Wir anerkennen die Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat (RP7/260916), die Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DE1951 und SFB889).

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für den deutschen Tierschutz durchgeführt.
Hinweis: Die Timeline und die Hauptschritte des Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>
Bereiten Sie die folgenden Lösungen.
	<ol>
<li>Vorbereiten der DMEM + Kultivierung polygonale MD Astrozyten: DMEM mit 10 % FCS, 100 U Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin.</li>
		<li>Vorbereiten der Kultivierung stellate Astrozyten NB + H: Neurobasal Medium mit 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 Ergänzung, 1 X Glutamin ergänzen, 100 U Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin. Hinweis: Aliquote höherer Konzentrationen von HBEGF erstellt und gespeichert werden können bei-20 ° C auf das Medium bei Bedarf hinzugefügt werden.</li>
		<li>Bereiten Sie die Dissektion Medium (10 mM HEPES in HBSS).</li>
		<li>Bereiten Sie Aliquote von 6-7 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und 6-7 mL 0,25 % Trypsin-EDTA in 15 mL-Tuben. Diese können bei-20 ° C gelagert und in einem 37 ° C Wasserbad aufgetaut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am Tag vor Beginn des Protokolls Mantel 10 cm Gewebekultur-behandelten Gerichte mit 5 mL je 0,04 % Polyethylenimine (PEI).</li>
	<li>Am nächsten Tag die PEI zu entfernen und den Abwasch mit destilliertem, entionisiertem Wasser zweimal. Jede Platte 12 mL DMEM + hinzu und Pre-equilibrate im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 30 min vor der galvanischen Zellen.</li>
	<li>Vorbereiten der Dissektion Bereich: In einer Laminar-Flow Dissektion Kapuze, legen Sie zwei 10 cm Petrischalen mit Dissektion Medium auf Eis gefüllt. Für jeden Bereich des Gehirns werden isoliert (z.B.Kortex, Hippocampus), bereiten Sie eine 15-Röhre mit 14 mL Dissektion Medium gefüllt und halten Sie auf dem Eis. Sprühen Sie Dissektion Werkzeuge (feine Schere, Dumont #3 und #5 Zangen) mit 70 % Ethanol und Platz neben Dissektion Mikroskop in der Kapuze.</li>
</ol>(2) Ratte oder Maus Gehirn Dissektion
Hinweis: Beide Mäuse und Ratten eingesetzt werden. Tiere, die älter als P8 kann auch verwendet werden (wir testeten bis P12), aber die Hirnhaut entfernen wird zunehmend schwieriger geworden. Darüber hinaus werden sich die Zellausbeute und Gesundheit abnehmen, da Gehirnzellen von älteren Tieren gebildet haben, komplizierte Prozesse und Verbindungen, die im Gewebe Dissoziation, führt zu erhöhte Zelltod brechen können. Kortikale Vorbereitungen werden hier beschrieben, aber andere Hirnregionen können auch verwendet werden.
<ol><li>Legen Sie 0,05 % Trypsin-EDTA in einem 37 ° C Wasserbad.</li>
	<li>Einschläfern von Tieren (trächtigen Ratten für E19 Welpen oder P0-P8 Tiere) durch langsames anheben CO2 -Konzentration und die Gehirne zu isolieren. Die folgenden Schritte erfordern sterilen Technik.</li>
	<li>
Arbeiten mit embryonalem Gewebe entfernen Sie zunächst die Embryonen aus der Gebärmutter und die embryonalen Säcke zu öffnen, dann sofort die Köpfe mit einer Schere abgeschnitten. Wenn alle Köpfe abgeschnitten sind, in vorgekühlte Dissektion Medium übertragen.
	<ol>
<li>Sobald die Köpfe in das Medium eingetaucht sind, öffnen Sie die Haut und Schädel (beide sind sehr weich bei Jungtieren) mit Zange und Prise aus dem Kleinhirn. Hebeln Sie vorsichtig den Rest des Gehirns, und aus dem Schädel. Hinweis: Zwei bis vier E19 Embryonen liefern genügend Gewebe für mindestens acht 10 cm Gerichte der kortikalen Astrozyten, die am Tag der Dissektion auf 500.000 Zellen pro Schale vergoldet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für Neugeborene oder älteren Welpen die Köpfe mit einer Schere abgeschnitten und die Gehirne von medial schneiden Sie die Haut in einer geraden Linie von der Rückseite des Kopfes bis zur Spitze der Nase zu isolieren. Ziehen Sie die Haut beiseite und sorgfältig geschnitten, der Schädel links und rechts und heben der Schädel Knochen. Das Kleinhirn abgeschnitten, und den Rest des Gehirns aus dem Schädel heraus hebeln. Hinweis: Zwei bis drei P0-P8 Welpen liefern genügend Gewebe für mindestens acht 10 cm Gerichte der kortikalen Astrozyten, die am Tag der Dissektion auf 500.000 Zellen pro Schale vergoldet.</li>
