This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. Vorbereitung von Fly Kulturen, Lösungen und Embryo Handhabung Devices <ol><li> Bereiten Sie einen Käfig Kultur von Drosophila. Zeigen 500 + Paarung fliegt von den gewünschten Stamm in einer Population Käfig mit einem 10 cm Trauben-Agar-Platte und einen Ort der Hefe-Paste ausgestattet. Pflegen Kultur in einem 25 ° C Luftfeuchtigkeit gesteuert Inkubator. Hinweis: &#160; Cage Kulturen erfordern ein oder zwei Tage, um konsistente Anlage Embryo Verlegemuster zu erhalten. Grape Platten mit Hefe-Paste werden, einmal morgens und einmal abends während Anlage geändert. </li><li> Bereiten EPS. Warmen Lösungen von Tensiden (Cocamide DEA und ethoxylierter Alkohol) bei 37 ° C. Pipette 18 ml d-Limonen mit einem Szintillations-Glasampulle, die mit einem kleinen Rührstab ausgestattet. Pipette jeder der beiden Tenside (5% Endkonzentration jedes) 1 ml zu der d-Limonen. Gründlich mischen und entfernen Rührstab. HINWEIS: Diese Stammlösung von EPS ist gut für ca. 2 Monate bei Raumtemperatur. Die Lösungsollte bei 37 ° C erwärmt und geschüttelt, um vollständig zu solubilisieren Tenside vor Gebrauch. EPS-und d-Limonen ist in einem Glasbehälter aufbewahrt, da sie einige Kunststoffe mit der Zeit zu lösen. </li><li> Bereiten Embryo dechorionation Lösung, Inkubation Medien-, Farbstoff-und Arzneimittellösungen. Mischen Sie 25 ml Bleichmittel mit 25 ml H 2 O und in flache Schale. Bereiten modifizierten Grund Inkubationsmedium (MBIM) und MBIM-T nach dem Stand der Rezeptur 1,12. Bereiten Shields und Sang M3 Zellkulturmedium und PBS nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialliste). Bereiten Stammlösung von Permeabilisierung Farbstoff bei 10 mM Konzentration in DMSO. </li><li> Montieren Embryo-Handling-Geräte und Zubehör: <ol><li> Bereiten dechorionation und EPS Behandlung Korb (siehe Abbildung 1A). Schneiden Sie ein 3 cm Abschnitt einer Wegwerf 50 ml Polypropylen-Zentrifugen / Kulturröhrchen mit einer Feinsäge. Machen Sie den Schweißfläche bündig durch Reiben der Rohrabschnitt auf Sandpapier eingehaltenauf eine Tischfläche. Schweißnaht der Rohrabschnitt um Nitex Nylonnetz durch Schmelzen des Randes der Rohrabschnitt über einer Flamme und Drücken auf das Netz auf einer Glasplatte. Abkühlen lassen und schneiden Sie zusätzliche Mesh. HINWEIS: Die schiere Seiten und der Unterseite ermöglichen eine schnelle und vollständige Abspülen von Restbleichmittel und EPS in den jeweiligen Schritten. Die Schweißschritte sollten unter einem Abzug durchgeführt werden. </li><li> Bereiten Sie eine Entwicklung Korb. Abgeschnittenen oberen Teil einer 50-ml-Zentrifugen / Kulturrohr bündig mit dem Rand der Kappe. Entfernen und ändern Sie die Kappe durch Ausschneiden eines zentralen Öffnung und Kerben am Rand wie in 1B gezeigt. Schrauben Sie die Kappe über dem Netz und auf das Gewinde der abgeschnittenen Rohrabschnitt und trimmen zusätzliche Mesh. HINWEIS: Die Kappe enthält Aussparungen in der Felge, die Diffusion zu ermöglichen, der Groß Medium, wenn in der 60 mm Reservoir Gericht (Abbildung 1B) positioniert. </li><li> Bereiten Komponenten eines Schieberraum. Schneiden Sie ein Quadrat von DO-Membran, die größer ist alsder Schieber Kammeröffnung. Tragen Sie eine sehr dünne Schicht Vakuumfett an der Innenseite Lippe der Öffnung. Befestigen Sie die DO Membran in die Öffnung gegen die Dichtfett mit dem Haltering. Schneiden Sie überschüssige DO Membran, indem sie wieder in der Nähe der Haltering. HINWEIS:. Spezifikationen für die Folie Kammer kann in Kiehart et al 13 zu finden Diese Kammer ist nicht im Handel erhältlich und erfordert kundenspezifische Herstellung von einer Werkstatt. </li></ol></li></ol> 2. Staging, Dechorionation und EPS Behandlung von Embryonen <ol><li> Staging Embryonen durch zeitgesteuerte Sammlung. Stellen Sie eine frische Traube / Hefe Platte zur Fliege Kultur Käfig in der Uhr. Embryonen ermöglichen, für 