This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cient&#236;ficas (CSIC).

Nota: le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per la Ricerca Etica della Universidad Autonoma de Madrid e condotto sotto la supervisione della Universidad Autonoma de Madrid Responsabile del benessere degli animali e la salute in conformità alle linee guida spagnole ed europee. I topi sono stati allevati in specifico gratuito (SPF) abitazioni patogeno e sono stati sacrificati da personale addestrato e qualificato che utilizzano anidride carbonica (CO 2) metodo di inalazione. 1. Topo midollo osseo di derivazione DC Differenziazione e infezione Nota: La figura 1 riassume questo primo passo. Tutte le procedure devono essere effettuate nel cappuccio da questo punto in poi, utilizzando solo i media, strumenti, puntali sterili e piatti della cultura. <ol><li> Topo midollo osseo DC Differenziazione <ol><li> Sezionare tibie e femori da un C57 / BL6 del mouse 22 e trasferire in un piatto di plastica con 10 ml di terreno RPMI. </li&gt; <li> Tagliare ogni epifisi via, con forbici sterili ed esporre il midollo osseo, che ha un colore rosso brillante caratteristica. </li><li> Infondere l&#39;interno dell&#39;osso con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 0,5% di siero albumina bovina (BSA) e 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone PBS / BSA / EDTA) utilizzando una siringa sterile su un Petri sterile piatto. </li><li> Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare in un tubo a 600 xg in una centrifuga refrigerata (4 ° C). </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di cloruro di ammonio-potassio (ACK) tampone di lisi (0,15 M NH 4 Cl, 10 KHCO 3 mM e 0,1 mM EDTA) e incubare per 30 sec a RT per eliminare i globuli rossi. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno RPMI 1640 con siero fetale bovino 10% (FBS) e filtrare attraverso un filtro cella (70 micron) per eliminare i frammenti ossei e grumi di cellule prima centrifugazione alla stessa velocità (600 xg) perché ciuffi sono stati eliminati per filtrazione. </li><li> Contare le celle und regolare a 5 x 10 5 cellule / ml con RPMI 10% FBS (contenente 50 mM B-mercaptoetanolo, 1 mM sodio piruvato) e aggiungere 20 ng / ml ricombinante murino colony- fattore stimolante granulociti-macrofagi (rm-GM-CSF) come concentrazione finale. </li><li> Aggiungi questa sospensione a uno sterile, qualità microbiologica, 15 centimetri piastra di Petri, e la cultura in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% di CO 2). </li><li> Ogni tre giorni, spin down sia le cellule non aderenti e cellule indipendenti con 5 mM EDTA in PBS e risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml di densità cellulare, con terreno fresco contenente 20 ng / ml rm-GM-CSF. </li></ol></li><li> Maturazione delle DC e Antigen Caricamento <ol><li> Al giorno 9, sospendere nuovamente le cellule a 5 x 10 5 cellule / ml di densità in mezzo contenente 20 ng / ml rm-GM-CSF. Quindi aggiungere 20 ng / ml di lipopolisaccaride (LPS) per permettere elevata espressione MHC-II su cellule e incubare in un piatto 15 cm sterile Petri cultura trattati non-tessuto per 24 ore. </li><li> Dopo unogiorno di LPS-stimolazione, macchia alcune cellule DC con anticorpi contro CD11c mouse MHCII e Gr-1 per controllare DC differenziazione mediante citometria a flusso. Un esempio di analisi citofluorimetrica delle DC è mostrato in Figura 3A e 3B. <ol><li> Incubare DC (5 x 10 5 cellule / campione) con un anticorpo monoclonale anti-topo-CD16 / CD32 a 2,5 ug / ml di concentrazione finale di 50 microlitri di PBS / BSA / EDTA per campione. In seguito, aggiungere 50 ml di anticorpi contro MHCII (IA / IE), CD11c e Gr-1 coniugato con fluorocromi diversi a 1: 100, 1: 200 e 1: 500 in PBS / BSA / EDTA, rispettivamente. </li><li> Infine, lavare DC con PBS / BSA / EDTA e analizzare mediante citometria a flusso, secondo il protocollo del produttore. Nota: Se le cellule sono ben differenziate, le cellule sono pronte per l&#39;antigene di carico. </li></ol></li><li> Lavare DC con RPMI 10% FBS (senza antibiotici) e incubare con 10 mg / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) su un tubo di plastica in 1 ml di 10% FBS RMPI medio per 5 x 10 6 cellule dendritiche per almeno 1 ora a 37 ° C. Come controllo negativo, lasciare DC senza incubazione con OVAp. </li></ol></li><li> L&#39;infezione delle DC <ol><li> Infect DC ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 batteri (10 batteri per DC) per 1 h in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Lavare le cellule DC 3x in PBS 1x e in RMPI 10% FBS e centrifugare a 450 xg per lavare la maggior parte dei batteri extracellulari. Infine, risospendere le cellule in RMPI 10% FBS medio (senza antibiotici) a 20 x 10 6 cellule / ml. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento di linfociti T CD4 + da OTII topi transgenici Nota: La figura 1 riassume questa seconda fase. I linfonodi devono essere utilizzati al posto di milza per isolare le cellule T CD4 +, in quanto la percentuale di linfociti CD4 + in linfonodos (~ 50%) è maggiore rispetto alla milza (~ 25%) e quindi la purificazione sarebbe più efficace. <ol><li> Fai la sospensione singola cellula del Linfonodi <ol><li> Rimuovere inguinali, ascellari, brachiale, del collo dell&#39;utero e la linfa mesenterica nodi da 23 OTII topi transgenici e trasferire in un piatto di plastica con 10 ml di RPMI 10% FBS medio. </li><li> Linfonodi Grind sotto una cappa sterile utilizzando due vetrini da microscopio smerigliato. Posizionare linfonodi su un lato smerigliato di un vetrino da microscopio, e strofinare con il lato smerigliato della seconda slitta fino a quando gli organi sono stati terra. </li><li> Lavare sospensione singola cellula in tampone PBS / BSA / EDTA. </li><li> Filtrare le celle se un filtro cella (70 micron) per rimuovere il tessuto connettivo e lavare con PBS / BSA / EDTA. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi ACK e incubare per 1 min a RT per eliminare i globuli rossi. </li></ol></li><li> L&#39;isolamento di cellule CD4 + T Cells <ol><li> Lavare nuovamente come al punto 2.1.3 e conteggiocellule per risospendere in 100 x 10 6 cellule / ml in PBS / BSA / EDTA. Aggiungere anticorpi biotinilati contro CD8, IgM, B220, CD19, MHC di classe II (I-Ab), CD11b, CD11c e DX5 a 1: 250 per 30 min in ghiaccio per la selezione successiva negativo delle cellule T CD4 +. </li><li> Lavare le cellule in PBS / BSA / EDTA e incubare le cellule (100 x 10 6 cellule / ml) con microsfere streptavidina alla concentrazione raccomandata in protocollo del produttore per 15 min in ghiaccio. </li><li> Lavare le cellule in PBS / BSA / EDTA e filtrare se un colino cella (30 micron) prima di isolamento delle cellule T CD4 +. </li><li> Isolare le cellule T CD4 + da selezione negativa utilizzando una macchina di separazione cellulare magnetica secondo il protocollo del produttore. </li><li> Contare le cellule e regolare a 4 x 10 6 cellule / ml con RPMI 10% FBS medio (senza antibiotici). </li><li> Fissare e tenere in ghiaccio isolato cellule T CD4 + (3 x 10 5 cellule) per verificare la purezza dal flussocitometro come descritto 24. Un esempio di CD4 + T cellule purificazione è mostrato in Figura 3C. </li></ol></li></ol> 3. T cellulare Transinfection misura dalla Protezione Gentamicina Assay Nota: La Figura 2 riassume questo terzo gradino del protocollo. <ol><li> Transinfection cellule T <ol><li> Incubare isolate cellule T CD4 + con cellule infettate DC (1: 1) (PVS sono stati infettati per 1 ora e lavati per eliminare i batteri gratuito) per 30 minuti per consentire la formazione di sinapsi immunitaria in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di isolate cellule CD4 + T (2 x 10 6 cellule) e 0,1 ml di DC infetti (2 x 10 6 cellule) su una piastra di coltura da 24 pozzetti. Come controllo negativo, infettare direttamente 0,5 ml di cellule CD4 + T ad una MOI di 10 batteri per 30 min. </li><li> Includere controlli supplementari che separano DC infettate da linfociti T conuna barriera policarbonato transwell (con 3 micron di dimensione dei pori), impedendo DC-T contatto fisico. Aggiungere 0,1 ml di DC all&#39;interno transwell e 0,5 ml di cellule CD4 + T nel vano inferiore del pozzetto (24-pozzetti). </li><li> Infine, completa di RMPI medio fino a quando non vi è di 0,6 ml in ciascun pozzetto