This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cient&#236;ficas (CSIC).

Hinweis: Experimentelle Verfahren wurden vom Ausschuss für Forschungsethik der Universidad Autónoma de Madrid genehmigt und in Übereinstimmung mit spanischen und europäischen Richtlinien unter der Aufsicht von der Universidad Autónoma de Madrid Leiter der Tierschutz und Tiergesundheit durchgeführt. Die Mäuse wurden in spezifischen pathogenfreien (SPF) Gehäuse gezogen und sie von geschultem und qualifiziertem Personal unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2) Inhalationsmethode eingeschläfert wurden. 1. Maus-Knochenmark-abgeleitete DCs Differenzierung und Infektion ANMERKUNG: Abbildung 1 fasst diesen ersten Schritt. Alle Verfahren sollten in der Haube von diesem Zeitpunkt an durchgeführt werden, nur mit sterilen Medien, Instrumente, Pipettenspitzen und Kulturschalen. <ol><li> Maus-Knochenmark stammende DC Differentiation <ol><li> Sezieren Tibia und Femur von einer C57 / BL6 der Maus 22 und Überführung in eine Plastikschale mit 10 ml RPMI-Medium. </li&gt; <li> Schneiden Sie die einzelnen Epiphyse aus, mit einer sterilen Schere und setzen Knochenmark, die eine charakteristische leuchtend rote Farbe hat. </li><li> Infundieren das Innere des Knochens mit 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (PBS / BSA / EDTA-Puffer) unter Verwendung einer sterilen Spritze auf eine sterile Petri Gericht. </li><li> Sammeln der Zellsuspension und Zentrifuge in einem Rohr bei 600 · g in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C). </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml von Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM EDTA) und Inkubation für 30 s bei RT, um rote Blutzellen zu beseitigen. </li><li> 10 ml RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und durch ein Zellsieb (70 um), um Knochenfragmente und Zellklumpen vor dem Zentrifugieren mit derselben Geschwindigkeit (600 × g), da Klumpen wurden durch Filterung eliminiert entfernen. </li><li> Zählen Sie die Zellen eind einzustellen bis 5 x 10 5 Zellen / ml RPMI mit 10% FBS (mit 50 &amp; mgr; M B-Mercaptoethanol, 1 mM Natriumpyruvat) und fügen Sie 20 ng / ml rekombinantem murinen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierender Faktor (rm-GM-CSF) als Endkonzentration. </li><li> Fügen Sie diese Suspension in einem sterilen, mikrobiologische Qualität, 15 cm Petrischale, und die Kultur in einem CO 2 Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Alle drei Tage, Spin-down sowohl nicht-adhärenten Zellen und abgelöste Zellen mit 5 mM EDTA in PBS und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml Zelldichte, mit frischem Medium, enthaltend 20 ng / ml RM-GM-CSF. </li></ol></li><li> Reifung der DCs und Antigen Loading <ol><li> Am Tag 9, Resuspendieren der Zellen bei 5 × 10 5 Zellen / ml der Dichte in Medium, das 20 ng / ml RM-GM-CSF. Dann fügen Sie 20 ng / ml Lipopolysaccharid (LPS) hohe MHC-II-Expression auf Zellen zu ermöglichen und Inkubation in einem Nicht-Gewebekultur-behandelte sterile 15 cm Petrischale 24 h. </li><li> Nach einerTag der LPS-Stimulation, färben einige DC-Zellen mit Antikörpern gegen Maus-CD11c, MHCII und Gr-1, um DCs Differenzierung mittels Durchflusszytometrie zu überprüfen. Ein Beispiel für die Durchflusszytometrie-Analyse von DCs ist in 3A und 3B gezeigt. <ol><li> Inkubieren DCs (5 × 10 5 Zellen / Probe) mit einem Anti-Maus-CD16 / CD32-monoklonalen Antikörper bei 2,5 ug / ml Endkonzentration in 50 ul PBS / BSA / EDTA-Puffer pro Probe. Anschließend werden 50 ul der Antikörper gegen MHCII (IA / IE), CD11c und Gr-1 mit verschiedenen Fluorochromen konjugierten bei 1: 100, 1: 200 und 1: 500 in PBS / BSA / EDTA-Puffer auf. </li><li> Schließlich waschen DCs mit PBS / BSA / EDTA-Puffer und Analyse durch Durchflusszytometrie nach dem Protokoll des Herstellers. Hinweis: Wenn die Zellen gut differenziert, sind Zellen, bereit für die Antigenbeladung. </li></ol></li><li> Wash DCs mit RPMI 10% FBS (ohne Antibiotika) und inkubieren Sie sie mit 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) auf einem Kunststoffröhrchen in 1 ml RMPI 10% FBS Medium pro 5 x 10 6 DCs für mindestens 