1 h bei 25 ° C festgelegt werden Entsorgen Sie diesen Platte und ersetzen mit einer frischen Traube / Hefe Platte für eine spätere Embryo Verlegung von 2 h bei 25 ° C Sammeln Sie diese Platte und in 18 ° C-Inkubator für die weitere Entwicklungs Inszenierung. ANMERKUNG: 1 h Entwicklung bei 25 ° C gleich 2 h Entwicklungbei 18 ° C. Die Wirkung der Alterung bei 18 ° C gegenüber 25 ° C auf die Aufrechterhaltung EPS Permeabilisierung im späten Stadium Embryonen können in Fig. 2 gesehen werden. </li><li> Dechorionation. Embryonen vorsichtig abspülen Traubenplatte in Gitterkorb mit 25 ° C Leitungswasser und einem Pinsel. Spülen Sie überschüssige Hefe weg von den Embryonen in den Korb unter einem leichten Strom von Leitungswasser. Tauchen Sie den Korb in 50% Bleichmittel für 2 min. Embryonen gründlich unter fließendem Leitungswasser waschen. HINWEIS: spritzen vorsichtig Bleichmittel-Lösung auf der Embryonen intermittierend mit einer Plastikpipette. Während 2 Minuten ist in der Regel für die komplette dechorionation ausreichend, sollte dieser Inkubationszeit durch direkte Untersuchung überprüft und entsprechend angepasst werden. Pflegen dechorionated Embryonen in den Korb in Leitungswasser getaucht und gehen sofort in die EPS Schritt. </li><li> EPS-Behandlung <ol><li> Bereiten Sie sechs 60 mm-Platten mit ca. 10 ml PBS in jedem. Bereiten EPS Verdünnung durch Auflösen von 75 ul EPS in 2.925 ml MBIM (1.40) in einem 50 ml Becherglas mit Verwirbelung. Hinweis: Eine weiße Emulsion bildet aus dieser Mischung. </li><li> Überschüssiges Wasser aus dem Boden der Siebtrommel mit einem Labor zu wischen. Tauchen Warenkorb in verdünnter EPS im Becher und sofort wirbeln Embryonen in der EPS-Lösung in der Boden des Korbes zu verteilen. Weiter Wirbelbewegung für 30 Sekunden. HINWEIS: EPS Verdünnungen und Belichtungszeiten können variiert werden, um Durchlässigkeit zu steuern. Es wird empfohlen, dass eine optimale EPS Verdünnungen und Behandlungszeiten empirisch mit den Stämmen von Fliegen verwendet festgelegt werden. Steigende Belichtungszeit auf 60-90 sec ist günstig für Stufe 12 und älter Embryonen. </li><li> Entfernen Korb, tupfen Sie das überschüssige EPS mit einem Labor zu wischen. Fahren Sie mit sechs aufeinanderfolgenden Waschungen in 10 ml PBS in den 60-mm-Schalen. Mit einem Kunststoff-Pipette vorsichtig spritzen Embryonen mit PBS in jede der sechs Wäschen. Gehen Sie zu färben und Drogenbehandlungsschritte. Hinweis: EPS kann in den Ausguss entsorgt werden. </li></ol></li></ol>3. Dye and Drug Behandlung von permeabilisierten Embryonen <ol><li> Dye-Behandlung <ol><li> Mit 5 &amp;mgr; l 10 mM CY5 Carbonsäurefarbstoff * 1 ml MBIM-T (50 &amp;mgr; M Endkonzentration) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Wirbel zu mischen. HINWEIS: * Wahl der Farbstoff abhängig von Folgeanalyse. CY5 Carbonsäure ist für spätere Analysen mit Fixierung und Immunfärbung. Rhodamin B ist hilfreich für die Analyse von lebenden Embryonen. Die rote Emission von Rhodamin B und der grüne Emission seiner Metaboliten 1 kann einige Komplikationen mit Downstream-Anwendungen unter Verwendung von Fluoreszenz zu präsentieren. Medikament oder Toxin kann zu der Farbstofflösung zugegeben werden, um die Behandlung zu diesem Zeitpunkt zu initiieren, oder Arzneimittel / Toxin-Behandlung auf einen Puls an dieser Stelle zu begrenzen. Es sollte nach MSDS-und Umweltsicherheitsstandards genommen zur Handhabung und Entsorgung von Medikamenten und Giftstoffe werden. </li><li> Übertragen Embryonen aus dem Gitterkorb auf die Farbstofflösung mit einem Pinsel. Das Röhrchen und invertieren wiederholt, um sicherzustellen, dass dieEmbryonen frei schweben in Suspension in der Farbstofflösung. Das Röhrchen auf einem Taumel Wippe für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Röhrchen aus Nutator und lassen Embryonen zu begleichen. Entfernen Farbstofflösung mit einer feinen Pipette und ersetzen mit 