Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Heping Cheng, Huiliang Zhang und Stephen Kolwicz für ihre hilfreichen Kommentare und technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Diese Studie wurde vom NIH Zuschüsse und der Entwicklung Scientist Grant von der American Heart Association WW unterstützt.

1. Experiment Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die isotonische balancierte Salzlösung (50 ml), enthaltend 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES (pH 7,2) für die in vivo-Bildgebung Skelettmuskel. </li><li> Herstellung von 1 l Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) enthält: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 0,5 mM EDTA und 25 mM NaHCO3. </li><li> Blasen die KHB mit Gas, das 95% O 2/5% CO &amp;sub2; für 10-15 min vor der Zugabe von 2 mM CaCl 2. In metabolischen Substrate (z. B. 10 mM Glucose und 0,5 mM Pyruvat). </li><li> Vorbereitung der chirurgischen Instrumente durch Sterilisieren der Klemme, Scheren und Pinzetten in 70% Ethanol und anschließendes Spülen in sterilisiertem ddH 2 O. </li><li> Schalten Sie den Herzdurchblutung System, stellen Sie die Temperatur auf dem Wasserbad und Thermostaten, die Geschwindigkeit der Schlauchpumpe bis 6 ml / min. </li><li> Blase der KHB mit 95% O 2/ 5% CO 2-Gases und die Durchflussrate und Temperatur (37 ° C, durch eine faseroptische Temperatursonde) des Abwassers zu überwachen. Das System benötigt etwa 20 Minuten für Gas-und Temperaturausgleich. </li></ol> 2. Die konfokale Bildgebung der Skelettmuskulatur In Vivo <ol><li> Maus anästhesiert mit Pentobarbital (80 mg / kg, ip). Das Tier wird chirurgische Anästhesie (keine Reaktion auf Zehenklemm) innerhalb von 10-15 min erreicht und bleibt in diesem Zustand für 1-1,5 h, ausreichend für die in vivo-Abbildung von Skelettmuskeln. </li><li> Haare entfernen auf einem der Hinterbeine und Sterilisieren der Haut mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Einschnitt auf der Haut entlang der Außenseite der Schenkel um die Wadenmuskeln freizulegen. </li><li> Nehmen Sie den Epimysium vorsichtig mit einem scharfen Zangen und einen Einschnitt durch sie mit einer Schere. Weitere sezieren, um die Epimysium entfernen und setzen die Muskelfasern unter ihm. </li><li> Für die in vivo Belastung der TMRM in die SkelettMuskel, gehören TMRM (500 nM) in der isotonischen Salzlösung ausgeglichen, um Muskeln für 30 Minuten eintauchen und dann waschen von Anzeige-freie Lösung. </li><li> Setzen Sie die Maus auf seiner Seite auf dem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM 510) Stufe und der hinteren Gliedmaßen in einer Position, die der freiliegenden Skelettmuskel zugewandt ist gegen das Deckglas, das den Boden der Kammer bildet, zurückhalten. Das Deckglas ist zwischen dem Muskelgewebe und dem invertierten Objektiv (40x Öl). </li><li> Drücken Sie das Bein leicht nach unten, um einen engen Kontakt zwischen dem Gewebe und dem Deckglas zu machen. Tauchen Sie die freiliegenden Muskeln in isotonischer Salzlösung ausgeglichen. </li><li> Datensatz zweidimensionale (2D, xy) konfokale Bilder mit einer Abtastrate von einer Sekunde pro Rahmen. Die Intensität jedes Pixels wird in 8-Bit-Auflösung digitalisiert. Normalerweise enthält eine serielle Scan 100 Bilder. </li><li> Sammeln aufeinanderfolgenden Bildern von aufregenden ersten bei 405 nm und Sammeln bei&gt; 505 nm dann bei 488 nm, während das Sammeln bei&gt; 505 nm für zwei Wellenlängen excitation Bild von mt-cpYFP. Verwenden sequentielle Anregung bei 405, 488 und 543 nm und Emission bei 505 bis 545 