Agradecemos a Homaira Nawabi, Frederic Moret e Isabelle Sanyas pela ajuda. Este trabalho é apoiado pela CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B e A.J são apoiados por uma bolsa la Ligue contre le cancer e Labex DevWeCan, respectivamente.

1. Estratégia de clonagem para marcar receptor plexina1 com pHluorin
<ol><li>Escolha um vetor de expressão apropriado como espinha dorsal (por exemplo, o receptor do camundongo plexinA1 expressando vetor, um presente gentil do Dr. Andreas Puschel11). Nota: Este vetor plexinA1 foi projetado para alcançar uma inserção eficiente do receptor com marca HA ou VSV na membrana plasmática.</li>
	<li>Amplie por PCR a sequência de codificação de pHluorin eclíptica usando o plasmídeo adequado como modelo (por exemplo, receptor GABA A marcado por pHluorin, um presente gentil do Dr. Jacob2). Se necessário, adicione um site de restrição ao final de 5' do primer, a fim de facilitar a etapa de clonagem na espinha dorsal.</li>
	<li>Insira a sequência de pHluorin no quadro entre o peptídeo de sinal e a sequência de codificação do receptor usando locais de restrição (por exemplo, locais de restrição NruI/Kpn2I conforme descrito na Figura 1B). Nota: Como o peptídeo de sinal que garante a mira correta dos receptores é cortado, a pHluorin deve ser colocada depois dele. Isso garante o reconhecimento do peptídeo de sinal e impede o decote da pHLuorin do receptor de interesse.</li>
	<li>Sequencia os construtos obtidos para garantir que nenhuma mutação foi introduzida pelo PCR.</li>
</ol>2. Caracterização do receptor com pHLuorin in vitro em células COS7
A capacidade da proteína de fusão de atingir a membrana plasmática e sua perda reversível de fluorescência à medida que o pH é reduzido pode ser confirmada usando o procedimento a seguir.
<ol><li>Dia 1º. Placa 1,5 x 105 células COS7 em um prato de 35 mm em 2 ml de completo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM - 10% Soro Bovino Fetal - 1 mM piruvato de sódio - 25 U/ml penicilina/stretomicina - 2,5 μg/ml Anfotericina B - pH 7.4).</li>
	<li>Dia 2. Células transfectas: Nota: As células devem ser 70-80% confluentes.<ol>
<li>Prepare 200 μl NaCl 150 mM e adicione 3 μg de DNA, ou seja, o receptor de codificação vetorial com pHluorin. Suavemente vórtice e gire brevemente. Nota: Um mapa do vetor pHluorin-plexinA1 usado nesses experimentos é mostrado na Figura 1B.</li>
		<li>Adicione 10 μl de reagente de transfecção (ou a quantidade apropriada do reagente utilizado). Vórtice imediatamente.</li>
		<li>Incubar 10 min na RT.</li>
		<li>Adicione 200 μl da mistura de reagente/DNA de transfecção às células.</li>
		<li>Mova a placa suavemente para obter a repartição da mistura e coloque as células de volta à incubadora de 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dia 3. Remova o meio de transfecção e substitua-o por 2 ml de DMEM completo fresco.</li>
	<li>Dia 4. Realizar imagens de células vivas de células transfetugas COS7 pHluorin-plexinA1:<ol>
<li>Prepare duas alíquotas de média completa DMEM e ajuste o pH para 3,5 e 9,5, respectivamente. Nota: Para uma placa de 35 mm, 1,5 ml de cada solução é necessária para realizar o experimento.</li>
		<li>Remova o meio celular e substitua-o por 1 ml de PH médio completo DMEM 7.4.</li>
		<li>Prepare uma seringa de 5 ml com um tipo apropriado de tubulação, a fim de injetar vários componentes diretamente no meio de cultura celular sem abrir a câmara de microscópio.</li>