	<li>Die zugrunde liegende Struktur des Zwischenhirns trennen Sie Kortex. Legen Sie die Zange innerhalb der längs-Riss zwischen den Hemisphären, fahren Sie die Zange zwischen Kortex und Mittelhirn Strukturen der südlichen Hemisphäre (senkrecht zur längs-Riss) jede Hemisphäre frei zu klemmen.</li>
	<li>Mit der Pinzette, entfernen Sie alle Hirnhaut aus jeder Hemisphäre (und den Hippocampus), dann trennen Sie die Hippocampi. Wenn hippocampale Astrozyten erforderlich sind, verschieben Sie jedes Hippocampus in eine 15 mL-Tube mit 14 mL Dissektion Medium auf Eis gefüllt.</li>
	<li>Entfernen Sie weitere Bereiche von jeder Hemisphäre Kortex, wenn bestimmte Regionen erforderlich (z.B.frontalen Kortex) sind. Schneiden Sie alle kortikalen Gewebe verwendet werden, für die Erzeugung von Astrozyten in Stücke, die nicht größer als 1 mm3. Sammeln Sie alle Stücke von kortikalen Gewebe in einer separaten 15-mL-Tube mit Dissektion Medium auf Eis gefüllt.</li>
</ol>(3) Gewebe Verdauung und Dissoziation
<ol><li>Sobald alle Gewebe Stücke gesammelt sind, warten Sie, bis sie an der Unterseite des Rohres zu Regeln, dann aspirieren Sie soviel Mittel wie möglich.</li>
	<li>Fügen Sie 2-3 mL 0,05 % Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette, und inkubieren Sie die Rohre im Wasserbad 37 ° C für 20 min. Hinweis: Lassen Sie alle Trypsin-EDTA aus der Pipette rasch zu mischen die Gewebe-Stücke und lassen Sie sich wieder.</li>
	<li>Aspirieren Sie sorgfältig die Trypsin-EDTA, so dass Gewebe Stücke in als wenig Flüssigkeit wie möglich, am unteren Ende der Röhre.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL Medium vorgekühlt Dissektion der verbleibenden Trypsin-EDTA abwaschen. Pipette auf die Seite des oberen Teils des Rohres zu erreichen der Gewebe Stücke mischen.</li>
	<li>Aspirieren der Dissektion Medium, und Gewebe Stücke in als wenig Flüssigkeit wie möglich zu verlassen. Wiederholen Sie diese Waschschritt mit vorgekühlten Dissektion Medium noch zweimal.</li>
	<li>Fügen Sie nach dem letzten Waschschritt 1 mL DMEM + (auf Zimmertemperatur erwärmt) mit 1.000 µL Pipettenspitze und das Gewebe durch Pipettieren genannte oben und unten ohne Luftblasen einzuführen. Hinweis: Es ist wichtig, zu vermeiden, Herstellung von Bläschen, da dies, den pH-Wert der Lösung ändern kann, auf die Astrozyten sehr empfindlich sind.</li>
	<li>Ein 100 µm Zelle Sieb in der Eröffnung einen 50-mL-Tube und Vornässen des Filters mit 4,5 mL vorgekühlte DMEM +.</li>
	<li>Pipette 1 mL der dissoziierten Gewebe Suspension auf die Zelle Sieb und fügen Sie eine weitere 4,5 mL vorgekühlt DMEM + die Zellen durch die Zelle Sieb zu waschen.</li>
</ol>(4) Zelle Überzug für Astrozyten Bereicherung durch Passagierung
<ol><li>Zählen Sie die Zellen, z. B.durch Verdünnen 10 µL Zellsuspension mit 10 µL Trypan blau und Pipettieren der Mischung auf eine Hemocytometer.</li>
	<li>Platte 500.000 Zellen in 12 mL DMEM + pro 10 cm Schale. Hinweis: DMEM + ist nützlich für astrocytic Wachstum, mehr noch als für Neuronen oder Mikroglia. Beim Schütteln sind die körperlichen Kräfte auf Glasdeckgläser im Brunnen viel stärker als die in der 10-cm-Gerichte (ohne Deckgläsern) handeln. Wenn Zellen auf 24-Well Platten erschüttert sind, sie zu ungesunden oder sterben. Nur Platte Astrozyten auf 24-Well-Platten nach dem schütteln.</li>
	<li>Halten Sie Zellkulturen im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für sieben Tage.</li>
	<li>Am 6. Tag bereiten Sie am Vortag schütteln und Passagierung Zellen, die Kultur PEI-beschichteten Platten wie in Schritt 5 beschrieben.</li>
</ol>5. Passagierung Zellen
<ol><li>
Am Vortag Passagierung, Mantel Zellplatten Kultur mit 0,04 % PEI.
	<ol>
<li>Verwenden Sie für Immunocytochemistry, virale Transduktion oder Plasmid Transfektion 24 wohlen oder 6-Well-Platten (jeweils eine sterilisierte 12 mm oder 25 mm Glas Deckglas, beziehungsweise).</li>