per fare volume è uguale in tutti i campioni. </li><li> Dopo 30 min di formazione di sinapsi immune, aggiungere 100 ug / ml di gentamicina e incubare per 1 ora prima di raccogliere le cellule in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol></li><li> Re-isolamento di cellule T CD4 + <ol><li> Raccogliere le cellule non aderenti e risospendere in tampone PBS / BSA / EDTA. La maggior parte delle DC restare attaccata alla piastra di coltura in plastica. Tubi vortex delicatamente per garantire la disgregazione delle cellule. Mantenere 500 ml di surnatante cellulare come controllo per dimostrare che gentamicina ha funzionato bene. </li><li> Re-isolare le cellule T CD4 + da campioni che contengono DC e cellule T insieme come al punto 2.2, Anche se la maggior parte del PVS avrebbe dovuto attaccato sulla piastra. Mantenere i campioni di controllo su ghiaccio. Prendere in considerazione solo gli esperimenti di contaminazione inferiore al 2%. Un esempio di CD4 + T cellule purificazione dopo transinfection è mostrato in Figura 3D. </li></ol></li><li> Lyse cellule T e sementi di loro su batteri Piastre medio-agar. <ol><li> Lavare le cellule T CD4 + due volte con PBS. </li><li> Contare le cellule e risospendere a 2 x 10 6 cellule / ml in PBS. </li><li> Aggiungere 500 ml di 0,1% Triton X-100 in 500 microlitri di cellule T a loro lisare a 1 x 10 6 cellule / ml, rilasciando i batteri intracellulari fuori delle cellule T. </li><li> Fai 3 diluizioni decimali in serie di cellule lisate e sementi 50 ml di ogni diluizione su batteri medie piastre di agar. Dividere le piastre in 4 porzioni e seminare le diverse diluizioni di cellule lisate in ogni sua parte. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4. <ol><li> Come controllo, anche il piattosurnatante cellulare memorizzato dei coniugati di agar, per garantire che gentamicina ha funzionato bene. Piatto anche DC infetti come controllo supplementare. Nel caso in cui la contaminazione basso PVS si verifica (&lt;2%), sottrarre le unità formanti colonie (CFU) corrispondenti alla contaminazione basso CC. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Quantificazione dei T Transinfection cellulare mediante citometria di flusso Nota: La Figura 2 riassume questo passaggio. <ol><li> T Transinfection cellulare <ol><li> Infect BMDCs come al punto 1.3, ma utilizzare GFP esprimere batteri in questo caso. </li><li> Stain cellule T CD4 + (isolate da linfonodi al passo 2.2) con un aminocoumarin inseguitore cellulare clorometil (CMAC) per 30 minuti a 37 ºC secondo il protocollo del produttore. </li><li> Lavare le cellule T CD4 + etichettati due volte con RMPI 10% FBS (senza antibiotici). </li><li> Incubare DC infette (dopo 1 ora di incubazione con i batteri) con etichettato CD4 +Le cellule T per 30 minuti per consentire la formazione di sinapsi immune a 37 ° C tra cui tutti i controlli che spiegano al punto 3.1.1. </li></ol></li><li> La colorazione di infetti cellule T CD4 + <ol><li> Dopo 30 minuti di DC-T formazione di sinapsi immunitaria, raccogliere le cellule e lavarli in PBS / BSA / EDTA. </li><li> Dopo due lavaggi con PBS / BSA / EDTA, cellule aggregati separati da vortex delicatamente i tubi. </li><li> Fissare i campioni in 0,2 ml / provetta di PBS contenente il 3% PFA per 15 minuti a RT. Poi lavare in PBS. </li><li> Incubare con anti-topo-CD16 / CD32 anticorpo monoclonale (2,5 mg / ml) in 50 microlitri / campione di PBS / BSA / EDTA per 15 min in ghiaccio per bloccare i recettori Fc delle cellule dendritiche. </li><li> Aggiungere un coniglio anti-batteri anticorpo (10 mg / ml concentrazione finale) in 50 microlitri / campione di PBS / BSA / EDTA per 30 min in ghiaccio per macchiare batteri extracellulari. </li><li> Lavare le cellule con PBS / BSA / EDTA e incubare con un anticorpo contro topo coniugato con ficoeritrina CD11c (PE) e seanticorpo condary contro di coniglio coniugato con altri fluorocromo come Alexa-Fluor 647 a 1: 200 in 100 l / campione di PBS / BSA / EDTA per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Lavare le cellule e analizzare campioni mediante citometria a flusso. Non dimenticare di includere un campione di cellule T transinfected utilizzando batteri non fluorescenti come controllo negativo e campioni etichettati con solo uno di ciascuno fluorocromo utilizzato per l&#39;esperimento di compensare i campioni e regolare il flusso citometria impostazioni 25. Analisi rappresentativa è mostrato in Figura 5. Nota: Se i batteri non esprimono GFP, per distinguere intracellulare e batteri extracellulari, etichette batteri extracellulari, fissare, e permeabilize campioni con Triton X-100 allo 0,5% in PBS per 5 min. Poi macchia batteri intracellulari totali (+ extracellulari) con un fluorocromo diverso. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Cellule T o linfociti T sono un tipo di leucociti che svolgono un ruolo centrale nella immunità cellulo-mediata e appartenenti alla risposta immunitaria adattativa 26. Le cellule T sono refrattari alla infezione in vitro, ma alcuni rapporti indicano che possono essere infettati in vivo 14,15. I contatti intimi delle cellule APC e T durante sinapsi immune fungono da piattaforme per lo scambio di materiale biologico 13, tra cui alcuni virus come l&#39;HIV 11. E &#39;stato recentemente dimostrato che, contrariamente al dogma, le cellule T, il paradigma di cellule dell&#39;immunità adattativa, sono anche in grado di catturare in modo efficace i batteri di transinfection da DC infetti 11,16. Qui vi mostriamo ha dettagliato i protocolli per la quantificazione delle cellule T transinfection batterica in vitro da BMDCs infetti. T cellule transinfection batterica è stata rafforzata dal riconoscimento dell&#39;antigene 16. Abbiamo dimostrato che utilizzando cellule T CD4 + isolato dalTopi transgenici OTII riconoscendo un OVAp specifica, BMDCs caricati con OVAp e topi infettati con batteri diversi (qui i dati vengono presentati da Salmonella enterica). CD4 + T cellule isolate da topi OTII sono incubati con DC infetti per 30 minuti per consentire la formazione di sinapsi immunitaria. I dati presentati qui corrispondono ai batteri che cellule T possono catturare da DCS in questo breve periodo di tempo. Sappiamo che l&#39;esposizione di cellule T più lunghi ai DC infettate determinato catture batteriche più grandi (non mostrato), ma come cellule T distruggono anche i batteri uptaken molto rapidamente, quantificazione transinfection batterica che si verifica durante lunghi contatti cellulare time DC / T rivelato difficile . Gentamicina assay sopravvivenza è un metodo molto sensibile per quantificare transinfection cellule T in quanto è in grado di rilevare un singolo batterio infettante 21. Dopo l&#39;incubazione con gentamicina che uccidere i batteri solo extracellulari, le cellule T sono isolati e lisati per seminare su batteri agar plAtes. L&#39;isolamento di cellule T dopo la formazione coniugati con DC è un passaggio fondamentale all&#39;interno del protocollo. Solo esperimenti con meno del 2% di contaminanti devono essere presi in considerazione. Contaminazione DC può essere misurata con citometria a flusso e CFU corrispondenti alla contaminazione basso DC devono essere sottratti. In alternativa, le cellule T CD4 + purezza può essere migliorata utilizzando l&#39;ordinamento delle cellule. Un altro approccio per quantificare transinfection cellule T è mediante citometria di flusso, usando GFP che esprimono i batteri e l&#39;etichettatura dei batteri extracellulari con un fluoroforo compatibili. Un limite di questo approccio è che i batteri devono esprimere un GFP sufficientemente luminoso per rilevare le cellule infettate sullo sfondo autofluorescenza. In alternativa, batteri potrebbero essere colorate prima di infettare DC con un tracker cellulare. Un altro approccio sarebbe macchiare i batteri extracellulari, permeabilizzante le cellule T, quindi etichettare tutti i batteri (intracellulare + extracellulare)con un fluorocromo diverso. Per quanto riguarda le direzioni future di questo protocollo, stiamo cercando di istituire un protocollo per quantificare il numero di cellule T che ha catturato i batteri dopo più esposizione al DC infetti, utilizzando batteri decorati con particelle magnetiche. Le cellule T cattura batteri manterrebbero le particelle magnetiche e quindi dovrebbe essere facile da isolarli utilizzando magneti.