		<li>Use um módulo que permita a manutenção de uma atmosfera de trabalho úmida de 37 °C e 5% de CO2. Nota: Uma abordagem alternativa ao uso de uma câmara de CO2 é usar meio tamponado hepes (geralmente na faixa de 10-25 mM de acordo com o tipo de célula).</li>
		<li>Coloque as células na câmara e ajuste a tubulação e a seringa. Nota: O microscópio deve ser equilibrado antes de começar a evitar a deriva mecânica durante a gravação.</li>
		<li>Abra o software de imagem e selecione o programa de aquisição multidimensional.</li>
		<li>Encontre células COS7 transfectadas com o objetivo de 40X e marque posição no software para cada uma delas.</li>
		<li>Configure a pilha Z para ter uma aquisição de profundidade de 15 μm (o foco pode mudar ao adicionar mídia na placa).</li>
		<li>Configure a exposição para o filtro GFP e a Fase.</li>
		<li>Configure o tempo de aquisição. Nota: Para todo o experimento com 5 campos de interesse, a aquisição a cada 20 segundos por 10 min deve ser suficiente.</li>
		<li>Inicie a aquisição e tire 5 imagens de controle no meio DMEM pH 7.4.</li>
		<li>Pausar a aquisição, injetar 1,25 ml de pH 3.5 DMEM completo para alcançar um pH de 5,5 no meio de cultura, marcar evento no software e retomar a aquisição para mais 5 pontos de tempo. Nota: A fluorescência verde deve desaparecer progressivamente.</li>
		<li>Pausar a aquisição, injetar 1,2 ml de pH 9.5 DMEM completo para alcançar um pH 7.4 no meio de cultura, marcar evento no software e retomar a aquisição para mais 5 pontos de tempo. Nota: A fluorescência verde deve reaparecer na membrana plasmática.</li>
		<li>Analise imagens. A Figura 2 mostra imagens representativas obtidas com tal protocolo com a construção pHluorin-plexinA1.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Em ovo Eletroporação de pHluorin-plexinA1 Construto
<ol><li>Manuseio de ovos antes da eletroporação:<ol>
<li>Armazene ovos fertilizados em uma geladeira a 14 °C até uma semana antes da incubação.</li>
		<li>Incubar ovos a 38,5 °C (101.3 °F) em uma incubadora com umidade saturada por 50-52 horas até que os embriões cheguem ao estágio HH1412. Nota: Os ovos devem ser colocados horizontalmente durante a incubação para que o embrião esteja devidamente posicionado para eletroporação, flutuando na parte superior da gema. O estágio HH14 é adequado para obter expressão dos plasmídeos em neurônios diferenciados na medula espinhal e no gânglio raiz dorsal com uma taxa de sobrevivência adequada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriões eletroporados8-10:<ol>
<li>Prepare a eletroporação:<ol>
<li>Prepare plasmídeos de DNA livres de endotoxinas com uma concentração superior a 2 μg/μl, para poder diluí-lo como a concentração desejada.</li>
			<li>Puxe capilares de vidro suficientes para injetar as diferentes soluções de DNA.</li>
			<li>Prepare PBS estéril (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicilina/estreptomicina e equilibre a 38,5 °C.</li>
			<li>Esterilize o capô, tesoura curva e fórceps finos.</li>
			<li>Controle o espaçamento do eletrodo. Nota: Um espaço de 4 mm entre os eletrodos é geralmente utilizado.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Janela do ovo13 (Figura 3A):<ol>
<li>Use uma tesoura curva para perfurar a casca no lado contundente do ovo.</li>
