt Expression in Axin2-mTurquoise2 Reporter Thymocytes

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt signaling operates via a dosage-driven mechanism, motivating the need to study and measure Wnt signaling in various cell types. Although several reporter models have been proposed to represent physiological Wnt expression, either the genetic context or the reporter protein highly influenced the validity, accuracy, and flexibility of these tools. This paper describes methods for acquiring and analyzing data obtained with the Axin2-mTurquoise2 mouse Wnt reporter model, which contains a mutated Axin2em1Fstl allele. This model facilitates the study of endogenous canonical Wnt signaling in individual cells over a wide range of Wnt activity.
This protocol describes how to fully appreciate Axin2-mTurquoise2 reporter activity using cell population analysis of the hematopoietic system, combined with cell surface markers or &#946;-catenin intracellular staining. These procedures serve as a base for implementation and reproduction in other tissues or cells of interest. By combining fluorescence-activated cell sorting and confocal imaging, distinct canonical Wnt expression levels can be visualized. The recommended measurement and analysis strategies provide quantitative data on the fluorescent expression levels for precise assessment of canonical Wnt signaling. These methods will be useful for researchers who want to use the Axin2-mTurquise2 model for canonical Wnt expression patterns.

Signaling levels are known to regulate cell fate, indicating that regulation of Wnt signaling constitutes an interesting therapeutic target. Here, we describe flow cytometry and confocal microscopy analysis methods for a robust murine canonical Wnt signaling reporter model that measures distinct Wnt signaling levels.

Measuring Wnt expression levels is essential when trying to identify or test new Wnt therapeutic targets. Previous studies have shown that canonical Wnt ...

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解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル

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