Wir danken Homaira Nawabi, Frederic Moret und Isabelle Sanyas für ihre Hilfe. Diese Arbeit wird unterstützt von CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA bis V.C.; C.D-B und A.J werden von einem La Ligue contre le cancer bzw. Labex DevWeCan Stipendien unterstützt.

1. Cloning-Strategie zur Tag PlexinA1-Rezeptor mit pHluorin
<ol><li>Wählen Sie einen geeigneten Expressionsvektor als Rückgrat(z.B. der MausrezeptorplexinA1-Expressionsvektor, ein Freundliches Geschenk von Dr. Andreas Puschel11). Hinweis: Dieser PlexinA1-Vektor wurde entwickelt, um eine effiziente HA- oder VSV-markierte Rezeptor-Einfügung in die Plasmamembran zu erreichen.</li>
	<li>Amplify per PCR die ekliptische pHluorin-Codierungssequenz mit dem entsprechenden Plasmid als Vorlage(z.B. pHluorin-getaggter GABA-A-Rezeptor, ein Art Geschenk von Dr. Jacob2). Fügen Sie bei Bedarf eine Restriktionsstelle am 5' Ende des Primers hinzu, um den Klonschritt im Backbone zu erleichtern.</li>
	<li>Fügen Sie die pHluorin-Sequenz im Rahmen zwischen dem Signalpeptid und der Rezeptorcodierungssequenz mithilfe von Restriktionsstellen ein(z. B. NruI/Kpn2I-Restriktionsstellen, wie in Abbildung 1Bbeschrieben). Hinweis: Da das Signalpeptid, das die richtige Ausrichtung der Rezeptoren sicherstellt, gespaltet ist, sollte das pHluorin danach platziert werden. Dies rechtfertigt die Erkennung des Signalpeptids und verhindert eine Spaltung des pHluorins vom Rezeptor des Interesses.</li>
	<li>Sequenzieren Sie die erhaltenen Konstrukte, um sicherzustellen, dass keine Mutation durch PCR eingeführt wurde.</li>
</ol>2. Charakterisierung von pHluorin-getaggten Rezeptoren in vitro in COS7-Zellen
Die Fähigkeit des Fusionsproteins, die Plasmamembran zu erreichen, und sein reversibler Fluoreszenzverlust, wenn der pH-Wert gesenkt wird, können mit dem folgenden Verfahren bestätigt werden.
<ol><li>Tag 1. Platte 1,5 x 105 COS7-Zellen in einer glasunteren 35-mm-Schale in 2 ml komplettem Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM - 10% Fetal Bovine Serum - 1 mM Natriumpyruvat - 25 U/ml Penicillin/Stretomycin - 2,5 g/ml Amphotericin B - pH 7.4).</li>
	<li>Tag 2. Transfektien Zellen: Hinweis: Zellen sollten 70-80% konfluent sein.<ol>
<li>Bereiten Sie 200 l NaCl 150 mM vor und fügen Sie 3 g DNA, d.h. den vektorkodierenden pHluorin-getaggten Rezeptor hinzu. Sanft wirbeln und kurz nach unten drehen. Anmerkung: Eine Karte des in diesen Experimenten verwendeten pHluorin-plexinA1-Vektors ist in Abbildung 1Bdargestellt.</li>
		<li>Fügen Sie 10 l Transfektionsreagenz (oder die entsprechende Menge des verwendeten Reagenzes) hinzu. Wirbel sofort.</li>
		<li>10 min bei RT inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie den Zellen 200 l des Transfektionsreagenz/DNA-Mix hinzu.</li>
		<li>Bewegen Sie die Platte sanft, um eine Neuaufteilung der Mischung zu erreichen, und legen Sie die Zellen wieder auf den 37 °C-Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag 3. Entfernen Sie das Transfektionsmedium und ersetzen Sie es durch 2 ml frisches komplettes DMEM.</li>
	<li>Tag 4. Durchführung einer Live-Zell-Bildgebung von COS7 pHluorin-plexinA1 transfizierten Zellen:<ol>
<li>Bereiten Sie zwei Aliquots des DMEM-Gesamtmediums vor und stellen Sie den pH-Wert auf 3,5 bzw. 9,5 ein. Hinweis: Für eine 35-mm-Platte werden 1,5 ml jeder Lösung benötigt, um das Experiment durchzuführen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Zellmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml DMEM-Gesamtmedium pH 7.4.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 5 ml Spritze mit einem geeigneten Schlauchtyp vor, um verschiedene Komponenten direkt in das Zellkulturmedium zu injizieren, ohne die Mikroskopkammer zu öffnen.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Modul, das die Wartung einer 37 °C, 5%CO2 feuchten Arbeitsatmosphäre ermöglicht. Anmerkung: Ein alternativer Ansatz für die Verwendung einerCO2-Kammer ist die Verwendung von HEPES-gepufferten Medien (in der Regel im Bereich von 10-25 mM je nach Zelltyp).</li>