1 ml MBIM-T zu waschen. Kehren Rohr wieder auszusetzen Embryonen vollständig. Lassen Embryonen zu regeln, und wiederholen Sie mit drei weiteren MBIM-T Wäschen. Entfernen Sie alle MBIM-T von Schlussspülung und zur Inkubation Schritt. </li></ol></li><li> Inkubation für Embryo-Entwicklung <ol><li> Transfer-Embryonen mit einer von zwei Kammern: Die Entwicklung Korb oder die Schiebekammer. HINWEIS: Die Entwicklung Korb für längere Entwicklungszeiten bevorzugt, und ist erforderlich, wenn nachfolgende Fixierung und Immunfärbung Schritte auszuführen sind. Die Schieberraum ist optimal für die höhere Auflösung Zeitraffer-Bildgebung und ist am effektivsten für kurze Entwicklungszeiten (zB den frühen embryonalen Ereignisse). Medikament oder Toxin kann zu dem Medium bei verschiedenen Konzentrationen und Embryo d angefügtntwicklung können in Echtzeit mit Live-Embryonen oder an einem Endpunkt mit Standard-Fixierung und Immunfärbung Protokolle überwacht werden. </li><li> Entwicklung in Körbe <ol><li> Reinigen Sie eine Entwicklungs Korb durch Spritzen mit 70% Ethanol gründlich mit entionisiertem Wasser und trocken tupfen mit Labor zu wischen. Bereiten 6 ml Inkubationsmedium mit der gewünschten Konzentration des Wirkstoffs oder Toxin. Legen Sie die Entwicklung Korb in Medium in 60-mm-Schale kümmert nicht Falle Luftblasen unter dem Mesh-Basis. HINWEIS: Zwei Medien werden üblicherweise verwendet: MBIM allein oder MBIM/M3 in einer 50:50-Mischung, wobei letztere für längere Entwicklungszeiten effektiver. </li><li> Übertragen permeabilisiert Embryonen Oberfläche in der Basis der Korb mit einem Pinsel Netz. Sanft spritzen die Embryonen mit Medien aus dem umgebenden Reservoir. Dispergieren der Embryonen mit dem Pinsel, so dass sie in einer Monoschicht auf dem Gitter sind. Hinweis: Fahren Sie mit Mikroskopie und Permeabilisierung und Lebensfähigkeit Eigenschaften des pr bewerteneparation (siehe Schritt 4). </li></ol></li><li> Entwicklung in der Chamber Slide <ol><li> Invertieren Schieberkammer und eine kleine Wulst Vakuumfett auf dem Umfang der Öffnung. Platzieren 150 &amp;mgr; l Medium mit der gewünschten Menge des Arzneimittels oder Toxins an der Oberfläche der DO Membran innerhalb der Öffnung. HINWEIS: Zwei Medien werden üblicherweise verwendet: MBIM allein oder MBIM/M3 in einer 50:50-Mischung, wobei letztere für längere Entwicklungszeiten effektiver. </li><li> Übertragen permeabilisiert Embryonen in die Drop-Medien mit einem Pinsel. Dispersions die Embryonen so dass sie auf der Membran innerhalb des Tropfens zu begleichen. </li><li> Eine kreisförmige Deckglas 25 mm über der Öffnung, wodurch das Medium Abflachung vorsichtig anzuwenden. Andrücken entlang des Umfangs des Deckglases, um eine Dichtung mit dem Fett bilden. Hinweis: Fahren Sie mit Mikroskopie zu Permeabilisierung und Lebensfähigkeit Eigenschaften der Zubereitung zu bewerten (siehe Schritt 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identifizierung von permeabilisierten Lebensfähige Embryonen <ol><li> Identifizieren permeabilisiert Embryonen. Embryonen beobachten unter Epifluoreszenz mit einem Mikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet. Erwerben Sie Bilder aus mehreren Feldern mit festen Mikroskop-und Kameraeinstellungen (im blauen Wellenlängen, um das Profil Eigelb Autofluoreszenz zu bestimmen). </li><li> Bestimmen Sie Permeabilisierung von Embryonen auf der relativen Fluoreszenzintensität. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einem großen Arbeitsabstand, um den Korb unterzubringen und Manipulationen der Embryonen zu erlauben. Das Mikroskop ist mit einem programmierbaren XYZ-Bühne, Epifluoreszenz-Beleuchtung und einer Digitalkamera ausgestattet sein. Bild die Embryonen dabei darauf achten, Belichtung und Bühnenpositionsparameter jeder Embryo Bild aufzunehmen, um eine erneute Bewertung der gleichen Embryonen zu einem späteren Zeitpunkt zu ermöglichen (siehe repräsentatives Ergebnis in Abbildung 3). Hinweis: Muster der Farbstoffaufnahme in Abhängigkeit von dem verwendeten Farbstoff, der Expositionsdauer und Embryoalter variieren. Eine breite Paletteder Farbstoffaufnahme in einem einzigen Präparat ist typisch und spiegelt die Variation in dem Grad der Permeabilisierung. </li><li> Identifizieren lebensfähige Embryonen. Nach der Markierung permeabilisiert Position Embryonen weiter mit Embryoentwicklung bei Raumtemperatur oder 25 ° C. Zurück Korb oder Schieberraum zu Mikroskop. Beachten unter blauem Kanal-Fluoreszenz-und Bild Eigelb Autofluoreszenz in permeabilisierten zuvor identifizierten Embryonen zu erwerben. Bewerten Lebensfähigkeit nach den üblichen Fortschreiten der Dotterverteilung (siehe Rand et al. 1 und repräsentatives Ergebnis in Abbildung 3). Hinweis: Andere morphologische Merkmale der mit Hellfeldmikroskopie beobachtet Embryo kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit zu bewerten. Es wird empfohlen, dass die Festlegung der Durchlässigkeit, die mit Lebensfähigkeit kompatibel ist empirisch mit jedem Farbstoff und Belastung von Flug verwendet wird, bestimmt werden. </li><li> Bewerten Droge oder Gift Effekte in permeabilisierten lebensfähige Embryonen. </li><li> Embryonen Verfahmit dem obigen Protokoll sind für eine Reihe von herkömmlichen bereit ssed analysiert anschließend an Medikament oder Toxin-Exposition. Einige der verschiedenen Arten von Analysen werden in der Diskussion unten betrachtet und umfassen die direkte Beobachtung der Morphogenese in Live-Embryonen als auch nach der Fixierung Immunfärbung analysiert. Beide Ansätze werden durch die Verwendung von Vitalfarbstoffen (z. B. GFP), das Gen-Expressionsmuster und die Zelllinie und Morphologie Profile zeigen verbesserte. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das oben beschriebene Verfahren beschreibt ein Mittel, um den Erhalt lebensfähiger Drosophila-Embryonen, die zugänglich zu kleines Molekül Behandlungen in einem breiten Entwicklungsbereich sind. Diese Methode stellt die neue und einfache Feststellung, dass das Altern Embryonen bei 18 ° C ermöglicht Permeabilisierung der späten Phase Embryonen mit der gleichen Wirksamkeit wie zuvor nur in frühen Embryonen gesehen. Darüber hinaus hat die Verwendung von fernen Rot Cy5 Carbonsäure als Indikator wirksamen Permeabilität in Postfix-Anwendungen bewährt und nicht mit herkömmlichen roten und grünen fluoreszierenden Markern, die verwendet werden können, um Entwicklungs Phänotypen zeigen stören. Diese Ergebnisse, die Wirksamkeit und der Nutzen der EPS-Verfahren erheblich voranbringen. Diese Methode ist offen für Analysen der beiden Wohn-und Fest Embryo Zubereitungen. Mit Hellfeldmikroskopie und der Schieberraum einzurichten, der typischen Merkmale, um in der ersten Hälfte der Embryonalentwicklung Tor erzielen, sind morphogenetische Bewegungen wieZellularisierung des Blastoderm, Kopffurchenbildung, germband Dehnung und germband Rückzug ein. Mit GFP oder RFP Reportern spezifischer Endpunkte erkannt werden kann, z. B. frühen Segmentierung Muster und die Bildung von Nervenstrukturen in der späteren Entwicklung ein. GFP und RFP Berichte ermöglichen auch die Beobachtung von Entwicklungs Ereignisse in lebenden Embryonen permeabilisiert sowohl in der Schieberraum und Entwicklungs Warenkorb Zubereitungen. Eine einfache Methode zum Brutto Toxizität eines angelegten Drogen-oder Chemie zu bestimmen, ist das Muster der Dotterprotein Auto-Fluoreszenz im blauen Kanal zu überwachen, um eine Verzögerung oder Einstellung der Entwicklung 1 zu bestimmen. Die EPS-Methodik hat auch großes Potenzial für die Erweiterung der Ermittlungsinstrumente für Nicht-Modell Insekten, insbesondere Mücken, die eine ähnliche Architektur der Eierschale teilt. Anwendung von kleinen Molekülen, um Embryonen von anderen Insektenarten eröffnen würde eine Allee von investigatiauf denen Standard genetische