Quando un agente patogeno infetta il suo ospite, di solito c&#39;è una attivazione delle risposte immunitarie innate e adattative, necessari per la liquidazione dei batteri. L&#39;immunità innata è la prima linea di difesa che impedisce maggior parte delle infezioni. L&#39;immunità innata distinguere in precisi elementi di modo che si conservano tra grandi gruppi di microrganismi (modelli molecolari associati ai patogeni, PAMPs) 1. I meccanismi dell&#39;immunità innata sono barriere fisiche come la pelle, i prodotti chimici barriere (peptidi antimicrobici, lisozima) ed i leucociti innate, che includono fagociti (macrofagi, neutrofili e cellule dendritiche), mastociti, eosinofili, basofili, e le cellule natural killer 2. Queste cellule identificare ed eliminare gli agenti patogeni, sia attaccandoli per contatto o tramite fagocitosi, che comprende patogeno inghiotte e uccisioni. Questo sistema non consente difesa permanente, in contrasto con l&#39;immunità adattativa, che conferisce una memoria immunologica contro pathogens. Il sistema immunitario adattativo è la seconda linea di difesa ed è in grado di riconoscere e reagire ad antigeni specifici di microbica multipla e sostanze non-microbiche 3. I principali componenti del sistema immunitario adattativo sono i linfociti, che includono cellule B e T. Cellule B sono coinvolte nella risposta umorale, secernono anticorpi contro agenti patogeni o proteine ​​esogene. Tuttavia, le cellule T rappresentano l&#39;immunità cellulo-mediata, modulare la risposta immunitaria con citochine secrezione o uccidere cellule del patogeno infettate 4. Le cellule presentanti l&#39;antigene (APC) tra cui le cellule dendritiche e macrofagi, componenti del sistema immunitario innato, in grado di riconoscere gli agenti patogeni batterici fagocitare e componenti di processo in antigeni, che vengono presentati alla superficie cellulare da parte del Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC) 5-7. Dopo APC hanno fagocitato patogeni, di solito migrano ai nodi linfatici drenante, dove interagiscono con Tcellule. Linfociti T in grado di riconoscere specifici complessi peptide-MHC dai loro recettori delle cellule T. La sinapsi immune (IS) avviene nell&#39;interfaccia tra un antigene APC caricato e un linfocita durante antigene presentazione 8,9. Alcuni batteri possono sopravvivere fagocitosi e diffondere sistematicamente all&#39;interno APC. In questa prospettiva, APC infetti fungono da serbatoi batteriche o &quot;cavalli di Troia&quot; che facilitano la diffusione batterica 10. Il contatto intimo tra APC e linfociti che si svolgono durante il corso di formazione è la funzione anche come piattaforma per lo scambio di parte delle membrane, il materiale genetico e esosomi e può essere dirottato per alcuni virus di infettare le cellule T; questo processo è chiamato transinfection 11-13. Alcuni batteri patogeni (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica e Shigella flexneri) sono in grado di invadere i linfociti T in vivo e modificare il loro comportamento 14-16. abbiamorecentemente descritto che i linfociti T sono anche in grado di catturare i batteri di transinfection dalle cellule dendritiche precedentemente infettati (DC) nel corso della presentazione dell&#39;antigene 16. T cellule cattura batterica transinfection estremamente più efficace (1,000-4,000x) di infezioni dirette. T cattura cellule patogeni e batteri non patogeni che indica che transinfection è un processo guidato da cellule T. Sorprendentemente, transinfected T (TIT) cellule in rapida ucciso i batteri catturati e lo ha fatto in maniera più efficiente di fagociti professionali 16. Questi risultati, che rompono un dogma di immunologia, mostrano che le cellule dell&#39;immunità adattativa in grado di eseguire le funzioni che erano presumibilmente esclusivo dell&#39;immunità innata. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule tetta secernono grandi quantità di citochine pro-infiammatorie e proteggono dalle infezioni batteriche in vivo. Qui vi presentiamo i diversi protocolli utilizzati per studiare il processo transinfection battericaun modello di topo. Questo modello è basato sull&#39;impiego di cellule T CD4 + da topi transgenici OTII, che portano una specifica TCR per peptide 323-339 di OVA (OVAp) nel contesto di I-Ab 17 che interagiscono specificamente con l&#39;osso batteri infetti dal midollo DC derivati ​​(BMDCs) 18,19 carichi di OVAp, formando sinapsi immuni stabili. Transinfection cellule T possono essere visualizzati e monitorati mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, la citometria a flusso può essere utilizzato per rilevare le cellule infettate sfruttando la fluorescenza emessa da batteri che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) 16,20. Inoltre, transinfection cellule T può essere quantificata con un approccio più sensibile, il saggio di sopravvivenza gentamicina che permette di misurare un gran numero di eventi. Gentamicina è un antibiotico che non può penetrare cellule eucariotiche. Pertanto, utilizzando questo antibiotico permette la differenziazione dei batteri intracellulari che è sopravvissuto l&#39;antibiotico aggiunta frquelli extracellulari om che sono stati uccisi 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">RPMI</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SH3025501</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">r-GMCSF</td>