zu sammeln, 505-545 und&gt; 560 nm, jeweils für Dreifachanregungswellenlänge Bildgebung von mt-cpYFP und TMRM. </li></ol> 3. Die konfokale Bildgebung von perfundierten Maus Herz <ol><li> Unmittelbar nach der in vivo-Abbildung von Skelettmuskeln, injizieren die Maus mit 200 Einheiten Heparin (ip). Zehn Minuten später einschläfern der Maus durch Thorakotomie und schnell zu entfernen, die das Herz mit Lunge und Thymus attached to it. </li><li> Entfernen Sie schnell die Lunge in eiskaltem Puffer. Identifizieren Sie die Lappen des Thymus und vorsichtig abziehen, um den aufsteigenden Aorta aus. </li><li> Entfernen Sie den Thymus und isolieren die Aorta durch vorsichtiges Entfernen von umgebenden Gewebe. </li><li> Machen Sie einen Schnitt am oberen Ende der aufsteigenden Aorta vor dem ersten Zweig der Aortenbogen. </li><li> Halten Sie die Wand der Aorta vorsichtig mit zwei Mikronahtzange, um den Hohlraum freizulegen, und vorsichtig die Aorta auf die ca.nnula (PE50-Rohr). Die Aorta wird an Ort und Stelle mit einem Mikro-Gefäßklemme gehalten, während Nähte werden schnell um die Aorta verbunden. </li><li> Entfernen Sie die Klemme, sorgfältig zu prüfen, die Kanüle mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass die Spitze der Kanüle über Aortenwurzel ist. Zusätzliche Verbindungen werden nach Bedarf hinzugefügt, um das Herz in Position zu halten. </li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe und Perfusion des Herzens bei 1 ml / min. Das Herz wird wieder schlagen auf Perfusion. </li><li> Stellen Sie die Position des Perfusionssystems legte das Herz auf dem Mikroskoptisch. Die Bühne hat einen Adapter, der Erwärmung der Kammer, die das Herz hält kann. </li><li> 1 ml KHB Perfusionslösung in der Kammer, um das Herz teilweise eintauchen. Überwachung der Temperatur der Kammer bei 37 ° C Entfernen Abfluß aus der Kammer unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe. </li><li> Erhöhen die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe allmählich auf eine ausreichende Strömung (ca. 2 ml / min), um das Herz zu liefern. </li><li> Nach 10 min Stabilisierung versorgen die HEArt mit 10 uM blebbistatin und 100-500 nM TMRM. Herzschlag wird nach 10 min zu verlangsamen. </li><li> Sanften Druck auf das Herz, um engen Kontakt des Herzens mit dem Deckglas auf dem Boden der Kammer zu gewährleisten und um weiter zu unterdrücken Herzschlag. </li><li> Verfahren Sie ebenso für die konfokale Bildgebung von intakten Herzmuskel, wie in Schritt 2.8 oben beschrieben. Die Brennebene sorgfältig anpassen, um das klarste Bild möglich zu offenbaren. </li></ol> 4. Bildverarbeitung und Datenanalyse <ol><li> Verwenden Sie Tools von der &quot;Physiologische Analysis&quot;-Modul des konfokalen Software, um Einzel mitochondriale Membranpotential Wallungen und Veränderungen zu analysieren ist. Dieses Modul ist häufig in der Bildaufnahme-Software des konfokalen Systems enthalten und ermöglicht die Bestimmung bestimmter Bildbereiche sowie Ausgangs der Fluoreszenzintensität mit der Zeit Etiketten. </li><li> Öffnen Sie die Datenbank und dann die Serien 2D-Image-Datei zu analysieren. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Regionof Interest (ROI) bedeuten Mittelwert von ROIs &quot;, um zum Schalter&quot; &quot;-Modus. Klicken Sie auf die&quot; Region of Interest (ROI) Mittelwert Mittelwert von ROIs &quot;-Modus&quot;, um zum Schalter. &quot; </li><li> Schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle außer dem Kanal der cpYFP 488 nm für die Auswahl der blinkt. </li><li> Zoom in das Bild und bewegen manuell Schieberegler, um die seriellen 2D-Bildern zu spielen. </li><li> Identifizieren Einzel mitochondrialen Superoxid blinkt durch Anordnen der Ort, an dem Fluoreszenzsignal steigt vorübergehend. Verwenden Sie den entsprechenden ROI-Tool, um die Blitze zu markieren. Die Spur, die zeitabhängige Fluoreszenzänderung jedes ROI zeigen sich neben dem Bild. </li><li> Nach der Auswahl aller blinkt, schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle. Wählen Sie eine ROI auf das Bild außerhalb der Zelle für die Hintergrundsignal Subtraktion. Ausgangs die durchschnittliche Fluoreszenz jedes ROI zusammen mit den Zeit Etiketten. </li><li> Notieren Sie die Anzahl der Blitze in jeder der seriellen Scan-Image-Datei zusammen mit der Scan-Zeit und Flächedie Zelle. Verwenden von Excel zum Blitzfrequenz als Anzahl der Blitze pro 100 sec / 1000 um 2 Zellfläche zu berechnen. </li><li> Verwenden Sie eine benutzerdefinierte entwickelte Programm in Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) geschrieben, um die Parameter der einzelnen Flash-(Amplitude, Zeit, Höhepunkt erreichen und Abfallzeit) zu berechnen. IDL-Software ist im Handel erhältlich und der speziell entwickelten Programm für Flash-Parameteranalyse können beim Autor angefordert werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Imaging Einzel mitochondriale Ereignisse in lebenden Tier oder durchbluteten Organen hat erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden für die mitochondriale Funktion Auswertung 17,19,21,22,24,25. Die hier beschriebene Technik kann Echtzeit-in-situ-Bestimmung der mitochondrialen Funktion in einem echten physiologischen Zustand auf subzellulärer Auflösung zu erreichen. Dies ist besonders nützlich, wenn sie mit anderen Messungen kombiniert werden, um systemisch Studium der Rolle von Mitochondrien in der normalen Funktion eines bestimmten Organ oder Zelltyp in vivo. Dies ist eine komplizierte Technik, die konfokale Mikroskopie und anspruchsvolle Perfusionssystem mit der Steuerung der verschiedenen Parameter kombiniert. Dennoch wurde diese Technik verwendet, um den ganzen Körper Glukose-Stoffwechsel mit Muskelmitochondrienfunktion 17,19,20 verknüpfen und werden derzeit von uns verwendet, um das mitochondriale Funktionsstörungen bei Herzerkrankungen zu untersuchen. Der Langendorff-Herz perfusion System durch Überwachen des linken Ventrikels Druck und Abbilden der intrazellulären Ca 2 +-Transienten in jedem Schlag kompatibel zu Herzfunktionsbewertung. Alternativ können auch andere fluoreszierende Indikatoren wie MitoSOX oder DCF perfundiert werden, um in situ Darstellung von stationären ROS im Myokard zu erleichtern. Langendorff perfundierten Herzen wurde weithin verwendet, um die Reaktion des Herzens auf physiologische (z. B. β-adrenerge Stimulation durch Dobutamin) oder pathologische (z. B. Ischämie-Reperfusion) 26-28 Störungen auszuwerten. Solche Behandlungen können in das konfokale Abbildungssystem nach Einzel mitochondrialen Funktion in Reaktion auf die Spannungen zu beurteilen eingearbeitet werden. Einschränkungen dieser Methode sind die Auswahl von Geweben / Organen, die machbar ist für Live-Tierbildgebung sind. Oberflächliche Gewebe wie Skelettmuskulatur, subkutane Strukturen und oberflächlichen Nerven sind ideal für die konfokale Bildgebung in der Live-animal. Innere Organe sind technisch ungeeignet für Live-Tierbildgebung auf Grund der umfangreichen Schäden an der Maus, während Aussetzen der Orgel. Allerdings können die inneren Organe für die Organdurchblutung / Kultur eingestellt werden, wie Langendorff