			<li>Remova 2 ml de albumen usando uma agulha de 0,9 mm x 25 mm e uma seringa de 5 ml. Oriente a agulha verticalmente, a fim de evitar danificar o saco de gema.</li>
			<li>Cubra a parte superior do ovo com fita adesiva para manter a integridade da casca.</li>
			<li>Usando uma tesoura curva, fure a casca no meio da fita para equalizar a pressão ao remover 2 ml de albumen do ovo. Em seguida, corte uma janela grande o suficiente para visualizar o embrião e ser capaz de trabalhar nele.</li>
			<li>Adicione ~2 ml estéril quente PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicilina/estreptomicina para evitar a desidratação do embrião e torná-lo mais acessível ao manipulador.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Injete DNA e eletroporar o embrião<ol>
<li>Diluir plasmídeo em PBS (-Ca2+; -Mg2+) a uma concentração entre 0,5-2 μg/μl e adicionar corante verde rápido para atingir uma concentração final de 0,025%. Carregue a mistura de DNA em um capilar. Recomenda-se o uso de um injetor. Nota: Verifique se a resistência capilar não é muito grande (o que significa que pode haver dificuldades ao injetar embriões) nem muito pequena (o que significa que o capilar pode ser muito grande e pode danificar o embrião). Além disso, a concentração de ácidos nucleicos superiores a 2 μg/μl pode causar efeitos inespecíficos e precisa ser controlada.</li>
			<li>Puna o saco de gema e o tubo neural no lado caudal com o capilar carregado. Digite o tubo neural com um ângulo raso e encha o lúmen da cauda até a cabeça com a mistura de DNA(Figura 3B). Nota: O verde rápido permite controlar a precisão da injeção.</li>
			<li>Coloque rapidamente os eletrodos de platina de 4 mm em ambos os lados do tubo neural no nível que deseja eletroporar e aplique 3 pulsos a 31 V para 50 msec com intervalos de 500 msec(Figura 3C). Nota: Evite colocar os eletrodos no coração ou em vasos grandes e extraembrionários para evitar danificar o embrião em desenvolvimento. Bolhas devem se formar nos eletrodos.</li>
			<li>Com a agulha, remova 2 ml de albumen para diminuir o nível na casca.</li>
			<li>Sele a janela e o lado contundente hermeticamente com fita.</li>
			<li>Coloque os ovos de volta a 38,5 °C na incubadora até chegarem ao estágio desejado.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Embriões Incorporando e Cryosectioning
<ol><li>48 horas após a eletroporação, colhe cuidadosamente embriões eletroporados (estágio HH24). Corte a fita e metade da membrana corioallantóide. Para evitar que os embriões afundem na gema, posicione um coador sob o embrião e corte a segunda metade da membrana corioallantóide.</li>
	<li>Transfira o embrião para um prato de dissecção cheio de PBS gelado.</li>
	<li>Verifique a eficiência da eletroporação procurando fluorescência no tubo neural com um microscópio estéreo de fluorescência. Nota : A coeletrificação de uma codificação plasmida de controle do RFP pode ajudar a visualizar a área eletroporada.</li>
	<li>Dissecar embriões usando uma microscalpela a fim de selecionar a área eletroporada da medula espinhal.</li>