1 Stunde bei 37 ºC. Als Negativkontrolle, lassen DCs ohne Inkubation mit OVAp. </li></ol></li><li> Die Infektion von DCs <ol><li> Infizieren DCs bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 Bakterien (10 Bakterien pro DC) für 1 Stunde in einem CO 2 -Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Wasch DC Zellen 3x in PBS und 1 × in RMPI 10% FBS und Zentrifuge bei 450 × g, um die meisten der extrazellulären Bakterien zu waschen. Schließlich Die Zellen in RMPI 10% FBS-Medium (ohne Antibiotika) bei 20 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol></li></ol> 2. Isolierung von CD4 + T-Lymphozyten von transgenen Mäusen OTII Hinweis: Abbildung 1 fasst diesen zweiten Schritt. Lymphknoten sollte statt Milz CD4 + T-Zellen zu isolieren, verwendet werden, da der Anteil von CD4 + Lymphozyten in Lymphknotens (~ 50%) größer ist als in der Milz (~ 25%), und daher wäre die Reinigung effektiver. <ol><li> Machen Einzelzellsuspension von Lymphknoten <ol><li> Entfernen Leisten, Achsel, brachial und Hals-und Mesenteriallymphknoten 23 aus OTII transgenen Mäusen und Transfer in einer Kunststoffschale mit 10 ml RPMI 10% FBS-Medium. </li><li> Grind Lymphknoten unter einer sterilen Haube mit zwei mattierten Objektträger. Zeigen Lymphknoten auf einem mattierten Seite von einem Mikroskop-Objektträger, und reiben Sie mit satiniertem Seite der zweiten Schieber, bis Organen geschliffen worden. </li><li> Waschen Einzelzellsuspension in PBS / BSA / EDTA-Puffer. </li><li> Filtern Sie die Zellen, wenn eine Zelle Sieb (70 &amp; mgr; m) Bindegewebe zu entfernen und waschen mit PBS / BSA / EDTA-Puffer. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml ACK-Lysepuffer und Inkubation für 1 min bei RT, um rote Blutzellen zu beseitigen. </li></ol></li><li> Isolierung von CD4 + T-Zellen <ol><li> Erneut waschen wie in Schritt 2.1.3 und ZählungZellen, um sie bei 100 x 10 6 Zellen / ml in PBS / BSA / EDTA-Puffer resuspendieren. Hinzufügen biotinylierten Antikörper gegen CD8, IgM, B220, CD19, MHC Klasse II (I-Ab), CD11b, CD11c und DX5 auf 1: 250 für 30 Minuten auf Eis für eine spätere negative Selektion von CD4 + T-Zellen. </li><li> Wash-Zellen in PBS / BSA / EDTA-Puffer und Inkubation der Zellen (100 x 10 6 Zellen / ml) mit Streptavidin-Mikroperlen in der in dem Protokoll des Herstellers empfohlen, für 15 Minuten auf Eis-Konzentration. </li><li> Wasche die Zellen in PBS / BSA / EDTA-Puffer und filtern, wenn eine Zelle Sieb (30 um) vor CD4 + T-Zellisolations. </li><li> Isolieren CD4 + T-Zellen durch negative Selektion unter Verwendung eines magnetischen Zelltrennmaschine nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Zähle die Zellen und stellen bis 4 x 10 6 Zellen / ml mit RPMI 10% FBS-Medium (ohne Antibiotika). </li><li> Fix und halten auf Eis isoliert CD4 + T-Zellen (3 x 10 5 Zellen), um die Reinheit von Fluss überprüfenZytometer wie beschrieben 24. Ein Beispiel für CD4 + T-Zellen, Reinigung wird in 3C gezeigt. </li></ol></li></ol> 3. T-Zell-Transinfection Messung von Gentamicin Protection Assay Anmerkung: Abbildung 2 zeigt diese dritte Stufe des Protokolls. <ol><li> T-Zell-Transinfection <ol><li> Isolierten CD4 + T-Zellen zu inkubieren mit infizierten DC-Zellen (1: 1) für 30 Minuten (die DCs wurden für 1 Stunde infiziert und gewaschen, um eliminieren freie Bakterien), Immunsynapsenbildung in einem CO 2 -Inkubator (37 ° C ermöglichen, 5% CO 2). </li><li> 0,5 ml der isolierten CD4 + T-Zellen (2 x 10 6 Zellen) und 0,1 ml der infizierten DCs (2 × 10 6 Zellen) auf einer 24-Well-Kulturplatte. Als negative Kontrolle infizieren direkt 0,5 ml von CD4 + T-Zellen bei einer MOI von 10 Bakterien für 30 min. </li><li> Fügen Sie zusätzliche Kontrollen trennt infizierte DCs von T-Zellen unter Verwendung vonein Polycarbonat-Transwell-Barriere (mit 3 &amp; mgr; m Porengröße), behindern DC-T körperlichen Kontakt. 