		<li>Sterilisieren Sie der Glasdeckgläser durch Inkubation in 70 % igem Ethanol für mindestens 1 h, dann waschen Sie dreimal in destilliertem, entionisiertem Wasser vor dem Einlegen der Deckgläsern in den Brunnen zu.</li>
		<li>Fügen Sie mindestens 70 µL 0,04 % PEI pro 12 mm Deckglas in 24-Well-Platten und 600 µL 0,04 % PEI pro 25 mm Deckglas in 6-Well Platten.</li>
		<li>Für Western-Blot oder RNA-Seq-Analyse können die 10 cm Gerichte bereits enthalten die Zellen nach der Dissektion weiterhin verwendet werden. Gerichte müssen nur geschüttelt werden, dann die Zellen sind mit 1 X PBS gewaschen und mit NB + H behandelt (nicht auf neue Gerichte übertragen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am Tag in Vitro (DIV) 7 nach der Präparation die 10-cm-Gerichte mit Zellen in DMEM + auf einem Labor-Shaker im Inkubator und schütteln Sie die Gerichte bei 110 u/min für 6 h.</li>
	<li>Das PEI aus beschichteten Deckgläsern mit destilliertem, entionisiertem Wasser zweimal abwaschen. Die Platten (500 µL pro Bohrloch für 24-Well-Platten und 2 mL pro Bohrloch für 6-Well Platten) NB + H Medium hinzufügen. Pre-equilibrate die Platten im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 während die 10 cm Teller Zittern oder für mindestens 30 Minuten.</li>
	<li>20-30 Minuten vor dem Ende des 6 h schütteln, Vorwärmen 1 X PBS, DMEM + NB + H und 0,25 % Trypsin-EDTA auf 37 ° C im Wasserbad.</li>
	<li>Nach 6 h schütteln, den Shaker Kultur Gerichte ausziehen und sofort ersetzen das Medium (das erschüttert aus Nervenzellen und Oligodendrozyten Mikroglia enthält) mit 10 mL vorgewärmt 1 X PBS pro Schale. Hinweis: Es ist wichtig, sofort das alte Medium freistehende Zellen zur Vermeidung von nicht-astrocytic Zellen wieder anbringen Aspirieren.</li>
	<li>Entfernen der PBS und 3 mL vorgewärmten Trypsin-EDTA pro Schale. Inkubieren Sie jedes Gericht für 4 min. im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Hinweis: Wenn Vorbereitung von Proben für Western-Blot oder RNA-Seq fügen Sie keine Trypsin-EDTA. Stattdessen vorgewärmt ersetzen die PBS mit 12 mL NB + H, nach denen Kulturen wieder in den Inkubator platziert werden können.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL vorgewärmten DMEM + bis 3 mL Trypsin-EDTA in jedem Gericht, die Zellen von der Schüssel mit einer serologischen Pipette 5 mL pipette und sammeln die Zellsuspension in ein 50 mL-Tube. Hinweis: Pipette direkt aus dem Boden der Schale - sollte der Boden der Schale deutlicher als die Zellen lösen. Verwenden Sie nur Serum-haltigen Medium (anstelle von DMEM +), da Serum Trypsin inaktiviert.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 3.220 x g bei 20 ° C für 4 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL vorgewärmt NB + H.</li>
</ol>6. Zelle Überzug für endgültige Astrozyten Kulturen
<ol><li>Zählen der Zellen.</li>
	<li>Platte, 20.000 Zellen pro Bohrloch in 6-Well-Platten (in 2 mL NB + H Medium pro Well) oder 5.000 pro Bohrloch in 24-Well-Platten (in 500 µL NB + H Medium pro Well).</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellkulturen im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 bis Weiterbehandlung oder Analyse.</li>
	<li>Tauschen Sie halbe Medium einmal pro Woche. Hinweis: In nährstoffarme Umgebungen, Astrozyten stoppen wuchern aber alle restlichen Mikroglia wird sich vermehren (obwohl nach unserer Erfahrung keine Mikroglia in AWESAM Kulturen erschienen). Austausch von halbe Medium einmal wöchentlich Bereicherung jeder potenziell verbleibenden Mikroglia-8 verhindert, und die Monokulturen für mindestens drei Wochen gesund bleiben.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Vier Schritte innerhalb des Protokolls sind von entscheidender Bedeutung: 1) Vorbereitung der HBEGF-Konzentration auf genau 5 ng/mL, da kleine Erhöhungen der Konzentration zu unreif Kulturen, z. B.führen können 10 ng/mL HBEGF de differenzieren Astrozyten4; (2) Vermeidung von Luftblasen in den Lösungen, die Gewebe oder Zellen, die den pH-Wert verändern und behindern Astrozyten Gesundheit enthalten; (3) Pre-ausgleichende Medien, der optimale pH-Wert und Temperatur für den Anbau von ge...