	<li>Transfira embriões dissecados para uma placa de 24 poços e fixe em pH 7,4 4% Paraformaldeído (PFA) - Salina tampão fosfato (PBS), O/N a 4 °C. Nota: A etapa de fixação é crucial para permitir a estabilização da pHLuorina em sua conformação "viva" e, assim, ser capaz de usar pHluorin em tecido fixo/permeabilized. Embora a fixação desacelere drasticamente a mudança dependente do pH da fluorescência, deve-se levar em conta que mudanças conformais/de protonação ainda podem ocorrer após a fixação. Assim, o seguinte protocolo (incorporação, criosecções e observação) deve ser realizado no prazo de 3 dias após a etapa de fixação, com todos os buffers em pH 7. Se a fixação não for necessária, recomenda-se a realização de observação em seções de tecido vivo.</li>
	<li>Remova 4% de PFA e lave embriões em pH 7,4 PBS.</li>
	<li>Incubar embriões em PBS-15% de sacarose e manter a 4 °C até que os embriões afundem.</li>
	<li>Incubar embriões fixos em pH 7,4 7,5% de gelatina- 15% de sacarose por 45 min a 37 °C para que os embriões estejam completamente incorporados.</li>
	<li>Coloque moldes de incorporação no gelo e adicione 400 μl de pH 7,4 7,5% de gelatina- 15% de sacarose para alcançar uma base sólida de 2 mm.</li>
	<li>Aspire o embrião embutido com uma ponta de corte e coloque o embrião na base de gelatina sólida.</li>
	<li>Cubra com pH 7,4 7,5% de gelatina- 15% de sacarose e posicione o embrião com fórceps antes que a gelatina se solidifique.</li>
	<li>Uma vez que a gelatina esteja sólida, prepare um banho isopropanol de -40 °C (use gelo seco ou nitrogênio líquido) e congele o bloco de gelatina por 5 minutos.</li>
	<li>Mantenha os blocos congelados a -80 °C.</li>
	<li>Coloque o bloco congelado a -20 °C por 1 hora.</li>
	<li>Remova o molde e fixe o bloco em um mandril com um meio de polietileno glicol.</li>
	<li>Uma vez que o bloco esteja bem fixo, coloque o mandril no sistema criostat. Nota: Use lâminas revestidas para evitar a perda de tecido durante a coloração.</li>
	<li>Realize criosections seriais (20 μm criosections são geralmente realizadas).</li>
	<li>Deixe as criosecções secarem por 15 minutos no RT. Nota: as crioseções devem ser protegidas contra exposição desnecessária à luz, a fim de evitar o branqueamento da fluorescência GFP.</li>
</ol>5. Análise microscópica das criogenias
<ol><li>Reidratar crioseções em pH 7.4 PBS em RT por 10 min. Nota: Se necessário, os núcleos podem ser manchados com Hoechst.</li>
	<li>Use uma solução Hoechst de 0,5 μg/ml em PBS e incubar criosections por 15 minutos.</li>
	<li>Enxágüe os slides 3x com pH 7,4 PBS por 5 min.</li>
	<li>Prossiga para a montagem de slides. Uma solução de montagem de álcool polivinyl pH 7.4 (ou mais básica) que endurece O/N pode ser usada: posicione cuidadosamente o deslizamento para evitar a formação de bolhas de ar entre o slide e o deslizamento de tampas.</li>
	<li>Deixe o meio de montagem endurecer O/N a 4 °C no escuro.</li>
	<li>Use um microscópio confocal invertido para visualizar com precisão a proteína de fusão pHluorin-plexinA1: realize z-stack no orifício ideal e resolução óptica e use uma lente de 20X (NA 0,75) ou 40X (NA 1.3). Nota: a pHluorina é detectável com os mesmos parâmetros utilizados para detectar GFP (ou seja, pico de emissões a 509 nm). As configurações do filtro de excitação e detecção do comprimento de onda são definidas de forma ideal pelo software de imagem. Hoechst é detectado entre 425-460 nm (excitação é de 405 nm), GFP ou pHluorin é detectado entre 485-545 nm (excitação é de 473 nm) e RFP é detectado entre 575-675 nm (excitação é de 559 nm).</li>
</ol>Imagens representativas da expressão pHluorin-plexinA1 e eGFP na medula espinhal do embrião do filhote são mostradas na Figura 4.