0,1 ml von DCs in der Transwell und 0,5 ml von CD4 + T-Zellen in der unteren Kammer der Wanne (24-Well-Platte). </li><li> Schließlich, bis es komplett mit RMPI Medium 0,6 ml in jeder Vertiefung zu gleichen Volumina in allen Proben zu machen. </li><li> Nach 30 min von Immunsynapsenbildung wird mit 100 &amp; mgr; g / ml Gentamicin und Inkubation für 1 h vor dem Sammeln von Zellen in einem CO 2 -Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol></li><li> Re-Isolierung von CD4 + T-Zellen <ol><li> Sammeln nicht-adhärenten Zellen und Resuspendieren sie in PBS / BSA / EDTA-Puffer. Die meisten von DCs an der Kunststoff-Kulturplatte befestigt. Wirbelröhren leicht zu Zelle Disaggregation zu gewährleisten. Halten Sie 500 ul Zellüberstand als Kontrolle, um zu zeigen, dass Gentamicin hat gut funktioniert. </li><li> Wieder isolieren CD4 + T-Zellen aus Proben, die DCs und T-Zellen, wie in Schritt 2.2 zusammen enthaltenObwohl die meisten der DCs sollte auf der Platte befestigt sind. Halten Sie die Kontrollproben auf Eis. Berücksichtigen Sie nur Experimente mit weniger als 2% Verunreinigungen. Ein Beispiel für CD4 + T-Zellen, Reinigung nach transinfection wird in 3D gezeigt. </li></ol></li><li> Lyse T-Zellen und entkernen auf Bakterien Medium-Agar-Platten. <ol><li> Waschen CD4 + T-Zellen zweimal mit PBS. </li><li> Zählen der Zellen und Resuspendieren sie bei 2 x 10 6 Zellen / ml in PBS. </li><li> Gib 500 ul 0,1% Triton X-100 in 500 &amp; mgr; l von T-Zellen, um sie auf 1 x 10 6 Zellen / ml zu lysieren, die Freigabe der intrazellulären Bakterien aus den T-Zellen. </li><li> Machen 3 serielle Dezimalverdünnungen lysierten Zellen und Samen 50 ul jeder Verdünnung auf Bakterien Medium-Agar-Platten. Teilen Sie Platten in 4 Portionen und Samen der verschiedenen Verdünnungen der lysierten Zellen in jedem Teil. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. <ol><li> Als Kontrolle wurde auch die Plattegespeicherten Zellüberstand der Konjugate auf Agar, um diese Gentamicin sicherzustellen gut funktioniert hat. Auch Platte infizierten DCs als zusätzliche Kontrolle. In Fall tritt niedrigen DCs Verunreinigungen (&lt;2%), subtrahieren die koloniebildenden Einheiten (KBE) entsprechend niedrige Gleich Verschmutzung. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Quantifizierung der T-Zell Transinfection durchflusszytometrisch Hinweis: Abbildung 2 zeigt diesen Schritt. <ol><li> T-Zell-Transinfection <ol><li> Infizieren BMDCs, wie in Schritt 1.3, sondern verwenden GFP exprimierenden Bakterien in diesem Fall. </li><li> Flecken CD4 + T-Zellen (aus Lymphknoten isoliert in Schritt 2.2) mit einem Zellenverfolger Chlor Aminocumarin (CMAC) für 30 min bei 37 ºC nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Waschen markierten CD4 + T-Zellen zweimal mit RPMI 10% FBS (ohne Antibiotika). </li><li> Inkubieren infizierten DCs (nach 1 Stunde Inkubation mit Bakterien) mit markierten CD4 +T-Zellen für 30 min, um Immunsynapsenbildung bei 37 ºC einschließlich aller Kontrollen Erläuterung in Schritt 3.1.1 ermöglichen. </li></ol></li><li> Färbung infizierter CD4 + T-Zellen <ol><li> Nach 30 min DC-T Immunsynapsenbildung, sammeln Zellen und waschen Sie sie in PBS / BSA / EDTA. </li><li> Nach zweimaligem Waschen mit PBS / BSA / EDTA-Puffer, separate aggregierte Zellen durch vorsichtiges Vortexen der Röhren. </li><li> Fixieren die Proben in 0,2 ml / Röhrchen PBS, das 3% PFA für 15 min bei RT. Dann waschen Sie sie in PBS. </li><li> Inkubieren mit Anti-Maus-CD16 / CD32-monoklonalen Antikörpers (2,5 ug / ml) in 50 ul / Probe von PBS / BSA / EDTA für 15 min auf Eis an Fc-Rezeptoren von dendritischen Zellen blockieren. </li><li> Hinzufügen eines Kaninchen-Anti-Bakterien-Antikörper (10 ug / ml als Endkonzentration) in 50 ul / Probe von PBS / BSA / EDTA für 30 Minuten auf Eis, um extrazelluläre Bakterien zu färben. </li><li> Wasche die Zellen mit PBS / BSA / EDTA und Inkubation mit einem Antikörper gegen den Maus-CD11c mit Phycoerythrin (PE) konjugiert, und eine sedäre Antikörper gegen Kaninchen mit anderen Fluorochrom wie Alexa-Fluor 647 konjugiert bei 1: 200 in 100 ul / Probe von PBS / BSA / EDTA für 30 Minuten auf Eis. </li><li> Wash-Zellen und Analyse von Proben mittels Durchflusszytometrie. Nicht zu vergessen, eine Probe des transinfected T-Zellen unter Verwendung nicht-fluoreszierenden Bakterien als negative Kontrolle und Proben mit nur einem der einzelnen Fluorochrom in dem Experiment verwendet, um die Proben zu kompensieren und die Durchflusszytometrie Einstellungen 25 einzustellen markierten enthalten. Repräsentative Analyse ist in 5 gezeigt. Hinweis: Wenn Bakterien nicht GFP zum Ausdruck bringen, den intra- und extrazellulären Bakterien, Label extrazellulären Bakterien, die mit Triton X-100 bei 0,5% in PBS für 5 min zu unterscheiden, zu beheben, und permeabilisieren Proben. Anschließend färben Gesamt Bakterien (intrazelluläre + extrazellulären) mit einem anderen Fluorochrom. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