		<li>Legen Sie die Zellen in die Kammer und stellen Sie den Schlauch und die Spritze ein. Hinweis: Das Mikroskop sollte ausgeglichen werden, bevor es beginnt, mechanische Drift während der Aufnahme zu vermeiden.</li>
		<li>Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie das multidimensionale Erfassungsprogramm aus.</li>
		<li>Finden Sie transfizierte COS7-Zellen mit dem 40X-Objektiv und markieren Sie die Position in der Software für jede von ihnen.</li>
		<li>Konfigurieren Sie den Z-Stack so, dass eine Tiefenerfassung von 15 m erreicht wird (der Fokus kann sich beim Hinzufügen von Medien in der Platte ändern).</li>
		<li>Einrichten der Belichtung für den GFP-Filter und die Phase.</li>
		<li>Konfigurieren Sie das Erfassungstiming. Hinweis: Für das gesamte Experiment mit 5 Interessensgebieten sollte der Erwerb alle 20 Sek. für 10 min ausreichen.</li>
		<li>Starten Sie die Erfassung und nehmen Sie 5 Steuerbilder in DMEM pH 7.4 medium.</li>
		<li>Pause-Erfassung, injizieren 1,25 ml pH 3,5 komplette DMEM, um einen pH-Wert von 5,5 im Kulturmedium zu erreichen, markieren Ereignis in der Software und Wiederaufnahme der Erfassung für 5 weitere Zeitpunkte. Hinweis: Grüne Fluoreszenz sollte nach und nach verschwinden.</li>
		<li>Pause-Erfassung, injizieren 1,2 ml pH 9,5 komplette DMEM, um einen pH 7,4 im Kulturmedium zu erreichen, markieren Ereignis in der Software und Wiederaufnahme der Erfassung für 5 weitere Zeitpunkte. Hinweis: Grüne Fluoreszenz sollte an der Plasmamembran wieder auftauchen.</li>
		<li>Analysieren Sie Bilder. Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder, die mit einem solchen Protokoll mit dem pHluorin-plexinA1-Konstrukt erhalten wurden.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. In ovo Elektroporation von pHluorin-plexinA1 Konstrukt
<ol><li>Umgang mit Eiern vor der Elektroporation:<ol>
<li>Befruchtete Eier bis eine Woche vor der Inkubation bei 14 °C im Kühlschrank aufbewahren.</li>
		<li>Inkubieren Sie Eier bei 38,5 °C (101,3 °F) in einem Inkubator mit gesättigter Luftfeuchtigkeit für 50-52 stunden, bis die Embryonen das Stadium HH1412erreichen. Hinweis: Die Eier müssen während der Inkubation horizontal platziert werden, damit der Embryo für die Elektroporation richtig positioniert ist und auf der Oberseite des Dotters schwebt. DAS HH14-Stadium eignet sich zur Expression der Plasmide in differenzierten Neuronen im Rückenmark und im Dorsalwurzelganglimit mit einer angemessenen Überlebensrate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroporate Embryonen8-10:<ol>
<li>Vorbereiten der Elektroporation:<ol>
<li>Bereiten Sie endotoxinfreie DNA-Plasmide mit einer Konzentration von mehr als 2 g/l vor, um sie als gewünschte Konzentration verdünnen zu können.</li>
			<li>Ziehen Sie genügend Glaskapillaren, um die verschiedenen DNA-Lösungen zu injizieren.</li>
			<li>Bereiten Sie steriles PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml Penicillin/Streptomycin und Gleichgewicht bei 38,5 °C vor.</li>
			<li>Sterilisieren Sie die Kapuze, gekrümmte Schere und feine Zange.</li>
			<li>Steuern Sie den Elektrodenabstand. Hinweis: Es wird in der Regel ein Abstand von 4 mm zwischen den Elektroden verwendet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fenster das Ei13 (Abbildung 3A):<ol>
<li>Verwenden Sie eine gekrümmte Schere, um die Schale auf der stumpfen Seite des Eis zu durchbohren.</li>
			<li>2 ml Albumen mit einer 0,9 mm x 25 mm Nadel und einer 5 ml Spritze entfernen. Richten Sie die Nadel vertikal aus, um eine Beschädigung des Eigelbsacks zu vermeiden.</li>