<ol>
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Structural characterization and preliminary application.</a> Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).</li><li>Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+refinement+of+vesicle+cycling+at+schaffer+collateral+synapses.">Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses.</a> Neuron. 77, 1109-1121 (2013).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).</li><li>de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para acompanhar a dinâmica de um receptor de orientação de axônio tanto na cultura celular quanto no contexto de desenvolvimento da medula espinhal do embrião de filhotes.
Para projetar uma proteína marcada por novo pHluorin, dois pontos precisam ser considerados em relação à estratégia de clonagem. Primeiro, a etiqueta de pHluorin deve ser exposta ao lúmen dos endosários ácidos e, consequentemente, ao compartimento extracelular, a fim de visualizar a piscina receptora da membrana plasmática. Assim, o posicionamento correto da sequência de pHluorin em relação à sequência do receptor depende diretamente do tipo de receptor estudado (ou seja, se o terminal N ou a parte terminal C do receptor está exposto ao compartimento extracelular). Em segundo lugar, como explicado no protocolo, a posição da sequência de pHluorin em relação ao peptídeo de sinal deve ser considerada para evitar o subsequente decote entre a pHLuorin e o receptor de interesse.
Uma limitação da técnica está ligada ao tráfico dos receptores após sua ativação na membrana plasmática. Comumente, os receptores são internalizados e progridem através da via endócítica composta de compartimentos funcionais e fisicamente distintos15. Devido às bombas de prótons movidas a ATP, os endósmos mantêm um pH ácido em torno de 6 em endósmosos iniciais, cerca de 5 em endósmosos tardios, menores que 5 em lisosomos, mas apenas cerca de 6,4 em endósmosos de reciclagem ou 7,0 em caveossósmos permitindo fluorescência nesses dois compartimentos endossômicos. Este problema pode ser resolvido in vitro usando a microscopia de reflexão interna total (TIRF)16. Uma segunda limitação inerente a esta técnica é que, devido ao seu tamanho relativamente grande, a tag pHluorin poderia interromper a atividade do receptor, dependendo do local de inserção da tag.
Apesar de suas vantagens, a pHLuorin não tem sido amplamente utilizada para estudar a dinâmica e regulação das proteínas de membrana durante a navegação do axônio. Trabalhos seminais têm usado pHluorin para estudar a dinâmica espátula-temporal da exoctose durante o cone de crescimento girando in vitro17. No presente protocolo, ilustramos como a pHLuorin poderia ser usada para investigar a distribuição de receptores na membrana plasmática dos axônios in vivo. Uma vez que os phluorins são geneticamente codificados, eles são particularmente apropriados para a análise in vivo. Embora descrevamos seu uso em filhotes após a eletroporação ovo, essa abordagem pode ser usada em outras espécies. De fato a eletroporação funciona de forma eficiente em vários modelos animais18,19. Além disso, os phluorins têm sido usados com sucesso em C. elegans, Drosophila, ou animais transgênicosde camundongos 20-23.
Uma vez que a mudança dependente do pH ocorre na faixa de milissegundos, os pHluorins são particularmente adaptados para imagens vivas6,24. A fusão de PHLuorin tem sido, por exemplo, usada para monitorar a dinâmica in vivo da excitose sináxica em neurônios sensoriais olfativos de camundongos transgênicos23. A imagem ao vivo in vivo das fusões de pHluorin mantém uma promessa considerável à medida que microscópios confocal adaptados à imagem ao vivo (imagem rápida e baixa fototoxicidade) se tornam mais eficientes e acessíveis25. A imagem ao vivo in vivo também poderia ser combinada com a recuperação da fluorescência após o fotobleaching (FRAP) para que a exocitose ou difusão pudesse ser avaliada mais diretamente26.
O uso de outras variantes sensíveis ao pH e suas combinações pode ampliar ainda mais o leque de aplicações. A distribuição dinâmica do receptor em diferentes organelas poderia ser monitorada utilizando pHluorina ratiométrica que altera fluorescência de acordo com o pH do compartimento6,27. Da mesma forma, a adição de uma proteína fluorescente insensível ao pH a uma proteína de membrana fundida a uma pHLuorina eclíptica poderia fornecer insights importantes sobre seu tráfico28. Além disso, a recente clonagem do pHtomato29 permitirá o monitoramento de dois receptores simultaneamente. Isso poderia fornecer insights importantes sobre a formação de complexos receptores. Uma vez que a pHLuorin também pode ser usada para marcar pistas de orientação30, imagem dupla do ligante, e seu receptor também é viável.
Neste protocolo, a taxa de expressão da proteína de fusão é um ponto crítico e depende particularmente da força do promotor, da estabilidade da proteína de fusão e da quantidade de plasmídeos usados para transfetar as células. De fato, quando superexpressas, proteínas de fusão podem se acumular em vesículas intracelulares e um fundo fluorescente pode aparecer. Assim, várias otimizações podem ser necessárias para obter uma visualização precisa da proteína fundida de pHluorin na superfície celular. Além disso, o uso de proteína de fusão de phluorina em tecido fixo requer cuidados particulares durante e após a fixação. De fato, a estabilização das conformações das proteínas de fusão de phluorina só pode ser temporária. Assim, o pH deve ser mantido acima de 7 para evitar a perda do sinal de pHluorin. Além disso, as observações devem ser realizadas logo após a fixação. O tempo ideal pode precisar ser definido pelos usuários de acordo com sua proteína de fusão de pHluorin particular.