T-Zellen oder T-Lymphozyten sind eine Art von Leukozyten, die eine zentrale Rolle bei der zellvermittelten Immunität spielen und gehören zu der adaptiven Immunantwort 26. T-Zellen sind resistent gegen in vitro infiziert aber einige Berichte zeigen, dass sie in vivo 14,15 infiziert werden. Die intime Kontakte des APC und T-Zellen während der Immunsynapse als Plattform für den Austausch von biologischem Material 13, darunter auch einige Viren wie HIV 11 dienen. Es wurde vor kurzem, dass im Gegensatz zu dem Dogma, T-Zellen gezeigt, das Paradigma der Zellen des adaptiven Immunität, sind auch in der Lage, effizient zu erfassen Bakterien durch transinfection aus infizierten DCs 11,16. Wir zeigen hier, er detaillierte Protokolle, um T-Zellen bakterielle transinfection in vitro aus infizierten BMDCs quantifizieren. T-Zell-bakterielle transinfection wurde von Antigenerkennung 16 verbessert. Wir zeigten, dass durch die Verwendung CD4 + -T-Zellen, isoliert ausOTII transgenen Mäusen Erkennen eines spezifischen OVAp, BMDCs mit OVAp und Mäusen mit verschiedenen Bakterien (hier Daten von Salmonella enterica vorgelegt) infiziert geladen. CD4 + T-Zellen aus Mäusen isoliert OTII mit infizierten DCs für 30 min inkubiert, um Immunsynapsenbildung zu ermöglichen. Die hier präsentierten Daten entsprechen den Bakterien, die T-Zellen können von DCs in dieser kurzen Zeit zu erfassen. Wir wissen, dass längere Belichtungszeiten von T-Zellen zu infizierten DCs ergab größeren Bakterien Aufnahmen (nicht gezeigt), aber T-Zellen, die uptaken Bakterien sehr schnell zerstören auch die Quantifizierung von bakteriellen transinfection bei längeren DC / T-Zellen-Zeitkontakte auftretenden als schwierig erwiesen . Gentamicin-Überlebensassay ist ein sehr sensitives Verfahren, um T-Zell transinfection quantifizieren, da es in der Lage, eine einzige infizierende Bakterium 21 erkennen kann. Nach der Inkubation mit Gentamicin, die nur die extrazelluläre Bakterien zu töten, T-Zellen werden isoliert und lysiert, um Bakterien auf Agar-Medium pl SaatgutAtes. Isolierung von T-Zellen nach der Bildung von Konjugaten mit DCs ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Nur Versuche mit weniger als 2% an Verunreinigungen sollten berücksichtigt werden. DC Kontamination kann mittels Durchflusszytometrie und KBE entsprechend niedrige Gleich Verschmutzung sollte abgezogen werden, gemessen werden. Alternativ können CD4 + T-Zellen Reinheit durch Verwendung von Zellsortierung verbessert werden. Ein weiterer Ansatz zur Quantifizierung von T-Zell-transinfection ist mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von GFP-exprimierenden Bakterien und Markierung der extrazellulären Bakterien mit einem kompatiblen Fluorophor. Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass Bakterien, ein GFP, das ausreichend hell zum Erkennen infizierten Zellen gegenüber dem Autofluoreszenzhintergrund ist auszudrücken. Alternativ könnte Bakterien infizieren, bevor DCs mit einer Zell tracker gefärbt werden. Ein anderer Ansatz wäre Anfärben der extrazellulären Bakterien, Permeabilisieren der T-Zellen, wird die Kennzeichnung alle Bakterien (intrazellulär + extrazellulär)mit einem unterschiedlichen Fluorochrom. In Bezug auf die zukünftige Ausrichtung des Protokolls, versuchen wir, die Einrichtung eines Protokolls, die Anzahl der T-Zellen, die Bakterien bei längerer Exposition gegenüber infizierten DCs erfasst, unter Verwendung von Bakterien mit magnetischen Partikeln verziert quantifizieren. T-Zellen, die Erfassung Bakterien würden die magnetischen Partikel binden und daher sollte es leicht ist, sie durch Verwendung von Magneten zu isolieren.