			<li>Bedecken Sie die Oberseite des Eis mit Klebeband, um die Integrität der Schale zu erhalten.</li>
			<li>Mit einer gekrümmten Schere die Schale in der Mitte des Bandes durchstechen, um den Druck auszugleichen, wenn 2 ml Albumen aus dem Ei entfernt werden. Schneiden Sie dann ein Fenster, das groß genug ist, um den Embryo zu visualisieren und daran arbeiten zu können.</li>
			<li>Fügen Sie 2 ml sterile warme PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml Penicillin/Streptomycin hinzu, um eine Austrocknung des Embryos zu vermeiden und ihn dem Manipulator zugänglicher zu machen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>DNA injizieren und den Embryo elektropoatieren<ol>
<li>Verdünnung des Plasmids in PBS (-Ca2+; -Mg2+)auf eine Konzentration zwischen 0,5-2 g/l und schnelle grüne Farbstoffe hinzufügen, um eine endgültige 0,025% Konzentration zu erreichen. Laden Sie den DNA-Mix in eine Kapillare. Die Verwendung eines Injektors wird empfohlen. Anmerkung: Überprüfen Sie, ob die Kapillarresistenz weder zu groß (d. h. es könnte Schwierigkeiten bei der Injektion von Embryonen geben) noch zu klein ist (d. h., die Kapillare könnte zu groß sein und den Embryo beschädigen). Auch die Konzentration von Nukleinsäuren von mehr als 2 g/l kann unspezifische Wirkungen verursachen und muss kontrolliert werden.</li>
			<li>Punktieren Sie den Eigelbsack und das Neuralrohr an der kaudalen Seite mit der geladenen Kapillare. Betreten Sie das Neuralrohr mit einem flachen Winkel und füllen Sie das Lumen vom Schwanz bis zum Kopf mit dem DNA-Mix (Abbildung 3B). Hinweis: Schnelles Grün ermöglicht die Steuerung der Genauigkeit der Injektion.</li>
			<li>Stellen Sie die 4 mm Platinelektroden schnell auf beiden Seiten des Neuralrohrs auf die Ebene, die Sie elektroporatieren möchten, und wenden Sie 3 Impulse bei 31 V für 50 msec mit 500 msec Intervallen auf (Abbildung 3C). Hinweis: Vermeiden Sie es, die Elektroden auf das Herz oder auf große extra embryonale Gefäße zu legen, um eine Beschädigung des sich entwickelnden Embryos zu vermeiden. Blasen sollten sich auf den Elektroden bilden.</li>
			<li>Mit der Nadel, entfernen Sie 2 ml Albumen, um den Pegel in der Schale zu verringern.</li>
			<li>Versiegeln Sie das Fenster und die stumpfe Seite hermetisch mit Klebeband.</li>
			<li>Legen Sie die Eier wieder bei 38,5 °C in den Brutkasten, bis sie das gewünschte Stadium erreichen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Einbetten und Kryosektionen von Embryonen
<ol><li>48 Stunden nach Elektroporation, sorgfältig elektorierte Embryonen (HH24-Stadium) ernten. Schneiden Sie das Band und die Hälfte der Chorioallantoidmembran. Um zu verhindern, dass Embryonen im Eigelb versinken, positionieren Sie einen Kolander unter dem Embryo und schneiden Sie die zweite Hälfte der Chorioallantoidmembran.</li>
	<li>Übertragen Sie den Embryo in eine Mitesektionsschale gefüllte Mit eiskaltem PBS.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Elektroporationseffizienz, indem Sie mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop nach Fluoreszenz im Neuralrohr suchen. Hinweis : Die Koelektroporation eines Kontrollplasmids, das für das RFP kodiert, kann helfen, den elektroporated Bereich zu visualisieren.</li>
	<li>Sezieren Sie Embryonen mit einem Mikroskalpell, um den elektropoierten Bereich des Rückenmarks auszuwählen.</li>