Ansätze, um funktionelle Studien sind derzeit fehlt. Embryonen in Körben entwickelt für Formaldehydfixierung verarbeitet werden, deshalb eröffnen Analysen an die Vielzahl von Reagenzien für die Immunfärbung Drosophila Studien zur Verfügung. Dieser Schritt erfordert jedoch, dass ein Post-Update Bestimmung Permeabilisierung machbar Phänotypen mit Embryonen, auf den der Drogen gemacht worden korrelieren. Die Anwendung der CY5 Carbonsäure Farbstoff sehr effektiv für diesen Ansatz bewährt. CY5 Carbonsäure effizient in permeabilisierten Embryonen (3A) aufgenommen. Während der Entwicklung Cy5 im Eigelb, die letztlich in dem Lumen des Darms zu bildenden Stufe 14 abgesondert wird und später (3B) eingeengt. Nach der Fixierung wird Cy5-Fluoreszenz deutlich verringert, dennoch zuverlässig nachweisbar im Darm und dient als Marker dieser Embryonen, die effektiv die eingangs permeabilisiert wurden (siehe repräsentative result Abbildung 4). Es sei darauf hingewiesen, dass CY5 Erfassungs in dieser Phase mehr Kamerapositionen (z. B. 1-4 Sekunden), für den Nachweis erfordert werden. Somit kann Scoring von Phänotypen mit Immunfärbung Muster fortzufahren mit Cy5-Signal ähnlich permeabilisiert Embryonen mit gewebespezifischen Marker (zB neural-spezifischen Antikörpern in Fig. 4 zu sehen) zusammen bestätigen. Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren ist die Empfindlichkeit der Embryo Lebensfähigkeit der Permeabilisierung Prozess, etwas, das lange geplagt hat frühere Versuche, diese Methode zu entwickeln, 9,10,16. Die Lebensfähigkeit Anschluss an Permeabilisierung krass ist altersabhängig und steigt dramatisch die ältere der Embryo nach Permeabilisierung 9. Doch wie wir bereits gezeigt haben, wird Durchlässigkeit immer schwieriger mit dem Alter ein. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigt nun die Möglichkeit, spät Embryonen (Stufe 14) durch Re-Aufrufen hep permeabilisierenPentan als Lösungsmittel in Verbindung mit d-Limonen 17. Die breite Anwendbarkeit dieser letztere Methode ist nicht klar, wie nur ein Medikament Wirkung wurde dadurch (Nocodazol) und Anwendung auf früher Embryonen wurde nicht beschrieben 17. Weiterhin ist die Anwendung der 18 ° C-Entwicklungsschritt über Ausbeuten spät Permeabilität skizziert und vermeidet ferner die Verwendung von toxischen organischen Lösungsmittel. Die Ermittler, die neu in der EPS-Protokoll wird Variabilität in Permeabilisierung und Lebensfähigkeit Ergebnisse auf erste Versuche zu erleben. Die hier beschriebenen Schritte geben die Ermittler die Werkzeuge, um systematisch Bedingungen Permeabilisierung Behandlungen und anschließender Inkubation Schritte variieren, um Bedingungen für spezifische Stämme von Drosophila sie in ihrem eigenen Labor Arbeitseinstellung zu optimieren. Eine weitere Herausforderung bei dem Verfahren ist die Variabilität der chemischen Aufnahme von Embryos Embryos gesehen. Diese Variabilität in der Heterogenität der reflektiertenCY5 Farbstoffaufnahme sofort nach der Farbstoffbehandlung (3A) in Embryonen gesehen. Im Gegensatz dazu ist Rhodamin B-Farbstoff schneller und gleichmäßiger als Cy5-Farbstoff (2B &quot;) für die embryonale Gewebe dispergiert. Somit können einige Embryo zu Embryo Variabilität der Verteilung der chemischen Eigenschaften, Arzneimittel oder Toxin von Interesse beherbergt und ist inhärent Verfahrens. Wo die Quantifizierung der Dosis kritisch ist, ist es empfehlenswert, dass die Aufnahme des Arzneimittels oder Toxins von Interesse wird durch eine alternative analytische Verfahren charakterisiert. Dennoch ist die Leichtigkeit der obigen Protokoll und die Fähigkeit sind, hunderte von Embryonen erlaubt die Ermittler, um die Dosis-Antworten auswerten und Ergebnis charakteristische Phänotypen mit wenig Investition von Ressourcen, sorgt für einen kräftigen erste Ansatz zur Charakterisierung Medikamente oder Giftstoffe in diesem hoch entwickelten Modellsystem.