perfundierten Herz-oder Hirnschnittkultur, wenn eine physiologische mimetischen Umwelt aufrechterhalten werden kann. Zusätzlich hat Konfokalmikroskop eine effektive Abbildungstiefe von 30-50 &amp;mgr; m, was die Abbildung von einigen Zellschichten unterhalb der Organoberfläche ermöglicht. Es ist möglich, dass dieses System mit einer Multiphotonen-Mikroskop, das einen viel höheren Eindringtiefe (beispielsweise bis zu 1 mm) wird kombiniert und verwendet worden, um die Funktion der Mitochondrien im intakten Herzens 29 zu beurteilen. Bewegungsartefakte ist ein weiterer kritischer Punkt, der berücksichtigt werden sollte. Die Mitochondrien in der Skelettmuskulatur und Herzmuskelzellen zeigten minimale Bewegung während des Scans. Ferner kann Herzschlag-induzierte Bewegungsartefakte durch Perfusion mit blebbistatin ein drückt oder eliminiert werden,nd Anwendung von leichtem Druck auf das Herz. In anderen Zelltypen, wie Fibroblasten, Neuronen und können die Mitochondrien konstant und dramatischen Bewegungen zu unterziehen. Während der Bildverarbeitung und-analyse, sollten alle Signaländerungen aufgrund von Bewegungsartefakten sorgfältig identifiziert und ausgeschlossen werden. Zusätzliche Herausforderungen dieser Technik gehören die Aufrechterhaltung der geeigneten Zustand während des Experiments, positive Kontrollen und Dateninterpretation. Für Skelettmuskel-Bildgebung bei narkotisierten Mäusen, sollte der freiliegenden Muskelfläche in physiologischen Puffern zu jeder Zeit eingetaucht werden. Vital der Maus wie Atmung sollte während des gesamten Experiments überwacht. Für durchbluteten Herz Studien, werden entsprechende Sauerstoffversorgung, Temperaturkontrolle und Substratversorgung erforderlich. Positive Kontrollen werden empfohlen, um den Zustand und die Reaktionsfähigkeit der Gewebe zu überprüfen. Um dies zu tun, können Mäuse mit Insulin oder Glukose und durchbluteten Herzen injiziert werden kann elektrisch stimu seinlated oder mit Isoproterenol perfundiert. Erhöhte Superoxid blinkt sollte nach dieser Behandlung (Fig. 4) 19,20 beobachtet werden. Darüber hinaus werden die Zeitraffer-Bilder aufgenommen, wenn der Bewegungsartefakten wird durch Hemmung der Herzschlag, die sub-physiologischen Bedingungen durch verminderte Arbeitsbelastung produziert drückt. Somit sollte der perfundierten Herzen Experiment als enger Mimetikum der in vivo Situation betrachtet werden. Schließlich wurde das Verfahren unter Verwendung eines konfokalen Zeiss (LSM 510) entwickelt. Andere konfokalen System (zB Nikon, Olympus oder Leica) kann verwendet werden, wenn das System die folgenden Anforderungen erfüllt: (1) Zeitraffer-Rahmen-Scan-Modus, (2) hat eine Abtastrate von 1 sec / Rahmen, und (3) können einzelne Mitochondrium Auflösung (zB 1 um x 2 um) zu erreichen. Die Software eines konfokalen System erlaubt meist einfache Bildverarbeitung und Analyse, wie beispielsweise die Definition der ROIs und Fluoreszenzintensitätsausgabe mit time Etiketten. Alternativ können Bild J Software für die Bildanalyse-und Blitzparameter Berechnung verwendet werden. Zusammenfassend ist die Abbildung einzelner mitochondriale Ereignisse wie Superoxid blinkt in der Skelettmuskulatur in vivo oder in perfundierten Herzen ein einzigartiger Ansatz zur Echtzeit-Bestimmung der mitochondrialen Funktion. Diese Technik ist ein bedeutender Fortschritt gegenüber den herkömmlichen in vitro-Messungen und eine genauere Beurteilung der Mitochondrienfunktion und seine Beziehung mit zellulären Prozessen / Funktionen unter realen physiologischen Bedingungen bereitzustellen.