Wenn ein Erreger infiziert seinen Wirt, gibt es normalerweise eine Aktivierung der angeborenen und adaptiven Immunreaktionen, für die bakterielle Clearance erforderlich. Angeborene Immunität ist die erste Verteidigungslinie, die meisten Infektionen verhindert. Angeborenen Immunität zu unterscheiden in einer präzisen Art und Weise Elemente, die in breiten Gruppen von Mikroorganismen konserviert sind (pathogen-associated molecular patterns, PAMPS) 1. Die Mechanismen der angeborenen Immunität umfassen physikalische Barrieren, wie Haut, Chemikalien Barrieren (antimikrobielle Peptide, Lysozym) und die angeborenen Leukozyten, der die Phagozyten (Makrophagen, Neutrophile, und dendritische Zellen), Mastzellen, Eosinophile, Basophile und natürliche Killerzellen umfassen 2. Diese Zellen identifizieren und zu beseitigen Krankheitserreger, entweder durch einen Angriff auf sie durch den Kontakt oder über die Phagozytose, die Erreger engulfing und Tötung umfasst. Dieses System erlaubt keine lebenslange Verteidigung, im Gegensatz zum adaptiven Immunität, die immunologisches Gedächtnis gegen p zu verleihenathogens. Die adaptiven Immunsystems ist die zweite Linie der Verteidigung und in der Lage zu erkennen und zu reagieren, um spezifische Antigene von mehreren mikrobiellen und nicht-mikrobielle Substanzen 3. Die Hauptkomponenten des adaptiven Immunsystems sind die Lymphozyten, die B und T-Zellen enthalten. B-Zellen werden in der humoralen Antwort beteiligt sind, die Antikörper gegen Pathogene oder exogenen Proteinen. Jedoch T-Zellen stellen die zellvermittelte Immunität, die Modulation der Immunantwort mit Cytokinen Sekretion oder Tötung pathogen-infizierten Zellen 4. Antigen-präsentierende Zellen (APCs), die dendritischen Zellen oder Makrophagen, Bestandteile des angeborenen Immunsystems kann phagozytieren Pathogene und Prozess bakteriellen Komponenten in Antigene, die an der Zelloberfläche durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) präsentiert werden 5-7 erkennt. Nach APCs haben Krankheitserreger phagozytiert, sie in der Regel zu den Lymphknoten, wo sie mit T interagieren migrierenZellen. T Lymphozyten spezifischen Peptid-MHC-Komplexe mit ihren T-Zell-Rezeptoren erkennen. Die Immun Synapse (IS) geschieht in der Grenzfläche zwischen einem Antigen-beladenen APC und einem Lymphozyten während der Antigenpräsentation 8,9. Einige Bakterien können Phagozytose überleben und systematisch zu verbreiten innerhalb von APCs. In dieser Ansicht dienen infizierte APCs als bakterielle Reservoirs oder &quot;Trojanische Pferde&quot;, die bakterielle Ausbreitung 10 zu erleichtern. Der innige Kontakt zwischen APCs und Lymphozyten, die im Laufe des IS Bildung stattfinden, ebenfalls als Plattform für den Austausch eines Teils der Membranen, genetisches Material und Exosomen und kann für einige Viren, um T-Zellen zu infizieren missbraucht werden; Dieser Vorgang wird als transinfection 11-13. Einige pathogene Bakterien (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica und Shigella flexneri) sind in der Lage, T-Lymphozyten in vivo überfallen und ihr Verhalten 14-16 modifizieren. Wir habenkürzlich beschrieben, dass T-Lymphozyten können auch Bakterien durch transinfection von zuvor infizierten dendritischen Zellen (DCs) im Verlauf der Antigen-Präsentation 16 zu erfassen. T-Zell-bakterielle Gefangennahme durch transinfection überaus effektiver (1,000-4,000x) als direkte Infektionen. T-Zellen-Capture pathogen und nicht-pathogene Bakterien anzeigt als transinfection ist ein Prozess, durch T-Zellen angetrieben. Auffallend ist, transinfected T (TIT) Zellen rasch getötet die aufgenommenen Bakterien und tat dies effizienter als professionelle Phagozyten 16. Diese Ergebnisse, die ein Dogma der Immunologie zu brechen, zu zeigen, dass die Zellen der adaptiven Immunität Funktionen, die vermeintlich exklusive der angeborenen Immunität waren durchführen können. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Zellen sezer TIT große Mengen von pro-inflammatorischen Zytokinen und zum Schutz vor bakteriellen Infektionen in vivo. Hier die verschiedenen Protokolle verwendet, um die bakterielle transinfection Prozess studieren präsentieren wirein Mausmodell. Dieses Modell basiert auf der Verwendung von CD4 + T-Zellen von transgenen OTII Mäusen, die einen TCR spezifisch für Peptid 323-339 von OVA (OVAp) im Kontext mit I-Ak 17, die spezifisch mit bakteriell-infizierten Knochen in Wechselwirkung zu tragen basierend marrow- abgeleiteten DCs (BMDCs) 18,19 mit OVAp geladen, Bildung stabiler Immun Synapsen. T-Zell-transinfection visualisiert werden können und verfolgt mittels Fluoreszenzmikroskopie. Zusätzlich Durchflusszytometrie zur Detektion infizierten Zellen unter Ausnutzung der Fluoreszenz durch Bakterien grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, 16,20 emittiert werden. Darüber hinaus können T-Zell transinfection durch eine empfindlichere Ansatz, der Gentamicin-Überlebenstests, die Messung einer großen Anzahl von Ereignissen kann quantifiziert werden. Gentamicin ist ein Antibiotikum, das nicht eukaryotischen Zellen eindringen kann. Daher ist die Verwendung dieses Antibiotikums erlaubt die Unterscheidung von intrazellulären Bakterien, die das Antibiotikum Zusätzlich fr lebtenom extrazellulären diejenigen, die getötet wurden 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RPMI</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SH3025501</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">r-GMCSF</td>