	<li>Sezierte Embryonen auf eine 24-Well-Platte übertragen und in pH 7,4 4% Paraformaldehyd (PFA) - Phosphatpuffer-Saline (PBS), O/N bei 4 °C fixieren. Hinweis: Der Fixationsschritt ist entscheidend, um die Stabilisierung von pHluorin in seiner "lebenden" Konformation zu ermöglichen und somit pHluorin in festem/permeabilisiertem Gewebe verwenden zu können. Obwohl die Fixierung die pH-abhängige Fluoreszenzveränderung drastisch verlangsamt, muss berücksichtigt werden, dass Konformations-/Protonationsänderungen auch nach der Fixierung auftreten können. Daher muss das folgende Protokoll (Einbettung, Kryosektionen und Beobachtung) innerhalb von 3 Tagen nach dem Fixierungsschritt mit allen Puffern bei pH 7 durchgeführt werden. Wenn keine Fixierung erforderlich ist, wird die Durchführung von Beobachtungen an LebendenGewebeabschnitten empfohlen.</li>
	<li>4% PFA entfernen und Embryonen in pH 7,4 PBS waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Embryonen in PBS-15% Saccharose und halten Sie bei 4 °C, bis die Embryonen sinken.</li>
	<li>Inkubieren Sie feste Embryonen in pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose für 45 min bei 37 °C, so dass Embryonen vollständig eingebettet sind.</li>
	<li>Einbettformen auf Eis legen und 400 l pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose hinzufügen, um eine solide 2 mm Basis zu erreichen.</li>
	<li>Den eingebetteten Embryo mit einer geschnittenen Spitze ansaugen und den Embryo auf die feste Gelatinebasis legen.</li>
	<li>Abdeckung mit pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose und positionieren Sie den Embryo mit Zangen, bevor die Gelatine erstarrt.</li>
	<li>Sobald die Gelatine fest ist, bereiten Sie ein -40 °C Isopropanolbad (trockenes Eis oder flüssigen Stickstoff verwenden) und frieren Sie den Gelatineblock für 5 min ein.</li>
	<li>Halten Sie die gefrorenen Blöcke bei -80 °C.</li>
	<li>Legen Sie den gefrorenen Block 1 Std. auf -20 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie die Form und fixieren Sie den Block auf einem Futter mit einem Polyethylenglykolmedium.</li>
	<li>Sobald der Block fest befestigt ist, legen Sie das Futter in das Kryostatsystem. Hinweis: Verwenden Sie beschichtete Dias, um Gewebeverluste während der Färbung zu vermeiden.</li>
	<li>Führen Sie serielle Kryosektionen durch (in der Regel werden 20 m Kryosektionen durchgeführt).</li>
	<li>Lassen Sie die Kryosektionen 15 min bei RT trocknen. Hinweis: Kryosektionen sollten vor unnötiger Lichtexposition geschützt werden, um eine Bleichenung der GFP-Fluoreszenz zu vermeiden.</li>
</ol>5. Mikroskopische Analyse von Kryosektionen
<ol><li>Rehydrat-Kryosections in pH 7,4 PBS bei RT für 10 min. Hinweis: Bei Bedarf können Kerne mit Hoechst befleckt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 0,5-mm/ml-Hoechst-Lösung in PBS und inkubieren Sie Kryosektionen für 15 min.</li>
	<li>Spülen Sie die Dias 3x mit pH 7,4 PBS für 5 min.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Schiebemontage fort. Eine pH 7,4 (oder mehr grundlegende) Polyvinyl-Alkohol-Montagelösung, die O/N aushärtet, kann verwendet werden: Positionieren Sie den Deckelrutsch sorgfältig, um die Bildung von Luftblasen zwischen dem Schlitten und dem Deckelschlupf zu vermeiden.</li>
	<li>Lassen Sie das Montagemedium O/N bei 4 °C im Dunkeln aushärten.</li>
	<li>Verwenden Sie ein invertiertes konfokales Mikroskop, um das pHluorin-plexinA1-Fusionsprotein präzise zu visualisieren: Führen Sie z-stack bei optimaler Loch- und optischer Auflösung durch und verwenden Sie eine 20X (NA 0.75) oder 40X (NA 1.3) Linse. Hinweis: pHluorin ist mit den gleichen Parametern nachweisbar, die zur Detektion von GFP verwendet werden(d. h. Emissionsspitzen bei 509 nm). Die Einstellungen für Wellenlängenanregungs- und Detektionsfilter werden durch die Bildverarbeitungssoftware optimal definiert. Hoechst wird zwischen 425-460 nm (Erregung ist bei 405 nm), GFP oder pHluorin zwischen 485-545 nm (Erregung liegt bei 473 nm) und RFP zwischen 575-675 nm (Erregung liegt bei 559 nm) nachgewiesen.</li>
</ol>Repräsentative Bilder von pHluorin-plexinA1 und eGFP-Expression im Küken-Embryo-Rückenmark sind in Abbildung 4dargestellt.