			<td style="width:131px;">Peprotech</td>
			<td style="width:104px;">315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">LPS</td>
			<td style="width:131px;">SIGMA</td>
			<td style="width:104px;">L2630-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:131px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">SH3023901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">2-ME</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">OVAp OTII (323&#8211;339)</td>
			<td style="width:131px;">GenScript</td>
			<td style="width:104px;">---</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Cell Strainer 70uM</td>
			<td style="width:131px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;30uM Syringe Filcons Sterile</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">340598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">AutoMacs Classic</td>
			<td style="width:131px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-088-887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:131px;">Normon</td>
			<td style="width:104px;">624601.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Transwell</td>
			<td style="width:131px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">LB</td>
			<td style="width:131px;">Pronadisa</td>
			<td align="right">1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Agar</td>
			<td style="width:131px;">Pronadisa</td>
			<td align="right">1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:341px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD8 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">IgM Biot</td>
			<td style="width:131px;">ImmunoStep</td>
			<td style="width:104px;">Clone RMM-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">B220 Biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD19 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">MHC-II Biot (I-A/I-E)</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11b biot</td>
			<td style="width:131px;">Immunostep</td>
			<td style="width:104px;">11BB-01mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11c biot</td>
			<td style="width:131px;">Immunostep</td>
			<td>11CB3-01mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">DX5 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Gr-1 biot</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD16/CD32</td>
			<td style="width:131px;">ImmunoStep</td>
			<td>M16PU-05MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">anti Salmonella</td>
			<td style="width:131px;">ABD Serotec</td>
			<td style="width:104px;">8209-4006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD11cPE</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:104px;">553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:131px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">20-0041-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gr-1 APC</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-II (I-A/I-E) FITC</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)</td>
			<td style="width:131px;">Life technologies</td>
			<td>C2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">BSA</td>
			<td style="width:131px;">SIGMA</td>
			<td style="width:104px;">A7030-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">Streptavidin MicroBeads</td>
			<td style="width:131px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:104px;">130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">BD FACSCanto II</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">---</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

t cells capture bacteria by transinfection from dendritic cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Qui abbiamo descritto come eseguire murine cellule T transinfection batterica dal midollo osseo derivate infetto-DC e come misurare transinfection batterica attraverso due diversi approcci: citofluorimetria e gentamicina sopravvivenza saggio Figura 1 riassume la procedura per ottenere le cellule.. DC sono generate da incubazione delle cellule del midollo osseo con GM-CSF per 9 giorni. Poi, DC sono maturata con LPS per aumentare MHCII sulla sua membrana per caricarli in seguito con uno specifico peptide di OVA (OVAp). Come controllo, alcuni PVS non sono caricati con OVAp. Entrambi DC (OVAp-caricati e non caricati) sono infettati in una molteplicità di infezione (MOI) di 10 batteri. D&#39;altro canto, le cellule T CD4 + sono isolati da linfonodi di topi transgenici OTII, che riconoscono il OVAp specifico. La Figura 2 illustra la procedura per eseguire e quantificare transinfection cellule T, compresi gli opportuni controlli negativi. Come descriletto prima, alcuni controller di dominio non vengono caricate con OVAp. In questo caso, vi è una interazione tra DC e cellule T, ma non immune formazione delle sinapsi causa dell&#39;assenza