Astrozyten beeinflussen die Funktion des Gehirns durch trophischen Unterstützung, Durchblutung, synaptische Signalisierung und Plastizität und interzelluläre Kommunikation - sind die Mechanismen, die drehen sich um die dünnen astrocytic Prozesse. Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ermöglicht das Studium dieser Prozesse ohne Einmischung von Neuronen und anderen Gliazellen, die nützlich z.B.ist, weil der Ausdruck vieler Proteine und sogar Ca2 + Signalisierung über verschiedene Gehirnzelle überlappen Typen. Weiter, diese Methode überwindet Grenzen der bisher verfügbaren Techniken. Unser Protokoll sieht insbesondere in Vivo-wie Morphologie (stellate Astrozyten mit dünnen Prozesse) und Genexpression in eine schnelle, einfache und billige Weise.
Zellmorphologie, Genexpression und viele andere regulatorische Prozesse sind direkt durch die Umgebung beeinflusst. In der Kulturschale bezieht sich auf Faktoren von umgebenden Zellen, sondern auch das Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, veröffentlicht. Astrozyten HBEGF wurde zuvor berichtet, dass ein Ganglion Morphologie1 induzieren sondern wurde auch festgestellt, dass um Astrozyten2de-zu unterscheiden. Niedrigere Konzentrationen von HBEGF dienten jedoch später zur Erzeugung von mehr in-Vivo-wie Astrozyten über RNA Sequenzierung in zwei verschiedene Protokolle3,4identifiziert. Darüber hinaus ändert sich Astrozyten Morphologie mit mittlerer Zusammensetzung, unabhängig von dem Protokoll Nr.4: Neurobasal Medium mit einer niedrigen Konzentration von HBEGF ist optimal für den Anbau von Ganglion Astrozyten, während andere mittlere Kompositionen (z.B. Serum-haltigen DMEM) produzieren polygonale Zellen (auch in Astrozyten frisch durch Immunopanning isoliert).
Das AWESAM-Protokoll überwindet Nachteile der bisherigen Techniken für den Anbau von Astrozyten Monokulturen4. Bisherige Techniken für den Anbau von Monokulturen Astrozyten haben folgende Nachteile: polygonale Morphologie, die untypisch für Ganglion Astrozyten in Vivo (MD-Methode)5; die Länge und die Kosten des Protokolls (Vorbereitung Astrozyten von induzierten pluripotenten Stammzellen dauert drei Monate und erfordert viele Reagenzien, einschließlich teuer Wachstumsfaktoren)6; die geringen Mengen an Material (Immunopanning Methode)3; und die de-Differenzierung der Astrozyten und Anforderung einer 3D Matrix (Puschmann Et Al) 1 , 2. im Gegensatz dazu bietet das AWESAM-Protokoll: in Vivo-wie Morphologie (stellate Astrozyten mit dünnen Prozesse); eine schnelle, einfache und billige Methode; große Mengen an Material; und die in-Vivo-wie Genexpression im Vergleich mit Immunopanned und MD Astrozyten. Darüber hinaus kann 2D Kultur für die Untersuchung von Ca2 + Signal- und recycling in dünnen Prozesse und Ereignisse in der Nähe der Membran Vesikel (z.B.TIRF-Mikroskopie ist nicht möglich in 3D Kulturen).
Die MD-Methode wurde seit seiner Veröffentlichung im Jahr 19805, bietet eine einfache und schnelle Technik für polygonale Astrozyten Monokulturen ausgiebig verwendet. Kurz gesagt, die MD-Methode bringt wachsenden gemischten Gehirnzellen in fetalen Kälberserum (FCS)-mit DMEM, gefolgt von schütteln Schritte, die für Astrozyten (wie alle anderen Arten von der Schale lösen Gehirnzelle) bereichern und weiter im gleichen Medium Kultur. DMEM ergänzt mit FCS dient vielen anderen Zelltypen, Fibroblasten und Adipozyten bis hin zu verschiedenen Krebszelllinien, die teilen die polygonale Morphologie von MD Astrozyten in Kultur ausgestellt. Bis zu den frühen 2000er Jahren7, war wenig Gedanken gewesen Medien zugeschnitten auf Astrozyten gegeben, insbesondere zugunsten ihrer typischen stellate Morphologie in Vivogefunden. Ein Protokoll veröffentlicht im Jahr 2011 wird solche stellate Morphologie erreicht: die Immunopanning-Methode aufgerufen, es beschäftigt serumfreien Medium für die Kultivierung von Astrozyten3optimiert. Mit dieser Methode sind frisch isolierte Gehirnzellen ausgesetzt eine Reihe von Gerichten beschichtet mit Antikörpern, die auf Zelle typspezifische Zelle Oberflächenproteine für Astrozyten zu bereichern. Trotz mehr in-Vivo-wie Morphologie und Ausdruck Profil Immunopanned Astrozyten, die Mehrheit der in-vitro- Studien noch auf die MD Astrozyten Methode verlassen. Die MD-Methode ist einfach und schnell, während die Immunopanning-Methode komplexe und zeitaufwendige Schritte am ersten Tag der Kultur umfasst (z. B. Enzym Verdauung längere, sorgfältige Schichtung der Lösungen von unterschiedlicher Dichte, Immunopanning, und Zentrifugation Schritten - alles vor der Beschichtung). Die AWESAM-Methode bietet jedoch mithilfe von spezielleren Medium sowohl die Geschwindigkeit der MD-Methode und die in-Vivo-wie Morphologie des Immunopanning-Protokolls.
Insgesamt das AWESAM-Protokoll eignet sich für ein Studium mehr in Vivo-wie Astrozyten in 2D Monokulturen von Neuronen und anderen Glia (wie bisher charakterisierten4 von Immunostainings, Immunoblots und RNA Sequenzierung) isoliert. Es ermöglicht die Untersuchung von dünnen astrocytic Prozessen und bietet guten Zugang zur Visualisierung von spontanen Ca2 + Signalisierung und Veranstaltungen in der Nähe der Membran (z.B.durch TIRF-Mikroskopie abgebildet).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