<ol>
	<li>Winckler, B., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+guidance+receptors.">Trafficking guidance receptors.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li><li>Nawabi, H., Castellani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+commissures+in+the+central+nervous+system:+how+to+cross+the+midline.">Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).</li><li>Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comm+function+in+commissural+axon+guidance:+cell-autonomous+sorting+of+Robo+in+vivo.">Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).</li><li>Nawabi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+midline+switch+of+receptor+processing+regulates+commissural+axon+guidance+in+vertebrates.">A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates.</a> Genes Dev. 24, 396-410 (2010).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapto-pHluorins:+genetically+encoded+reporters+of+synaptic+transmission.">Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).</li><li>Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+axonal+pathways+of+genetically+defined+groups+of+neurons+in+the+chick+neural+tube+utilizing+in+ovo+electroporation.">Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation.</a> J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), (2007).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+of+miRNA-based+plasmids+in+the+developing+neural+tube+and+assessment+of+phenotypes+by+DiI+injection+in+open-book+preparations.">In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li><li>Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin/neuropilin+complexes+mediate+repulsion+by+the+axonal+guidance+signal+semaphorin+3A.">Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A.</a> Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J. Vis. Exp. (8), (2007).</li><li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+actin+control+polarized+expression+of+TI-VAMP+vesicles+to+neuronal+growth+cones+and+their+fusion+with+the+plasma+membrane.">Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li><li>Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+endosomes:+how+many+varieties+and+why.">Evolving endosomes: how many varieties and why.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+clathrin-mediated+endocytosis+drives+repulsive+growth+cone+guidance.">Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance.</a> Neuron. 66, 370-377 (2010).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li><li>Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+for+synaptojanin+1+in+rod+and+cone+photoreceptors.">Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors.</a> J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).</li><li>Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+local+circuits+and+their+implications+for+olfactory+processing+in+the+fly+antennal+lobe.">Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe.</a> Cell. 128, 601-612 (2007).</li><li>Dittman, J. S., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+the+abundance+and+localization+of+synaptobrevin+in+the+plasma+membrane.">Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).</li><li>Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+neuronal+activity+by+targeted+expression+of+a+genetically+encoded+probe+in+the+mouse.">In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse.</a> Neuron. 42, 9-21 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).</li><li>Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+cell+labeling+for+cell+tracing+in+avian+development.">Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development.</a> CSH Protoc.. 2008, (2008).</li><li>Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+variants+as+ratiometric+dual+emission+pH+sensors.+1.+Structural+characterization+and+preliminary+application.">Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li><li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses.">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li><li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren, um die Dynamik eines Axon-Führungsrezeptors sowohl in der Zellkultur als auch im Entwicklungskontext des Kükenembryonals Rückenmarks zu verfolgen.
Um ein de novo pHluorin-markiertes Protein zu entwerfen, müssen zwei Punkte in Bezug auf die Klonstrategie berücksichtigt werden. Zunächst sollte das pHluorin-Tag dem Lumen der sauren Endosomen und damit dem extrazellulären Fach ausgesetzt werden, um den Plasmamembranrezeptorpool zu visualisieren. Somit hängt die korrekte Positionierung der pHluorin-Sequenz in Bezug auf die Rezeptorsequenz direkt von der Art des untersuchten Rezeptors ab(d.h. ob der N-Terminal oder der C-terminale Teil des Rezeptors dem extrazellulären Kompartiment ausgesetzt ist). Zweitens sollte, wie im Protokoll erläutert, die Position der pHluorin-Sequenz relativ zum Signalpeptid in Betracht gezogen werden, um eine spätere Spaltung zwischen dem pHluorin und dem Rezeptor zu vermeiden.
Eine Einschränkung der Technik ist mit dem Handel mit den Rezeptoren nach ihrer Aktivierung an der Plasmamembran verbunden. Üblicherweise werden Rezeptoren verinnerlicht und fortschreiten durch den endozytischen Weg, der aus funktionell und physikalisch unterschiedlichen Fächern besteht15. Aufgrund von ATP-getriebenen Protonenpumpen halten Endosomen bei frühen Endosomen einen sauren pH-Wert von 6, bei späten Endosomen etwa 5, bei Lysosomen weniger als 5, aber nur etwa 6,4 bei Recycling-Endosomen oder 7,0 bei Caveosomen, die Fluoreszenz in diesen beiden endosomischen Kompartimenten ermöglichen. Dieses Problem kann in vitro mit der totalen inneren Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) gelöst werden16. Eine zweite Einschränkung, die dieser Technik innewohnt, ist, dass pHluorin-Tag aufgrund seiner relativ großen Größe die Rezeptoraktivität stören könnte, abhängig von der Tag-Einfügestelle.
Trotz seiner Vorteile, pHluorin ist nicht weit verbreitet, um die Dynamik und Regulierung von Membranproteinen während der Axon-Navigation zu studieren. Seminale Arbeiten haben pHluorin verwendet, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Exozytose während des Wachstumskegeldrehens in vitro17zu untersuchen. Im vorliegenden Protokoll veranschaulichen wir, wie pHluorin verwendet werden könnte, um die Verteilung von Rezeptoren an der Plasmamembran von Axonen in vivozu untersuchen. Da pHluorine genetisch kodiert sind, eignen sie sich besonders für die In-vivo-Analyse. Obwohl wir seine Verwendung bei Küken nach in ovo Elektroporation beschreiben, kann dieser Ansatz in anderen Arten verwendet werden. Tatsächlich funktioniert die Elektroporation in verschiedenen Tiermodellen effizient18,19. Darüber hinaus wurden pHluorine erfolgreich in C. elegans, Drosophilaoder Maus transgene Tiere20-23verwendet.