Die Drosophila-Embryo weiterhin ein erstklassiges Modell für die Untersuchung grundlegender Mechanismen der Entwicklung 2 sein. Dieses leistungsstarke Modell wird durch eine breite Palette von molekulargenetischen Werkzeugen, die Manipulationen der wesentlichen jedem Gen zu jedem Zeitpunkt und in jeder sich entwickelnden Organ erlauben unterstützt. Die geringe Größe, die schnelle Entwicklung und umfangreiche Charakterisierung der Morphogenese des Drosophila-Embryos machen es zu einem Modell der Wahl für genetische Bildschirme, von denen viele grundlegende Entwicklungswege aufgedeckt 3,4. Zahlreiche Phänotypen in Drosophila-Embryos wurden aus und sind leicht zu interpretieren, die oft ein Mittel, um die molekularen genetischen Mechanismen, die eine abnorme Merkmal verantwortlich zu identifizieren. Historisch gesehen, ein Mangel des Fliegenembryo Modell war die Schwierigkeit der Einführung kleine Moleküle zu embryonalen Geweben. 1) uns: Dieses Hindernis hat Beschränkungen gestelltten bekannten bioaktiven kleinen Molekülen als Sonden zur Entwicklungsmechanismen zu verhören und 2) mit diesem etablierten Modell teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized beurteilen. Als Folge hat das Screening Potential des Fliegenembryo in Charakterisierung von Kleinmolekül-Aktivität nicht ausgelastet ist. 1) Permeabilisierung der Eierschale und 2) Mikroinjektion: Abgabe kleiner Moleküle Fliegenembryo kann mit zwei Methoden erreicht werden. Dieser Artikel stellt Fortschritte der Methode der Permeabilisierung, die einfach in der Einstellung eines herkömmlichen Drosophila Labor auszuführen sind. Es sei darauf hingewiesen, dass die jüngsten Fortschritte in der Mikroinjektionsverfahren mit Mikrofluidik-Technologie trägt auch auf Verfahren zum Einführen von Verbindungen in den Embryo 5,6 ist. Einführen von Molekülen in den Embryo durch eine Wachsschicht von der Eierschale 7 verhindert. Die Drosophila Eierschale besteht aus fünf Schichten. Ausdie von innen nach außen sind sie: die Dotterhaut, die wachsartige Schicht, die innere Chorion-Schicht, der endochorion und die exochorion 8. Die drei Außen Chorion-Schichten können durch kurze Auftauchen des Embryos in verdünnter Bleichmittel entfernt werden, so wird ein Schritt, um so dechorionation. Die freiliegende Wachsschicht kann dann durch Exposition gegenüber organischen Lösungsmitteln, wie Heptan und Octan 7,9, wodurch die dechorionated Embryo lässigen beeinträchtigt werden, während es noch in der zugrunde liegenden Dottermembran umhüllt. , Verwendung dieser Lösungsmittel führt jedoch Komplikationen aufgrund ihrer Toxizität und der Schwierigkeit bei der Regulierung ihrer starken permeabilisierend Aktion, die beide stark negativen Effekte auf den Embryo Lebensfähigkeit 9,10. Ein Verfahren zur Permeabilisierung unter Verwendung einer Zusammensetzung bezeichnet Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS) wurde bereits beschrieben 1 gewesen. Diese Lösungsmittel aus d-Limonen und von Pflanzen abgeleitete Tenside, die Lösungsmittel ermöglichen miscibl seine mit wässrigen Puffern. Die niedrige Toxizität von d-Limonen und die Fähigkeit des Lösungsmittels auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen ist eine wirksame Methode zur lässigen Embryonen mit hoher Lebensfähigkeit 1 erzeugen ergab. Jedoch sind zwei endogene Faktoren weiterhin Beschränkungen hinsichtlich der Anwendung zu bringen. Zunächst Embryonen zeigen Heterogenität der Durchlässigkeit nach EPS-Behandlung, auch wenn darauf geachtet wird, schließen Entwicklungs Inszenierung halten. Zweitens Embryonen älter als etwa acht Stunden haben schwer zu permeabilisieren, im Einklang mit einer Verhärtung der Eierschale, die nach der Eiablage 11 tritt bewährt. Hier beschrieben werden, sind Fortschritte in der EPS-Verfahren, dass: 1) bei der Identifizierung und Analyse von nahezu identisch permeabilisiert Embryonen, auch nach Fixierung und Immunfärbung Schritte ausgeführt worden sind und 2) zu ermöglichen Permeabilisierung der Embryonen im späten Entwicklungszeitpunkten (&gt; 8 h, Bühne 12 und älter). Insbesondere Anwendung eines dunkelroten Farbstoff,CY5 Carbonsäure, beschrieben, die als Durchlässigkeit Anzeige, die während der Entwicklung und nach Formaldehydfixierung im Embryo weiterhin dient. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Aufzucht Embryonen bei 18 ° C hält die Eierschale in eine EPS-sensitiven Zustand, so dass Permeabilisierung der späten Phase Embryonen (Stufen 12-16). Diese Fortschritte zu überwinden, die zuvor erwähnten Einschränkungen für die EPS-Methodik. Diese Anwendung wird daher stellen die Ermittler mit einem Mittel, um kleine Moleküle von Interesse für den Embryo in unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten einführen und gleichzeitig Rentabilität.