			<td style="width:131px;">Peprotech</td>
			<td style="width:104px;">315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">LPS</td>
			<td style="width:131px;">SIGMA</td>
			<td style="width:104px;">L2630-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SH3023901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">2-ME</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">OVAp OTII (323&#8211;339)</td>
			<td style="width:131px;">GenScript</td>
			<td style="width:104px;">---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cell Strainer 70uM</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;30uM Syringe Filcons Sterile</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">340598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">AutoMacs Classic</td>
			<td style="width:131px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-088-887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:131px;">Normon</td>
			<td style="width:104px;">624601.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Transwell</td>
			<td style="width:131px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">LB</td>
			<td style="width:131px;">Pronadisa</td>
			<td align="right">1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:131px;">Pronadisa</td>
			<td align="right">1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:341px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD8 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">IgM Biot</td>
			<td style="width:131px;">ImmunoStep</td>
			<td style="width:104px;">Clone RMM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">B220 Biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD19 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MHC-II Biot (I-A/I-E)</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11b biot</td>
			<td style="width:131px;">Immunostep</td>
			<td style="width:104px;">11BB-01mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11c biot</td>
			<td style="width:131px;">Immunostep</td>
			<td>11CB3-01mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DX5 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Gr-1 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD16/CD32</td>
			<td style="width:131px;">ImmunoStep</td>
			<td>M16PU-05MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">anti Salmonella</td>
			<td style="width:131px;">ABD Serotec</td>
			<td style="width:104px;">8209-4006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11cPE</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:131px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">20-0041-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gr-1 APC</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-II (I-A/I-E) FITC</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)</td>
			<td style="width:131px;">Life technologies</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">SIGMA</td>
			<td style="width:104px;">A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Streptavidin MicroBeads</td>
			<td style="width:131px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">---</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t cells capture bacteria by transinfection from dendritic cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Hier beschrieben wir, wie man murine T-Zell-bakterielle transinfection von infizierten Knochenmark-DCs und wie bakterielle transinfection über zwei verschiedene Ansätze Messung durchführen: Durchflusszytometrie und Gentamicin-Überlebenstests Abbildung 1 fasst die Vorgehensweise, um die Zellen zu erhalten.. DCs werden durch Inkubation der Knochenmarkszellen, die mit GM-CSF für 9 Tage erzeugt. Dann werden DCs mit LPS gereift zu MHCII auf ihrer Membran zu erhöhen, um sie später mit einem spezifischen Peptid OVA (OVAp) zu laden. Als Kontrolle werden einige DCs nicht OVAp geladen. Beide DCs (OVAp-belasteten und unbelasteten) bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 Bakterien infiziert. Andererseits sind CD4 + T-Zellen aus Lymphknoten OTII transgenen Mäusen, die die spezifische OVAp erkennen isoliert. 