Da pH-abhängige Veränderungen im Millisekundenbereich auftreten, sind die pHluorine speziell für die Live-Bildgebung6,24geeignet. Die PHluorin-Fusion wurde beispielsweise zur Überwachung der In-vivo-Dynamik der Synaptobrevin-Exozytose in olfaktorischen sensorischen Neuronen von transgenen Mäusen23verwendet. Die In-vivo-Live-Bildgebung von pHluorin-Fusionen ist vielversprechend, da konfokale Mikroskope, die an die Live-Bildgebung angepasst sind (schnelle Bildgebung und geringe Phototoxizität), effizienter und zugänglicher werden25. Live-Bildgebung in vivo könnte auch mit Fluoreszenz-Recovery nach Photobleichung (FRAP) kombiniert werden, so dass Exozytose oder Diffusion direkter bewertet werden könnte26.
Der Einsatz anderer pH-empfindlicher Varianten und deren Kombinationen kann das Anwendungsspektrum weiter erweitern. Die dynamische Verteilung des Rezeptors in verschiedenen Organellen konnte mit hilfe eines ratiometrischen pHluorins überwacht werden, das die Fluoreszenz entsprechend dem pH-Wert des Fachs6,27verändert. Ebenso könnte die Zugabe eines pH-unempfindlichen fluoreszierenden Proteins zu einem Membranprotein, das mit einem ekliptischen pHluorin verschmolzen wird, wichtige Einblicke in seinen Handel liefern28. Darüber hinaus wird das kürzliche Klonen von pHtomato29 die Gleichzeitige Überwachung von zwei Rezeptoren ermöglichen. Dies könnte wichtige Einblicke in die Bildung von Rezeptorkomplexen liefern. Da pHluorin kann auch verwendet werden, um Anleitung Hinweise30, Dual-Bildgebung des Liganden, und sein Rezeptor ist auch machbar.
In diesem Protokoll ist die Expressionsrate des Fusionsproteins ein kritischer Punkt und hängt insbesondere von der Stärke des Promotors, der Stabilität des Fusionsproteins und der Menge des Plasmids ab, das zur Transfektion der Zellen verwendet wird. Tatsächlich können sich Fusionsproteine bei Überexprimierter Weise in intrazellulären Vesikeln ansammeln und ein fluoreszierender Hintergrund auftreten. Daher können mehrere Optimierungen erforderlich sein, um eine präzise Visualisierung des pHluorin-geschmolzenen Proteins an der Zelloberfläche zu erreichen. Darüber hinaus erfordert die Verwendung von pHluorin-Fusionsprotein in festem Gewebe besondere Sorgfalt während und nach der Fixierung. Tatsächlich kann die Stabilisierung der Konformationen von pHluorin-Fusionsproteinen nur vorübergehend sein. Daher muss der pH-Wert über 7 gehalten werden, um einen Verlust des pHluorin-Signals zu verhindern. Darüber hinaus müssen Beobachtungen kurz nach der Fixierung durchgeführt werden. Das optimale Timing muss möglicherweise von den Anwendern entsprechend ihrem jeweiligen pHluorin-Fusionsprotein definiert werden.

Während ihrer Navigation integrieren Axone mehrere Umwelthinweise, die sie zu ihrem Ziel führen. Diese Hinweise aktivieren Leitrezeptoren an der Oberfläche von Axonklemmen, den Wachstumskegeln, die wiederum einen geeigneten Signalweg initiieren. Daher ist die zeitliche und räumliche Regulation der Zelloberflächenverteilung der Rezeptoren entscheidend, um die Empfindlichkeit des Wachstumskegels1einzustellen. In diesem Zusammenhang ist die Mittellinienüberquerung durch kommissarische Axone ein ausgezeichnetes Modell, um die Regulierung der Oberflächenebenen von Rezeptorzellen zu untersuchen. Im sich entwickelnden Rückenmark werden kommissarische Axone zunächst zur ventralen Bodenplatte hin angezogen, wo sie die Mittellinie überqueren. Nach der Überquerung verlieren sie ihre Reaktionsfähigkeit auf die Bodenplatten-Anziehungsmittel und gewinnen an Reaktion auf Bodenplattenabweisende, so dass sie die Bodenplatte verlassen und in Richtung ihres Endziels in der kontralateralen Seite des Nervensystems navigieren können2,3. Die Regulierung der Rezeptorverfügbarkeit an der Wachstumskegeloberfläche ist einer der Mechanismen, die dem Wechsel der Reaktionsfähigkeit auf Mittellinienhinweise 4,5zugrunde liegen. Daher ist die selektive Überwachung der Rezeptoren, die an der Plasmamembran von Wachstumskegeln vorhanden sind, von größter Bedeutung. Wir beschreiben hier eine Methode, die auf der pH-abhängigen Fluoreszenzeigenschaft einer grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP) basiert, um speziell die Axon-Führungsrezeptoren zu visualisieren, die an die Plasmamembran in vitro und in vivoim sich entwickelnden Kükenrückenmark adressiert sind.