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Zell Bioenergetik, Radikal Signalisierung, Redox-Homöostase, Ionenregulation und Zellschicksal Bestimmung 1,2. Mitochondrien Dysfunktion oft begleitet und die Voraussetzung für die Entstehung von Krankheiten 6.3. Insbesondere in den Muskelsysteme wie Herz-und Skelettmuskulatur liefert mitochondrialen Atmung der meisten ATP rechtzeitige Regulierung der intrazellulären Calcium und robuste Kraftentwicklung 7,8 unterstützen. Diese Muskeln besitzen eine große Anzahl von Mitochondrien, die oft besetzen bis 20-40% des gesamten Zellvolumens und &quot;fixiert&quot; zwischen Myofilamenten 2. Trotz der zahlreichen Studien, das Verständnis der Regulation der mitochondrialen Funktion, insbesondere in vivo und unter physiologisch relevanten Bedingungen, begrenzt. Einer der Gründe ist, dass die Mehrheit der zur Auswertung der mitochondrialen Funktion entwickelten Methoden beruhen auf in vitro-oder ex vivo-Ansätze, wie die Überwachung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien mit künstlichen Substraten ergänzt, und die indirekte Bestimmung der mitochondrialen Funktion durch Morphologie (z. B. Elektronenmikroskopie), Enzymaktivität (z. B. Aconitaseaktivität) oder intrazellulären ATP-Spiegel 9-11 . Kürzlich, kleines Molekül Fluoreszenzindikatoren mit relativer mitochondrialen Bereicherung wurden angewendet, um einen Einblick in die mitochondriale Signale, einschließlich Membranpotential, Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), in intakten Zellen 11-13 bieten. Außerdem haben mehrere grün fluoreszierende Protein (GFP) und ROS basierten Redox-Indikatoren entwickelt worden, um genauere Beurteilung des Fachintrazellulären Redox-oder ROS Signale 14-16 zu erreichen. Unter diesem, eine genetisch kodierte Superoxid-Indikator, der Kreis permutierter gelb fluoreszierendes Protein und Targete entwickelten wird in Mitochondrien (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP kann bei 405 oder 488 nm mit beiden Emissionspeaks bei 515 nm angeregt werden. Die Emission bei 488 nm Anregung, die auf Superoxid-spezifisch, wie durch vorherige in vitro-und in-vivo-Kalibrierung 17,18 dargestellt. Die Emission bei 405 nm Anregung wird als interne Kontrolle verwendet (siehe hierzu detaillierte Informationen über die Emissions-und Anregungsspektren von mt-cpYFP unter verschiedenen Bedingungen Abbildung 1 von Lit. 17). Mit Zeitraffer-konfokale Bildgebung, erkennt diese Anzeige platzen Superoxid-Produktion Veranstaltungen, namens Superoxid Wallungen, in Einzel Mitochondrien intakter Zellen. Superoxid-Flash dient als eine zusammengesetzte Funktion der mitochondrialen Atmung, vorübergehende Begleitmitochondrienmembran Depolarisation und ROS-Produktion 17-20. Kürzlich haben wir die pan-Gewebe mt-cpYFP transgenen Mäusen mit dem pUC-CAGGS-mt-cpYFP Vektor 17,19 auf C57/BL6 Hintergrund generiert und verifiziert die starken Ausdrucksion dieses Indikators in Herz, Skelettmuskeln und anderen Geweben (Abbildung 2). Die transgenen Mäuse werden auf Anfrage und MTA Genehmigung durch die Universität von Washington sein für interessierte akademischen Forschern zur Verfügung. In dieser Studie beschreiben wir in situ-Bildgebung von Superoxid blinkt Langendorff perfundierten Herzen als auch in vivo-Abbildung von von Blitzereignissen in der Skelettmuskulatur von betäubten mt-cpYFP transgenen Mäusen 17,19. Diese Technologie ermöglicht die Echtzeitüberwachung der einzelnen mitochondrialen ROS-Produktion Ereignisse in einem physiologisch relevanten Bedingungen oder in vivo 21,22. Es ist auch möglich, das System zu verwenden, um andere einzelne Parameter wie mitochondriale Membranpotential und Calcium mit geeigneten fluoreszierenden Indikatoren. Ferner gleichzeitige oder parallele Auswertung der mitochondrialen Funktion mit intrazelluläre Ereignisse (z. B. Calcium Transienten) oder Herzfunktion (z. B.. Ejektionsfraktion) erreicht werden. Pathologischen Störungen, wie Ischämie und Reperfusion kann perfundierten Herzen angewandt werden, um die Auswirkungen von Stress auf die einzelnen mitochondrialen Funktion im intakten Myokard zu beurteilen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitochondrium ist ein wichtiger intrazellulären Organellen für die Energieproduktion und intrazelluläre Signal in eukaryontischen Systemen verantwortlich. Mitochondriale Dysfunktion oft begleitet und trägt zur menschlichen Krankheit. Mehrzahl der Ansätze, die entwickelt wurden, um die mitochondriale Funktion und Dysfunktion beurteilen sich auf in vitro oder ex vivo-Messungen. Ergebnisse aus diesen Versuchen sind die Fähigkeit zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion in vivo begrenzt. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, die konfokale Scanning-Mikroskopie für die Abbildung von intakten Geweben im Live Aminalen, die die Bewertung der einzelnen Funktion der Mitochondrien in einer Echtzeitweise in vivo ermöglicht nutzt. Zunächst erzeugen wir transgene Mäuse, die mitochondriale gezielte Superoxid-Indikator, zirkular permutiert gelb fluoreszierende Protein (mt-cpYFP) ausdrückt. Betäubt mt-cpYFP Maus auf eine maßgeschneiderte Tischadapter und Zeitraffer-Bilder werden f genommen Festrom die freiliegenden Skelettmuskeln der hinteren Gliedmaßen. Die Maus wird anschließend getötet und das Herz wird für Langendorff-Perfusion mit physiologischen Lösungen bei 37 ° C eingestellt Perfundierten Herzen in einer speziellen Kammer auf der konfokalen Mikroskoptisch positioniert und leichtem Druck aufgebracht wird, um das Herz zu immobilisieren und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte zu unterdrücken. Superoxid Wallungen werden durch Echtzeit-2D-konfokale Bildgebung bei einer Frequenz von einem Bild pro Sekunde erfasst. Die Perfusionslösung können modifiziert werden, um verschiedene Substrate Atmung oder andere Fluoreszenzindikatoren enthalten. Die Perfusion kann auch eingestellt werden, um Krankheitsmodellen wie Ischämie und Reperfusion zu erzeugen. Diese Technik ist ein einzigartiger Ansatz zur Bestimmung der Funktion von Einzel Mitochondrium in intakten Geweben und in vivo.

Gemäß diesem Protokoll können in vivo Bildgebung von Einzel mitochondriale Ereignisse in der Skelettmuskulatur von betäubten Mäusen durchgeführt werden, gefolgt von in situ-Bildgebung in perfundierten Herzen (Fig. 1). Die optimale Einstellung der Aufnahmebedingungen wird dafür sorgen, klare Bilder der intakten Muskeln und mit Einzel Mitochondrium Auflösung (Abbildung 2). TMRM wird oft verwendet, um die Position der mt-cpYFP überprüfen und sollte eine vollständige überlappenden Muster mit der mt-cpYFP Signal (Abbildung 2) zu zeigen. TMRM ist eine kommerziell erhältliche Anzeige für mitochondriale Membranpotential-Messung in intakten Zellen 23. Seine Spektren sind unterscheidbar von derjenigen cpYFP. Ferner kann durch Verwendung der sequentiellen Anregung Verfahren werden die Sendesignale von TMRM und mt-cpYFP nicht miteinander interferieren 17. In Abbildung 3 dargestellt repräsentative Bilder zeigen, dass einzelne mitochondrialen Superoxid-Flash accodurch Membrandepolarisation mpanied in den seriellen Scan-2D-Bilder identifiziert werden, mit einer transienten Zunahme der Fluoreszenz in den Hintergrundsignalen in beide Gewebe Skelettmuskel und Myokard (Abbildung 3). Neben der hohen Auflösung ist eine ausreichende Fluoreszenzintensität erforderlich. Dies kann durch die Modulation der Laserintensität und die Verstärkung in der Sammelkanäle erreicht werden. Im allgemeinen wird die Grundfluoreszenzsignal von der Zelle auf ein Drittel bis ein Viertel der maximalen Intensität des Kanals. Da die Expression von mt-cpYFP und das Laden von TMRM können unter Tieren unterscheiden kann, ist die Feinabstimmung der Abbildungsbedingungen für jedes Experiment durchgeführt werden. Beide physiologischen und pathologischen Störungen, wie z. B. metabolische Substrate 17,19, elektrische Stimulation (Fig. 4) 20, ischämischer Reperfusions-17, wurden verwendet, um zu zeigen, dass Superoxid-Flash-Aktivität reagiert auf Veränderungen der zellulären Stoffwechsellage. </p&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50818/50818fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Schematische Darstellung des konfokalen Abbildungs ​​der Skelettmuskeln und Langendorff perfundierten Herzen. Transgene Maus exprimieren mt-cpYFP anästhesiert und die Skelettmuskeln auf einem der Hinterbeine für konfokale Bildgebung ausgesetzt. Das Herz