2 zeigt das Verfahren zur Durchführung und zu quantifizieren, T-Zell-transinfection einschließlich der entsprechenden Negativkontrollen. Wie descriBett vor, einige DCs nicht OVAp geladen. In diesem Fall gibt es eine Wechselwirkung zwischen DCs und T-Zellen, aber nicht immun Synapsenbildung aufgrund der Abwesenheit von OVAp. Eine zusätzliche Kontrolle ist im Preis inbegriffen, die Trennung DCs und T-Zellen mit einem Polycarbonat-Transwell-Barriere (mit 3 &amp; mgr; m Porengröße), die DC-T physischen Kontakt behindert. DCs sind in der Transwell enthalten ist; als Ergebnis sind sie nicht in der Lage, durch diese Porengröße bestehen. Eine weitere Negativkontrolle ist ebenfalls integriert, die direkte T-Zell-Infektion, durch Inkubieren von T-Zellen direkt bei einer MOI von 10 Bakterien. T-Zell-transinfection kann durch zwei Ansätze quantifiziert werden: Durchflusszytometrie oder Gentamicin-Überlebensassay. Durch Durchflusszytometrie zu messen, sollte DCs zuvor mit Bakterien-GFP und CD4 + T-Zellen infiziert wurden Fleck mit einem Zellenverfolger (T-Zellen-blau). Nach Konjugatbildung, sollten die Zellen mit Antikörpern gegen DCs (CD11c-PE) gefärbt werden. Die extrazellulären Bakterien sollte auch um quantif angefärbt werdeny den Prozentsatz der infizierten CD4 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie später. Um transinfection von Gentamicin-Überlebenstests messen, werden Zellen mit Gentamicin für 1 h inkubiert, um extrazelluläre Bakterien zu töten, dann T-Zellen werden erneut getrennt auf Agarplatte Samen. Dezimal Reihenverdünnungen werden gebildet, um 50 &amp; mgr; l jeder Verdünnung auf Agarplatte Saatgut und zur Erleichterung der Zählung von KBE. Wie in 3 gezeigt, hat DC Differenzierung durch Durchflusszytometrie (3A und 3B) überprüft werden. DCs sollte CD11c und MHCII (3A) und nicht Gr-1, das ein Marker für die Neutrophilen exprimieren. Wie in 3B dargestellt, ein paar Neutrophilen (3,27% des Gr-1 +, MHC -) wurden in die Kultur präsentiert, aber DCs Kultur mit mehr als 5% der Neutrophilen-Verunreinigungen sollte nicht verwendet werden. CD4 + T-Zellen Reinheit sollten nach Isolierung aus ly überprüft werdenmph Knoten (3C) und nach Trennung von DCs Konjugate Formation (Figur 3D). Berücksichtigen die Experimente mit weniger als 2% der Schadstoffe nach Konjugate Bildung. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für T transinfection Experiment mit Salmonellen. Wie in 4A dargestellt ist, werden die Platten in vier Abschnitte unterteilt, um die seriellen Verdünnungen in jedem Teil. Salmonellen wurden auf LB-Agarplatten und koloniebildende Einheiten gezüchtet gezählt werden Samen. Wie in 4A gezeigt, wurde Salmon durch T-Zellen aus infizierten DCs erfasst und dieses Verfahren wurde deutlich mit OVAp Erkennung (Platten auf der linken Seite der 4A und 4B) verbessert. Jedoch, wenn es eine physikalische Barriere behindert den Kontakt zwischen DCs und T-Zellen, gibt es praktisch keine transinfection, wie in dem Fall, daß man eine direkte T<html> Zellinfektion (Platten auf der rechten Seite der 4A und 4B). Wie in Figur 5 dargestellt ist, kann T-Zell transinfection durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Bakterien eine helle GFP-exprimierenden quantifizieren. DCs und T-Zellen können nach ihrer Größe und Komplexität in einer Vorwärts- und Seitenstreudiagramm unterschieden werden, aber verschiedene Marker verwendet werden, um gut zu unterscheiden sie. CD4 + T-Zellen wurden mit einem Zell tracker (CMAC) und DC, die mit einem Antikörper gegen CD11c markiert. Extrazelluläre Bakterien wurden mit einem Kaninchen-Antikörper gegen Salmonellen und sekundäre Antikörper anti-Kaninchen mit Alexa Fluor 647. Daher ist der Anteil der infizierten CD4 + T-Zellen konjugiertem quantifiziert werden können, weil sie mit CMAC markierten (nicht mit CD11c-PE) und drückte GFP (Bakterien-GFP), aber sie wurden nicht mit dem Antikörper gegen die extrazelluläre Bakterien (Alexa Fluor 647) gefärbt. ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig1.jpg" /> Figur 1 Ablaufdiagramm des DC Erzeugung und CD4 + T-Zellen Isolation. Auf der linken Seite der Figur, der Prozess zu dendritischen Zellen (DCs) von Knochenmarkzellen zu differenzieren ist detailliert. Nach dem Sezieren Oberschenkelknochen und Schienbeinknochen, Knochenmarkzellen aus dem Inneren der Knochen extrahiert. Anschließend werden die roten Blutkörperchen (RBC) lysiert und Knochenmarkszellen, die mit rekombinanten murinen Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) für 9 Tage kultiviert werden. Sobald sie gut differenziert sind, werden DCs mit Lipopolysaccharid (LPS) inkubiert, um Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC II) Expression zu erhöhen. Dann werden DC, die mit einem bestimmten Ovoalbumin Peptid (OVAp) geladen und mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 Bakterien infiziert. Einige von ihnen werden nicht mit OVAp als Steuer geladen. Auf der rechten Seite der Figur, wie manIsolieren CD4 + T-Zellen von transgenen Mäusen OTII dargestellt. Lymphknoten (LNS) entfernt und gemahlen, wodurch eine Einzelzellsuspension. Schließlich werden CD4 + T-Zellen durch negative Selektion unter Verwendung