Rothman und Kollegen entwickelt durch Punktmutationen pH-sensitive Varianten von GFP einschließlich der Ekliptik pHluorin6. Ekliptisches pHluorin hat die Eigenschaft, nicht fluoreszierend zu sein, wenn es einem sauren pH-Wert (<6) ausgesetzt ist, während es bei neutralem pH-Wert fluoreszierend ist. Dies ermöglicht die Unterscheidung von nichtfluoreszierenden Rezeptoren, die in intrazellulären sauren Kompartimenten lokalisiert sind(d.h. Endosomen, Handelsvesikeln) von fluoreszierenden Rezeptoren, die in die Plasmamembran integriert und somit dem extrazellulären neutralen pH7ausgesetzt sind. Wir nutzten dies, um die Plasmamembranlokalisierung von plexinA1 zu überwachen, einem Axon-Führungsrezeptor, der die Wachstumskegelreaktion auf das Mittellinien-repellens Semaphorin 3B5 vermittelt (Abbildung 1A). Wir beschreiben hier die In-vitro-Charakterisierung eines pHluorin-plexinA1-Konstrukts, zusammen mit der ovo Elektroporation8-10 dieses Konstrukts im sich entwickelnden Kükenrückenmark, gefolgt von der mikroskopischen Analyse von Kryosektionen, die es ermöglichen, die Axon-Führungsrezeptordynamik in vivo mit räumlichen und zeitlichen Auflösungen zu verfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">COS7 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:219px;">CRL-1651</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">DMEM GlutaMAX</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:264px;">Exgen500 reagent</td>
			<td style="width:147px;">Euromedex Fermentas</td>
			<td style="width:219px;">ET0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">PBS -Ca2+ -Mg2+</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fast green dye</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscopy</td>
			<td style="width:219px;">15714-S</td>
			<td>Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryomount</td>
			<td style="width:147px;">Histolab</td>
			<td style="width:219px;">00890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Hoechst 34580</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:219px;">H21486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:219px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Bottom-glass 35 mm dish</td>
			<td style="width:147px;">MatTek</td>
			<td style="width:219px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">5 ml Syringe</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">SS-05S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Needles 0.9 mm x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Capillaries</td>
			<td style="width:147px;">CML</td>
			<td style="width:219px;">PP230PO</td>
			<td>capillaries are stretched manually in the flame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">10316-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">Dumont #5 REF#11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Equipment/software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Time lapse microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:219px;">Observer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Temp module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">CO2 module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:147px;">Metamorph</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Eggs incubator</td>
			<td style="width:147px;">Sanyo</td>
			<td style="width:219px;">MIR154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electroporator apparatus</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electrodes</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY611P7-4</td>
			<td>4 mm platinum electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">LEICA</td>
			<td style="width:219px;">MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryostat</td>
			<td style="width:147px;">MICROM</td>
			<td style="width:219px;">HM550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;">FV1000, X81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluoview software</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLC Main Workbench software</td>
			<td style="width:147px;">CLC Bio</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo

Während der Entwicklung spielen Axon-Beratungsrezeptoren eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Empfindlichkeit der Axone sowohl gegenüber attraktiven als auch abstoßenden Hinweisen. Tatsächlich ist die Aktivierung der Leitrezeptoren der erste Schritt der Signalmechanismen, die es Axonspitzen, den Wachstumskegeln, ermöglichen, auf die Liganden zu reagieren. Daher ist die Modulation ihrer Verfügbarkeit an der Zelloberfläche einer der Mechanismen, die an der Einstellung der Wachstumskegelempfindlichkeit beteiligt sind. Wir beschreiben hier eine Methode zur präzisen Visualisierung der räumlich-zeitlichen Zelloberflächendynamik eines Axon-Führungsrezeptors sowohl in vitro als auch in vivo im sich entwickelnden Kükenrückenmark. Wir nutzten die pH-abhängige Fluoreszenzeigenschaft einer Grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP), um gezielt den Anteil des Axon-Führungsrezeptors zu detektieren, der an die Plasmamembran adressiert ist. Wir beschreiben zunächst die In-vitro-Validierung solcher pH-abhängigen Konstrukte und beschreiben deren Verwendung in vivo,im Küken-Rückenakkord, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Leitrezeptors von Interesse zu bewerten.