Die AWESAM (ein low- eAsy sTellate einStrocyte methode Kosten) Protokoll beinhaltet einen schnelle, einfachen und kostengünstigen Weg, um große Mengen von in-Vivo-wie Maus und Ratte Astrozyten Monokulturen : Die Gehirnzellen können aus verschiedenen Gehirnregionen isoliert werden, und nach einer Woche der Zellkultur sind nicht astrocytic Zellen indem die Kultur Gerichte auf einem Boston-Shaker für 6 h im Inkubator abgeschüttelt. Die restlichen Astrozyten sind dann in neue Platten mit einem Astrozyten-spezifischen Medium (NB + H bezeichnet) passagiert. NB + H enthält geringe Konzentrationen des Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor (HBEGF), die anstelle von Serum in Medium verwendet wird. Nach einem Wachstum in NB + H, haben AWESAM Astrozyten ein Ganglion Morphologie und Funktion feinen Prozesse. Darüber hinaus haben diese Astrozyten mehr in-Vivo-wie gen-Expression als Astrozyten von zuvor veröffentlichten Methoden generiert. Ca2 + Bildgebung, Vesikel Dynamik und andere Veranstaltungen in der Nähe der Membran können somit in der feinen astrocytic Prozesse in Vitro, z. B.mit live Zelle konfokale oder TIRF-Mikroskopie untersucht werden. AWESAM Astrozyten zeigen vor allem auch spontan Ca2 + Signalisierung Astrozyten in Vivoähnlich.