Durante sua navegação, os axônios integram várias pistas ambientais que os guiam em direção ao seu alvo. Essas pistas ativam receptores de orientação na superfície dos terminais de axônio, os cones de crescimento, que por sua vez iniciam uma via de sinalização apropriada. Assim, a regulação temporal e espacial da distribuição da superfície celular dos receptores é fundamental para definir a sensibilidade do cone de crescimento1. Neste contexto, a travessia midline por axônios comissural é um excelente modelo para investigar a regulação dos níveis de superfície das células receptoras. Na medula espinhal em desenvolvimento, os axônios comissural são inicialmente atraídos para a placa do piso ventral onde cruzam a linha média. Após a travessia, eles perdem sua capacidade de resposta aos atrativos da placa de piso e ganham resposta aos repelentes da placa de piso para que possam sair da placa do chão e navegar em direção ao seu destino final no lado contralateral do sistema nervoso2,3. A regulação da disponibilidade do receptor na superfície do cone de crescimento é um dos mecanismos subjacentes à mudança de responsividade para as pistas de linha média4,5. Assim, o monitoramento seletivo dos receptores presentes na membrana plasmática dos cones de crescimento é de grande importância. Descrevemos aqui um método baseado na propriedade de fluorescência dependente do pH de uma variante de proteína fluorescente verde (GFP) para visualizar especificamente os receptores de orientação do axônio que são abordados à membrana plasmática in vitro e in vivo,na medula espinhal do pintinho em desenvolvimento.
Rothman e colegas projetados por mutações pontuais de variantes sensíveis ao PH do GFP, incluindo o pHluorin eclíptico6. A pHLuorina eclíptica tem a propriedade de não ser fluorescente quando exposta ao pH ácido (<6), enquanto é fluorescente em pH neutro. Isso permite distinguir receptores não fluorescentes localizados em compartimentos ácidos intracelulares (ou seja, endosários, vesículas de tráfico) de receptores fluorescentes incorporados à membrana plasmática e, assim, expostos ao pH neutro extracelular7. Aproveitamos isso para monitorar a localização da membrana plasmática do plexinA1, um receptor de orientação de axônio mediando a resposta do cone de crescimento à semaforina repelente midline 3B5 (Figura 1A). Descrevemos aqui a caracterização in vitro de uma construção pHluorin-plexinA1, juntamente com a eletroporação ovo8-10 deste construto na medula espinhal do filhote em desenvolvimento seguido pela análise microscópica de criosections que permitem acompanhar a dinâmica do receptor de orientação de axônio in vivo com resoluções espaciais e temporais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">COS7 cells</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:219px;">CRL-1651</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">DMEM GlutaMAX</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:264px;">Exgen500 reagent</td>
			<td style="width:147px;">Euromedex Fermentas</td>
			<td style="width:219px;">ET0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">PBS -Ca2+ -Mg2+</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:219px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fast green dye</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">32% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscopy</td>
			<td style="width:219px;">15714-S</td>
			<td>Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:219px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryomount</td>
			<td style="width:147px;">Histolab</td>
			<td style="width:219px;">00890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Hoechst 34580</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:219px;">H21486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:219px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Bottom-glass 35 mm dish</td>
			<td style="width:147px;">MatTek</td>
			<td style="width:219px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">5 ml Syringe</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">SS-05S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Needles 0.9 mm x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Terumo</td>
			<td style="width:219px;">NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Capillaries</td>
			<td style="width:147px;">CML</td>
			<td style="width:219px;">PP230PO</td>
			<td>capillaries are stretched manually in the flame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4951PLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">10316-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">FST</td>
			<td style="width:219px;">Dumont #5 REF#11254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1008px;">Equipment/software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Time lapse microscope</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:219px;">Observer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Temp module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">CO2 module S</td>
			<td style="width:147px;">PECON for Zeiss</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Metamorph software</td>
			<td style="width:147px;">Metamorph</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">Eggs incubator</td>
			<td style="width:147px;">Sanyo</td>
			<td style="width:219px;">MIR154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electroporator apparatus</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Electrodes</td>
			<td style="width:147px;">Nepa Gene CO., LTD</td>
			<td style="width:219px;">CUY611P7-4</td>
			<td>4 mm platinum electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">LEICA</td>
			<td style="width:219px;">MZ10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Cryostat</td>
			<td style="width:147px;">MICROM</td>
			<td style="width:219px;">HM550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;">FV1000, X81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:264px;">Fluoview software</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLC Main Workbench software</td>
			<td style="width:147px;">CLC Bio</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of phluorin to assess the dynamics of axon guidance receptors in cell culture and in the chick embryo