wird dann in der Langendorff-Modus perfundiert und konfokalen Bild durchgeführt wird. Bildverarbeitung und Datenanalyse des konfokalen Software und individuell entwickelte Programm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50818/50818fig2.jpg" /> 2. Konfokale Bildgebung von Skelettmuskelfasern in vivo und in Myokard perfundiert Herzen. A. Repräsentative Bilder, welche die Skelettmuskulatur von nicht-transgenen (Ntg) und mt-cpYFP transgenen (mt-cpYFP) Maus mit mitochondrialen Membranpotentials Anzeige geladen, TMRM. B. Repräsentative Bildern, die die Myocardium von Ntg und mt-cpYFP Mäuse in Langendorff-perfundierten Herzen. Ex: Anregungswellenlänge. mt-cpYFP wird bei 405 und 488 nm mit 505 bis 530 nm (blau) und 505 bis 530 nm (grün), jeweils gesammelt Emissionen angeregt werden. TMRM wird bei 543 nm mit einer Emission bei&gt; 560 nm (rot) gesammelt angeregt wird. Maßstabsbalken = 50 um. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50818/50818fig3.jpg" /> 3. Einzel mitochondrialen Superoxid blinkt in der Skelettmuskulatur in vivo und in perfundierten Herzen detektiert. A. Repräsentative Bilder (oben) und Spuren von zeitabhängigen Fluoreszenz-Änderung (mt-cpYFP bei 405 und 488 nm Anregung und TMRM bei 543 nm Anregung, unteres Bild), die einen einzelnen mitochondrialen Superoxid-Blitz (von Orangen Pfeilen hervorgehoben in der erweiterten Teil der Bilder) in Skelettmuskelfasern. Beachten Sie die erhöhten mt-cpYFP Signal (Anregung bei 488 nm) wird begleitet durch eine verminderte TMRM Signal. B. Repräsentative images (oben) und Spuren von zeitabhängigen Fluoreszenz-Änderung (unten) während eines einzigen mitochondrialen Superoxid-Blitz in perfundierten Myokard. Maßstabsbalken = 50 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50818/50818fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50818/50818fig4.jpg" /> 4. Erhöhte Superoxid Blitzfrequenz in perfundierten Herzen durch elektrische Stimulation. Das Herz wurde elektrisch stimuliert (Stimulations, 4 V und 2 Hz) für 2 min. Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 8 Zellen. *:. P &lt;0,05 gegenüber Ruhe <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50818/50818fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

confocal-imaging-single-mitochondrial-superoxide-flashes-intact-heart

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

14.5K Aufrufe.  University of Washington.  Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen. 

Serie: Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Forschung

Biologie

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and arrhythmias can only be fully understood at the whole organ level. Here, we present the spectroscopic technique of local field fluorescence microscopy (LFFM) that allows the measurement of cellular signals in the intact heart. The technique is based on a combination of a Langendorff perfused heart and optical fibers to record fluorescent signals. LFFM has various applications in the field of cardiovascular physiology to study the heart under normal and pathological conditions. Multiple cardiac variables can be monitored using different fluorescent indicators. These include cytosolic [Ca2+], intra-sarcoplasmic reticulum [Ca2+] and membrane potentials. The exogenous fluorescent probes are excited and the emitted fluorescence detected with three different arrangements of LFFM epifluorescence techniques presented in this paper. The central differences among these techniques are the type of light source used for excitation and on the way the excitation light is modulated. The pulsed LFFM (PLFFM) uses laser light pulses while continuous wave LFFM (CLFFM) uses continuous laser light for excitation. Finally, light-emitting diodes (LEDs) were used as a third light source. This non-coherent arrangement is called pulsed LED fluorescence microscopy (PLEDFM).

In the heart, molecular events coordinate the electrical and contractile function of the organ. A set of local field fluorescence microscopy techniques presented here enables the recording of cellular variables in intact hearts. Identifying mechanisms defining the cardiac function is critical in understanding how the heart works under pathological situations.