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	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

Die Drosophila-Embryo ist seit langem ein leistungsfähiges Labormodell für die Aufklärung der molekularen und genetischen Mechanismen, welche die Entwicklung steuern. Die Einfachheit der genetischen Manipulationen mit diesem Modell pharmakologische Ansätze, die in anderen Tiermodellen und Tests auf Zellbasis alltäglich sind verdrängt. Hier beschreiben wir die jüngsten Fortschritte in einem Protokoll, Anwendung von kleinen Molekülen ermöglicht, den Entwicklungsfruchtfliegenembryo. Das Verfahren vor, um die Details Dichtigkeit der Eierschale zu überwinden und gleichzeitig Embryo Lebensfähigkeit. Eierschale Permeabilisierung in einem breiten Spektrum von Entwicklungsstufen wird durch Anwendung eines zuvor beschriebenen d-Limonen Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS 1) und durch Alterung Embryonen bei reduzierter Temperatur (18 ° C) vor der Behandlung erreicht. Darüber hinaus ist die Verwendung eines fernen Rot-Farbstoff (CY5) als Permeabilisierung Indikator beschrieben, die mit stromabwärts Verwendung von handelsüblichen roten und grünen Grippe kompatibel istorescent Farbstoffe in lebenden und fixierten Präparaten. Dieses Protokoll ist auf Studien mit bioaktiven Verbindungen zu Entwicklungsmechanismen für ein Studium an der Bewertung teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized richtet Sonde als auch.

Embryo Handhabungsvorrichtungen sind in Fig. 1 dargestellt, um bei der Visualisierung der &quot;home-made&quot;-Geräte für die Manipulation in den obigen Protokollen unterstützen. Ergebnisse in Abbildung 2 zu sehen veranschaulichen die Wirkung der robuste Aufzucht Embryonen bei 18 ° C auf ihrer Fähigkeit, durch EPS in späten Stadien der Entwicklung durchlässig gemacht werden. Dieser Zustand wird im Schritt 2.1 Protokoll angewendet. Wirksamkeit des CY5 Carbonsäurefarbstoff, um die verschiedenen Niveaus der Durchlässigkeit typischerweise im EPS behandelten Embryonen gesehen zeigen, ist in Fig. 3 zu sehen. Die Entwicklungsdynamik des Farbstoffverteilung im Eigelb ist auch in Fig. 3 zu sehen ist, offenbart ein Kriterium verwendet werden, um die Lebensfähigkeit zu bewerten , wie im Protokoll beschriebenen Schritt 4.2. Die Nützlichkeit von Cy5-Farbstoff bei der Bestimmung Embryo Permeabilisierung anschließend an Toxin Behandlung Formaldehydfixierung und Immunfärbung wird durch das Ergebnis in Fig. 4 dargestellt. Abbildung 1. Embryo Handhabungsgeräte für die EPS-Methode. Die flachen Korb in dechorination verwendet und EPS-Belichtungsstufen (A, A &#39;). Die Entwicklung Korb ist für längere Entwicklungskredite von permeabilisierten Embryo (B, B &#39;) eingesetzt. Der Schiebekammer für kürzere Entwicklungsengagements und eine höhere Auflösung Bildgebung von lebenden Embryonen verwendet (C, C &#39;. Siehe Text für weitere Beschreibung). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig2highres.jpg" /> 2. Auswirkungen der Alterung bei 18 º C auf EPS Wirksamkeit im späten Stadium Embryonen. Embryonen wurden für zwei Stunden, gefolgt von Alterung bei 18 ° C für 20 h (Panels AA &quot;gesammelt, <sTrong&gt; BB &quot;) oder bei 25 ° C für 10 h (Steuerung CC&quot;). Embryonen bei 18 ° C wurden dann dechorionated und in zwei Proben geteilt. Die erste Probe wurde direkt mit 1 mM Farbstoff Rhodamin B in MBIM-T für 5 min behandelt, gewaschen und im Hellfeld und blauen und roten Fluoreszenzkanäle (Das Bedienfeld AA &quot;) sichtbar gemacht. Die zweite Probe wurde mit EPS (1:10 in MBIM für 1 min) behandelt, gewaschen und dann mit 1 mM Rhodamin B behandelt und für 5 min vor der Anzeige (Steuerung BB &quot;) gewaschen. Embryonen bei 25 ° C angehoben wurden dechorionated und direkt mit EPS (1:10 in MBIM für 1 min) behandelt, gewaschen und dann mit 1 mM Rhodamin B für 5 min vor der Anzeige (Steuerung CC &quot;) behandelt. Die Embryonen wurden bestimmt, um auf Stufe 14 durch die Falten im Darm von Eigelb Autofluoreszenz im Blaukanal (Panel A &#39;, B&#39;, C &#39;) enthüllt werden. Embryonen bei 18 ° C erhöht undurchlässig sind vor EPS treatment, wie die Abwesenheit von Rhodamin B-Aufnahme (Panel A &quot;) zu sehen. EPS-Behandlung von 18 ° C Embryonen führt zu einem hohen Grad der Durchlässigkeit von Rhodamin B Aufnahme (Feld B &quot;) zu sehen. Embryonen bei 25 ° C erhöht undurchlässig bleiben auch bei EPS Behandlung unter Ausschluss von Rhodamin B (Feld C &quot;) gesehen. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig3highres.jpg" /> 3. Einbau von Cy5 durchlässig und in lebensfähiger Embryonen. Die Embryonen wurden bei 25 ° C für 2 Stunden gealtert und für 14 h bei 18 ° C (entspricht 7-9 h Embryonen bei 25 ° C, Stufe 12) gesammelt. Nach dechorination, EPS-Behandlung wurde (für 1 min 1:40 MBIM) gemacht, gefolgt von Inkubation in CY5 Farbstoff (50 uM in MBIM-T für 15 min). Embryonen wurden dreimal in MBIM-T gewaschen und die Entwicklung Korb mit MBIM im Behälter überführt. Die Entwicklung wurde auf p erlaubtfür 8 h bei Raumtemperatur roceed. Die Aufnahme von CY5 (Rot) wird im Fern roten Kanal unmittelbar nach Farbstoff Behandlung und Waschen (Teil A) und nach 8 h Entwicklung (Feld B) abgebildet. Verteilung des Eigelbs durch Autofluoreszenz in dem blauen Kanal zu sehen. Farbstoffaufnahme, damit Durchlässigkeit, ist zu sehen, unterscheiden sich von Embryos Embryos. Cy5-Farbstoff (rot) zu sehen ist, um den Dotter (blau), die eingeengt, um das Lumen des Darms an der Stufe 16 (lila, Tafel B) wird zu lokalisieren. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Bestimmung der Permeabilisierung und Methyl Effekte in fest-und immun Embryonen. Embryonen wurden bei 25 ° C für 2 Stunden gealtert und für 14 h bei 18 ° C (entspricht 7-9 h Embryonen bei 25 ° C, Stufe 12) gesammelt. Nach dechorination wurde EPS-Behandlung (1 min 1:40 MBIM) gemacht, gefolgt von der Inkubation inCY5 Farbstoff (50 uM in MBIM-T für 15 min) zusammen mit Methylquecksilber (50 uM MeHg, Feld B) oder Lösungsmittelkontrolle DMSO (0,1% Endkonzentration, Teil A). Embryonen wurden mit MBIM-T gewaschen und in einer Entwicklungs Korb mit MBIM gelegt: M3-Medium in dem Reservoir und gealtert für zusätzliche 8 h bei Raumtemperatur. Embryonen wurden dann in einem Zwei-Phasen 4% Paraformaldehyd-Heptan Herstellung von einem Standardprotokoll 14 befestigt. Die Färbung wurde mit Anti-Fasciclin II (grün in A, B und weiß in A &#39;, B&#39;) durchgeführt, um motorischen Neuronen und Anti-elav Antikörper (rot in A, B), um alle Neuronenzellkörper Label Label. CY5 Farbstoff wird durch direkte Fluoreszenz, die verlängerte Exposition durch verminderte Fluoreszenzintensität durch Fixierung (CY5 ist pseudo-blau gefärbt in allen Panels) erfordert enthüllt. Die Auswirkungen von MeHg in unregelmäßigen Mustern und cluste gesehenRing der Seiten chordotonal Neuron Zellkörper (Elav-positiv, in rot markiert und mit weißen Pfeile in B gegenüber A bezeichnet). Darüber hinaus ist eine charakteristische Verzweigung der Segment (SN) (durchgezogene grüne Pfeile in A &#39;) gesehen sehr variabel mit MeHg Exposition (grün Pfeile in B &quot;) im Einklang mit den zuvor berichteten Effekte von MeHg auf den Embryo 15 zu sein. Projektion der intersegmentalen und segmentalen Nerven an ihren Wurzeln sind zu sehen, hinten mit MeHg Exposition (offene grüne Pfeil in B &#39;) verschoben werden. Hinweis: Methylquecksilber ist ein starkes Nervengift. Es ist darauf zu Handschuhen und Augenschutz, wenn zu tragen. Die Entsorgung sollte durch eine institutionelle Umweltsicherheit und Service-Einrichtung durchgeführt werden.

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A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Einführung von kleinen Molekülen in die Entwicklungs Drosophila-Embryo bietet ein großes Potenzial für die Charakterisierung der biologischen Aktivität der neuen Verbindungen, Drogen und Giftstoffe sowie für die Sondierung grundlegenden Entwicklungspfade. Hier beschriebenen Verfahren skizzieren Schritte, die natürlichen Barrieren zu diesem Ansatz zu überwinden, erweitern den Nutzen der Drosophila-Embryo-Modell.

Ein Verfahren zur Permeabilisierung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen für Tests von Small Molecule Aktivität

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.4K Aufrufe.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  Einführung von kleinen Molekülen in die Entwicklungs Drosophila-Embryo bietet ein großes Potenzial für die Charakterisierung der biologischen Aktivität der neuen Verbindungen, Drogen und Giftstoffe sowie für die Sondierung grundlegenden Entwicklungspfade. Hier beschriebenen Verfahren skizzieren Schritte, die natürlichen Barrieren zu diesem Ansatz zu überwinden, erweitern den Nutzen der Drosophila-Embryo-Modell. 

Serie: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Forschung

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Zwei Arten von Assays zum Nachweis von Frog Sperm Chemotaxis

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...