Durante o desenvolvimento, os receptores de orientação do axônio desempenham um papel crucial na regulação da sensibilidade dos axônios a pistas atraentes e repulsivas. De fato, a ativação dos receptores de orientação é o primeiro passo dos mecanismos de sinalização que permitem pontas de axônio, os cones de crescimento, para responder aos ligantes. Como tal, a modulação de sua disponibilidade na superfície celular é um dos mecanismos que participam na definição da sensibilidade do cone de crescimento. Descrevemos aqui um método para visualizar precisamente a dinâmica da superfície celular espócica de um receptor de orientação de axônio tanto in vitro quanto in vivo na medula espinhal do pintinho em desenvolvimento. Aproveitamos a propriedade de fluorescência dependente do pH de uma variante de proteína fluorescente verde (GFP) para detectar especificamente a fração do receptor de orientação do axônio que é endereçado à membrana plasmática. Primeiro descrevemos a validação in vitro de tais construtos dependentes de pH e detalhamos ainda mais seu uso in vivo, na corda vertebral do pintinho, para avaliar a dinâmica espátula-temporal do receptor de orientação do axônio de interesse.

<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig1.jpg"> Figura 1. A. Esquema das propriedades de fluorescência pHluorin-plexinA1 em um contexto celular. A phluorina é não fluorescente em compartimentos intracelulares onde o pH é ácido (<6) como em vesicules de tráfico ou em endosários e é fluorescente quando exposto ao meio extracelular onde o pH é neutro. Isso permite visualizar apenas a piscina de superfície celular do receptor pHluorin-plexinA1. B. Mapa do local de clonagem pBK-CMV-pHluorin-plexinA1. O receptor do camundongo plexinA1 expressando vetor foi usado como espinha dorsal. Este vetor foi projetado para alcançar uma eficiente inserção de receptores vsv marcados na membrana plasmática. Para isso, o sinal de peptídeo semaphorin 3a e o local do decote foram fundidos rio acima do receptor com etiqueta VSV ablado de seu próprio peptídeo de sinal e local de decote. Por PCR, a sequência de pHluorin foi inserida no quadro entre sequências de codificação VSV-tag e PlxnA1 usando sites de restrição NruI/Kpn2I. Sites de restrição única são indicados para projetar estratégia de clonagem de outros receptores. O esquema é adaptado a partir de software bioinforático.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig2.jpg"> Figura 2. Caracterização da pHluorin-plexinA1 constrói propriedades fluorescentes dependentes de pH em células COS7. A. As células COS7 transfeinam com a construção pHluorin-plexinA1 onde observadas com um microscópio confocal permitindo a visualização da fluorescência pHluorin-plexinA1 na membrana plasmática. Barra de escala: 20 μM. B. Células COS7 transfeinadas com o construto pHluorin-plexinA1 onde observadas através de imagem viva em um meio de cultura pH 7.4, após acidificação do meio de cultura até pH 5.5 e após restauração do pH 7.4 no meio da cultura. Os contornos celulares são indicados com uma linha tracejada na aquisição de fluorescência GFP. Barra de escala: 10 μM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50883/50883fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig3.jpg"> Figura 3. No procedimento de eletroporação de ovo. A. 1. Remoção de albumen do maior lado da concha. 2. Janelas da casca de ovo para acessar o embrião. B. DNA/Fast Green mistura injeção no tubo neural. C. Colocar eletrodos em ambos os lados do tubo neural, evitando o coração e grandes vasos, e eletroporação do embrião do filhote.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50883/50883fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50883/50883fig4.jpg"> Figura 4. Análise microscópica de crioseções de tubo neural de filhotes após eletroporação pHluorin-plexinA1. Uma comparação entre o padrão de expressão eGFP (painéis superiores) e pHluorin-plexinA1 (painéis inferiores) na medula espinhal do pintinho eletroporado é mostrada. Painéis ampliados mostram a fluorescência membanous de pHluorin-plexinA1 (a') em comparação com a localização subcelular difusa do eGFP (a). Em relação ao plexinA1, o painel ampliado mostra que este receptor é especificamente enriquecido na membrana plasmática após a travessia da placa do chão (b') o que não é o caso para eGFP que é igualmente expresso antes e depois da travessia da placa (b). Barras de escala: 100 μM. FP: Placa de piso; Pré: Pré-travessia; Post: Postcrossing. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50883/50883fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>

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Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Descrevemos aqui o uso de uma variante de proteína fluorescente verde sensível ao pH, pHluorin, para estudar a dinâmica espátula-temporal dos receptores de orientação de axônio que traficam na superfície celular. O receptor com marca de phluorina é expresso tanto na cultura celular quanto in vivo,usando eletroporação do embrião de filhote.

Uso de pHluorin para avaliar a dinâmica dos receptores de orientação de axônio na cultura celular e no embrião de filhotes

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

use-phluorin-to-assess-dynamics-axon-guidance-receptors-cell-culture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K visualizações.  University of Lyon. Descrevemos aqui o uso de uma variante de proteína fluorescente verde sensível ao pH, pHluorin, para estudar a dinâmica espátula-temporal dos receptores de orientação de axônio que traficam na superfície celular. O receptor com marca de phluorina é expresso tanto na cultura celular quanto in vivo,usando eletroporação do embrião de filhote.

Vídeo: Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

O uso do condicionamento de rastreamento Eyeblink clássico para avaliar disfunção Hippocampal em um modelo do rato de transtornos do espectro do álcool Fetal

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Uso de pHluorin para avaliar a dinâmica dos receptores de orientação de axônio na cultura celular e no embrião de filhotes

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