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> Abbildung 1. A. Schema der pHluorin-plexinA1-Fluoreszenzeigenschaften in einem zellulären Kontext. PHluorin ist nicht fluoreszierend in intrazellulären Kompartimenten, in denen der pH-Wert sauer ist (<6), z. B. bei Handelsvesikeln oder in Endosomen, und fluoreszierend, wenn es dem extrazellulären Medium ausgesetzt ist, in dem der pH-Wert neutral ist. Dies ermöglicht die Visualisierung nur des Zelloberflächenpools des pHluorin-plexinA1-Rezeptors. B. Karte des Klonplatzes pBK-CMV-pHluorin-plexinA1. Als Rückgrat wurde ein MausrezeptorplexinA1-Exemitvektor verwendet. Dieser Vektor wurde entwickelt, um eine effiziente VSV-markierte Rezeptorinsertion an der Plasmamembran zu erreichen. Um dies zu tun, Semaphorin 3a Peptid-Signal und Spaltung Sekelstelle wurden vor dem VSV-getaggten Rezeptor von seinem eigenen Signal Peptid und Spaltung Seactid und Spaltung Seactium-Site ablated verschmolzen. Durch PCR wurde die pHluorin-Sequenz im Frame zwischen VSV-Tag und PlxnA1-Codierungssequenzen mit NruI/Kpn2I-Einschränkungsstellen eingefügt. Einzelne Restriktionsstellen sind für die Gestaltung der Klonstrategie anderer Rezeptoren angezeigt. Das Schema ist aus bioinformatischer Software adaptiert.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig2.jpg"> Abbildung 2. Die Charakterisierung des pHluorin-plexinA1 konstruieren pH-abhängige fluoreszierende Eigenschaften in COS7-Zellen. A. COS7-Zellen, die mit dem pHluorin-plexinA1-Konstrukt transfiziert wurden, wo sie mit einem konfokalen Mikroskop beobachtet wurden, das die Visualisierung der pHluorin-PlexinA1-Fluoreszenz an der Plasmamembran ermöglicht. Scale bar: 20 M. B. COS7-Zellen, die mit dem pHluorin-plexinA1-Konstrukt transfiziert werden, wo durch Live-Bildgebung in einem pH 7,4-Kulturmedium, nach Versauerung des Kulturmediums bis pH 5,5 und nach Wiederherstellung von pH 7,4 im Kulturmedium beobachtet wird. Zellumrisse werden mit einer gestrichelten Linie bei der GFP-Fluoreszenzerfassung angezeigt. Maßstabsleiste: 10 M. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50883/50883fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig3.jpg"> Abbildung 3. In ovo Elektroporation Verfahren. A. 1. Albumen Entfernung von der größten Seite der Schale. 2. Fenster der Eierschale, um zugang zum Embryo zu erhalten. B. DNA/Fast Green Mix Injektion in das Neuralrohr. C. Platzieren von Elektroden auf beiden Seiten des Neuralrohrs, Vermeidung des Herzens und der großen Gefäße und Elektroporation des Kükenembryons.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig4.jpg"> Abbildung 4. Mikroskopische Analyse von Küken-Neuralrohr-Kryosektionen nach pHluorin-PlexinA1-Elektroporation. Ein Vergleich zwischen eGFP (obere Paneele) und pHluorin-plexinA1 (untere Platten) Expressionsmuster im elektroporated Küken Rückenmark wird gezeigt. Vergrößerte Tafeln zeigen die membranöse Fluoreszenz von pHluorin-plexinA1 (a') im Vergleich zur diffusen subzellulären Lokalisierung von eGFP (a). In Bezug auf plexinA1 zeigt die vergrößerte Platte, dass dieser Rezeptor bei der Bodenplattenüberquerung (b') speziell an der Plasmamembran angereichert wird, was bei eGFP, das vor und nach der Bodenplattenüberquerung gleich ausgedrückt wird, nicht der Fall ist (b). Skalenstäbe: 100 M. FP: Bodenplatte; Pre: Precrossing; Post: Postcrossing. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50883/50883fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo at JoVE.com

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Wir beschreiben hier die Verwendung einer pH-empfindlichen grünen fluoreszierenden Proteinvariante, pHLuorin, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Beratungsrezeptorenhandels an der Zelloberfläche zu untersuchen. Der pHluorin-markierte Rezeptor wird sowohl in der Zellkultur als auch in vivomit Elektroporation des Kükenembryons exprimiert.

Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

use-phluorin-to-assess-dynamics-axon-guidance-receptors-cell-culture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Aufrufe.  University of Lyon. Wir beschreiben hier die Verwendung einer pH-empfindlichen grünen fluoreszierenden Proteinvariante, pHLuorin, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Beratungsrezeptorenhandels an der Zelloberfläche zu untersuchen. Der pHluorin-markierte Rezeptor wird sowohl in der Zellkultur als auch in vivomit Elektroporation des Kükenembryons exprimiert.

Serie: Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.