eines magnetischen Zellseparation Maschine isoliert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig2.jpg" /> Abbildung 2 Flussdiagramm der T-Zell transinfection Verfahren. Infizierte (Bakterien sind grün dargestellt) und OVAp geladen-DCs (Erythrozyten) mit CD4 + T-Zellen (blaue Zellen) inkubiert, um die Immunsynapsenbildung zu ermöglichen. Infizierten DCs (aber nicht mit OVAp geladen) werden auch mit T-Zellen, die Interaktion zwischen den beiden Zellen ohne Immunsynapsenbildung ermöglicht inkubiert. Eine zusätzliche Kontrolle ist im Preis inbegriffen, die Trennung CD4 + </sup&gt; T-Zellen und DCs mit einem Polycarbonat Transwell-Barriere (+ TW), die DC-T-Zell-Kontakt verhindert. Direkte T-Zell-Infektion wird auch als Negativkontrolle einbezogen. Schließlich können T-Zellen transinfection durch zwei Verfahren quantifiziert werden, mittels Durchflusszytometrie (linke Seite der Figur), was die Anzahl von T-Zellen Erfassung Bakterien zeigt und durch Gentamicin-Überlebensassay (rechte Seite der Figur) eine sehr empfindliche Methode ( einem Bakterium infiziert erkannt werden können), die die bakterielle Infektionsrate. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig3.jpg" /> Abbildung 3. Durchflusszytometer Analyse der Knochenmark-DCs und isolierte CD4 + T-Zellen. Repräsentative Dot-Plots von Knochenmark-DCs analysiert durchDurchflusszytometrie. (A) DCs exprimiert MHCII und CD11c (85,8%; oberen rechten Quadranten) (B) DCs exprimiert MHCII aber nicht Gr-1 (85%; untere rechte Quadrant). Allerdings gab es eine 3,27% der Zellen, Gr-1, aber nicht MHCII-Zellen (obere linke Quadrant) ausgedrückt. Diese Zellen waren gering kontaminierten Neutrophilen. (C und D), Histogramme, die die Reinheit der CD4 + T-Zellen aus Lymphknoten (C) isoliert und nach Konjugatbildung mit dendritischen Zellen (D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig4.jpg" /> Abbildung 4. T-Zell-transinfection durch Gentamicin-Überlebensassay quantifiziert. LB-Agar-Platten wurden in 4 Abschnitte entsprechend DECIMA geteiltl serieller Verdünnungen von lysierten CD4 + T-Zellen. (A) koloniebildenden Einheiten von Salmonella ente gewachsen auf LB-Agarplatten, entsprechend T-Zell transinfection in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) des OVAp auf der Oberfläche der infizierten DC, und unter Bedingungen, die DC / T-Zell-Kontakt (- TW) oder in Gegenwart einer physischen Barriere behindert solcher Kontakte (+ TW). Eine leere Platte entspricht, direkten T-Zell-Infektion (Negativkontrolle) wird ebenfalls angezeigt. Es gab fast keine transinfection als DC / T-Zell-Kontakt wurde behindert (+ TW). (B) Quantifizierung der koloniebildenden Einheiten (CFUs) von mehreren Experimenten, die die Rate der bakteriellen durch T-Zellen aus infizierten DCs eingefangen. Direkte T-Zell-Infektion und Bedingungen behindert DC / T-Zell-Kontakt zu erzeugen wenig bis gar keine Ebenen der T-Zell-Infektion. Als DC / T-Zell-Kontakte erlaubt wurde, war T-Zell transinfection, und es wurde von der Antigenerkennung (+ OVAp) verbessert. Spalte Balken repräsentieren den Mittelwert von 3 independent Experimenten. Fehlerbalken zeigen die SD. Signifikante Unterschiede sind durch *** vertreten, was p &lt;0,0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig5.jpg" /> Abbildung 5. T-Zell-transinfection mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Repräsentative Dot-Plot zeigt DCs und T-Zell-Konjugate nach transinfection Prozess. CD4 + T-Zellen klein und rund, wie Vorwärts- und Seitenstreuung sind (FCS - SSC) Dot-Blot-Shows, und um gut differenziert zu sein, wurden sie mit einer Zelle Tracker (CMAC) angefärbt wurden. DCs CD11c exprimieren, werden nicht mit CMAC markiert und sind größer als T CD4 + T-Zellen mit unregelmäßiger Form. Infizierten CD4 + T-Zellen, die intrazelluläre Bakterien-GFP, aber negativer extracelzelluläre Bakterien (6,19%) in der unteren rechten Quadranten dargestellt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Bakterienerfassung durch CD4 + T-Zellen, die während der Antigenpräsentation über transinfection aus bereits infizierten dendritischen Zellen (DC) auftritt, zu messen. Wir zeigen, wie man die notwendigen Schritte durchführen: Isolierung von primären Zellen, Infektion von DC, DC / T-Zell-Konjugat-Bildung, und die Messung der bakteriellen T-Zell-Transfektion.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Aufrufe.  Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC).  Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Bakterienerfassung durch CD4 + T-Zellen, die während der Antigenpräsentation über transinfection aus bereits infizierten dendritischen Zellen (DC) auftritt, zu messen. Wir zeigen, wie man die notwendigen Schritte durchführen: Isolierung von primären Zellen, Infektion von DC, DC / T-Zell-Konjugat-Bildung, und die Messung der bakteriellen T-Zell-Transfektion. 

Serie: T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...