di OVAp. Un ulteriore controllo è incluso, separando DC e cellule T con una barriera in policarbonato transwell (con 3 micron di dimensione dei pori), che impedisce DC-T contatto fisico. DC sono compresi all&#39;interno del transwell; di conseguenza non sono in grado di passare attraverso questa dimensione dei pori. Un altro controllo negativo è anche incorporato, l&#39;infezione diretta delle cellule T, incubando cellule T direttamente ad una MOI di 10 batteri. Transinfection cellule T può essere quantificato due approcci: la citometria a flusso o gentamicina test di sopravvivenza. Per misurare mediante citometria di flusso, le DC avrebbe dovuto essere infettati precedentemente con le cellule dei batteri-GFP e CD4 + T macchia con un tracker cellulare (cellule T-blu). Dopo la formazione coniugato, le cellule devono essere marcate con anticorpi contro DC (CD11c-PE). I batteri extracellulari dovrebbero essere colorati per quantify la percentuale di cellule CD4 + T infettate mediante citofluorimetria seguito. Per misurare transinfection da gentamicina test di sopravvivenza, le cellule vengono incubate con gentamicina per 1 ora per uccidere i batteri extracellulari, quindi le cellule T sono ri-isolati a seme su piastra di agar. Diluizioni decimali sono fatti per seminare 50 ml di ogni diluizione su piastra di agar e facilitare il conteggio dei CFU. Come mostrato in figura 3, differenziazione DC deve essere controllato mediante citometria di flusso (Figura 3A e 3B). DC dovrebbe esprimere CD11c e MHCII (Figura 3A) e non Gr-1, che è un marker di neutrofili. Come illustrato nella figura 3B, alcuni neutrofili (3,27% di Gr-1 +, MHC -) sono stati presentati nella cultura, ma la cultura DC con più del 5% di contaminazione neutrofili non devono essere utilizzati. CD4 + T cellule purezza deve essere controllata dopo l&#39;isolamento da lynodi mph (Figura 3C) e dopo la separazione da DC coniuga formazione (Figura 3D). Occorre tener conto degli esperimenti con meno del 2% dei contaminanti dopo la formazione coniugati. La Figura 4 mostra un esempio di esperimento transinfection T usando Salmonella. Come illustrato nella figura 4A, le piastre sono divisi in quattro porzioni di sementi diluizioni seriali in ogni sua parte. Salmonella sono cresciute su piastre di agar LB e unità formanti colonie possono essere contati. Come mostrato in Figura 4A, Salmonella è stato catturato dalle cellule T infettate da DCS e questo processo è stato chiaramente migliorato con riconoscimento OVAp (piastre a sinistra della Figura 4A e 4B). Tuttavia, quando c&#39;era una barriera fisica impedendo il contatto tra le cellule dendritiche e T, non c&#39;era praticamente transinfection, come nel caso di fare una diretta T<html> infezione delle cellule (piastre a destra di Figura 4A e 4B). Come mostrato in figura 5, transinfection cellule T può essere quantificata mediante citofluorimetria utilizzando batteri che esprimono un GFP luminoso. Cellule DCs e T possono essere differenziati per dimensioni e complessità in una trama in avanti e laterale scatter, ma diversi marcatori possono essere utilizzati per ben distinguerli. Cellule T CD4 + sono stati etichettati con un tracker cellulare (CMAC) e DC con un anticorpo contro CD11c. Batteri extracellulari sono state colorate con un anticorpo di coniglio contro la Salmonella e secondaria di anticorpi anti-coniglio coniugato con Alexa Fluor 647. Pertanto, la percentuale di cellule T CD4 + infetti può essere quantificato in quanto sono etichettati con CMAC (non con CD11c-PE) ed espresso GFP (batteri-GFP), ma che non sono state colorate con l&#39;anticorpo contro i batteri extracellulari (Alexa Fluor 647). S copi &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig1.jpg" /> Figura grafico 1. Flusso di generazione DC e CD4 + T cellule isolamento. Sul lato sinistro della figura, il processo per differenziare le cellule dendritiche (DC) di cellule di midollo osseo è dettagliata. Dopo dissezione femore e tibia, cellule del midollo osseo sono estratte dall&#39;interno delle ossa. In seguito, i globuli rossi (RBC) vengono lisati e le cellule del midollo osseo sono coltivate con colony- fattore stimolante ricombinante murino granulociti-macrofagi (GM-CSF) per 9 giorni. Una volta che sono ben differenziati, le DC vengono incubate con lipopolisaccaride (LPS) per aumentare Complesso Maggiore di Istocompatibilità II (MHCII) espressione. Poi, DC sono caricati con uno specifico peptide ovoalbumin (OVAp) e infettate con una molteplicità di infezione (MOI) di 10 batteri. Alcuni di loro non sono caricati con OVAp come controllo. Sul lato destro della figura, comeisolare le cellule T CD4 + da OTII topi transgenici è rappresentato. I linfonodi (LNS) vengono rimossi e terra, ottenendo una cella singola sospensione. Infine, le cellule T CD4 + sono isolate per selezione negativa utilizzando una macchina di separazione cellulare magnetica. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig2.jpg" /> Figura 2. Diagramma di flusso di T procedura transinfection cellule. Infected (batteri sono raffigurati in verde) e OVAp caricati-DC (globuli rossi) sono incubati con cellule T CD4 + (cellule blu) per consentire la formazione di sinapsi immunitaria. DC Infected (ma non caricato con OVAp) sono anche incubati con le cellule T, che permette l&#39;interazione tra le due cellule, ma senza la formazione di sinapsi immunitaria. Un ulteriore controllo è incluso, separando CD4 + </sup&gt; cellule T e DC con una barriera di policarbonato transwell (+ TW), che impedisce il contatto delle cellule DC-T. Infezione diretta delle cellule T è anche incorporato come controllo negativo. Infine, transinfection cellule T può essere quantificato due metodi, mediante citometria a flusso (lato sinistro della figura), che indica il numero di cellule T catturare batteri, e gentamicina assay sopravvivenza (lato destro della figura) un metodo molto sensibile ( un batterio che infetta può essere rilevata) che indica il tasso di infezione batterica. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig3.jpg" /> Figura 3. Citometro di flusso analisi del midollo osseo derivate-DC e isolate cellule T CD4 +. Dot plots rappresentativi di midollo osseo derivate-DC analizzate dacitometria a flusso. (A) DC espresso MHCII e CD11c (85,8%; quadrante in alto a destra) (B) DC espressi MHCII ma non Gr-1 (85%; quadrante in basso a destra). Tuttavia, c&#39;era un 3,27% di cellule che esprimono cellule MHCII Gr-1 ma non (quadrante superiore sinistro). Queste cellule sono state lievi neutrofili contaminati. (C e D) istogrammi rappresentano la purezza delle cellule T CD4 + isolate da linfonodi (C), e dopo la formazione coniugato con cellule dendritiche (D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig4.jpg" /> Figura 4. T transinfection cellule quantificato da gentamicina test di sopravvivenza. Piastre di agar LB sono stati divisi in 4 porzioni corrispondenti a Decimadiluizioni seriali l di cellule T CD4 + lisato. (A) unità formanti colonie di Salmonella enterica cresciute su piastre di agar LB corrispondente al transinfection cellule T in presenza (+) o in assenza (-) di OVAp sulla superficie di DC infetti, in condizioni che consentano contatto DC / T cell (- TW) o in presenza di una barriera fisica impedendo tali contatti (+ TW). È anche mostrato un piatto vuoto corrispondente ad infezione delle cellule T diretta (controllo negativo). Non c&#39;era quasi nessun transinfection in caso di contatto delle cellule DC / T è stato ostacolato (+ TW). (B) Quantificazione dei Colony Forming Unit (CFU) da diversi esperimenti che mostrano il tasso di batterica catturato da cellule T da DC infetti. Infezione diretta delle cellule T, e le condizioni che impediscono il contatto delle cellule DC / T producono poco o nessun livelli di infezione delle cellule T. Quando era consentito contatti di cellule DC / T, c&#39;era transinfection delle cellule T, ed è stata rafforzata dal riconoscimento dell&#39;antigene (+ OVAp). Barre colonna rappresentano la media di 3 iEsperimenti ndependent. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Differenze significative sono rappresentate da ***, corrispondenti a p &lt;0,0001. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52976/52976fig5.jpg" /> Figura 5. T transinfection cellule quantificata mediante citometria a flusso. Dot Rappresentante trama mostrando DC e coniugati cellule T dopo processo transinfection. Cellule T CD4 + sono piccoli e rotondi come in avanti e scatter laterale (FCS - SSC) spettacoli Dot Blot, e in modo da essere ben differenziati, sono state colorate con un tracker cellulare (CMAC). DC esprimono CD11c non sono etichettati con CMAC e sono più grandi rispetto alle cellule T CD4 + T con forma irregolare. Infettate cellule T CD4 + che contengono i batteri intracellulari-GFP, ma negativo per extracelbatteri lular (6,19%) sono riportati nel quadrante in basso a destra. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52976/52976fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Qui un protocollo viene presentato per misurare la cattura batterica da parte delle cellule T CD4 + che si verifica durante la presentazione dell&#39;antigene via transinfection dalle cellule dendritiche pre-infettati (DC). Mostriamo come eseguire i passi necessari: isolamento delle cellule primarie, infezione di DC, DC / T formazione coniugato cellulare, e la misura di batteri trasfezione delle cellule T.

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Views.  Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC).  Qui un protocollo viene presentato per misurare la cattura batterica da parte delle cellule T CD4 + che si verifica durante la presentazione dell'antigene via transinfection dalle cellule dendritiche pre-infettati (DC). Mostriamo come eseguire i passi necessari: isolamento delle cellule primarie, infezione di DC, DC / T formazione coniugato cellulare, e la misura di batteri trasfezione delle cellule T. 

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall&#39;intestino mouse

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivazione di cellule T<em&gt; In Vitro</em&gt; Da cellule staminali embrionali di topo

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...