Astrozyten, die gemeinsam mit Neuronen kultiviert und angebaut in NB + Medium erscheinen Ganglion nach 2 Wochen der Kultur (Abbildung 2). Neben NB + Medium sind Co kultivierten Astrozyten auch unbekannte Neuron-abgeleitete Faktoren ausgesetzt, die wahrscheinlich um ihr Überleben und Ihre Morphologie beitragen. Im Gegensatz dazu erscheinen MD Astrozyten in DMEM + als Monokulturen angebaut (nach anderen Zelltypen vor Passage abschütteln) polygonalen nach 2 Wo...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ist optimal für die Kultivierung von murinen Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen in eine schnelle, einfache und kostengünstige Weise. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + -Signalisierung, Morphologie und gen Expressionsprofile Astrozyten in Vivoähnlich.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

8.3K Aufrufe.  University of Oxford. Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ist optimal für die Kultivierung von murinen Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen in eine schnelle, einfache und kostengünstige Weise. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + -Signalisierung, Morphologie und gen Expressionsprofile Astrozyten in Vivoähnlich.

Serie: Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

An Emerging Target Paradigm to Evoke Fast Visuomotor Responses on Human Upper Limb Muscles

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, and size are processed and integrated within numerous brain areas, then ultimately relayed to the motor periphery. In some instances, a reaction is needed as fast as possible. These fast visuomotor transformations, and their underlying neurological substrates, are poorly understood in humans as they have lacked a reliable biomarker. Stimulus-locked responses (SLRs) are short latency (&#60;100 ms) bursts of electromyographic (EMG) activity representing the first wave of muscle recruitment influenced by visual stimulus presentation. SLRs provide a quantifiable output of rapid visuomotor transformations, but SLRs have not been consistently observed in all subjects in past studies. Here we describe a new, behavioral paradigm featuring the sudden emergence of a moving target below an obstacle that consistently evokes robust SLRs. Human participants generated visually guided reaches toward or away from the emerging target using a robotic manipulandum while surface electrodes recorded EMG activity from the pectoralis major muscle. In comparison to previous studies that investigated SLRs using static stimuli, the SLRs evoked with this emerging target paradigm were larger, evolved earlier, and were present in all participants. Reach reaction times (RTs) were also expedited in the emerging target paradigm. This paradigm affords numerous opportunities for modification that could permit systematic study of the impact of various sensory, cognitive, and motor manipulations on fast visuomotor responses. Overall, our results demonstrate that an emerging target paradigm is capable of consistently and robustly evoking activity within a fast visuomotor system.

Presented here is a behavioral paradigm that elicits robust fast visuomotor responses on human upper limb muscles during visually guided reaches.

Ein aufstrebendes Zielparadigma, um schnelle Visuomotor-Antworten auf menschliche Oberkörpermuskeln zu evozieren

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

In-vitro-Modellierung für neurologische Erkrankungen mit direkter Konvertierung von Fibroblasten in neuronale Progenitorzellen und Differenzierung in Astrozyten

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

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