המחברים מבקשים להודות לבני זוג. הפינג נג, Huiliang ז&#39;אנג וסטיבן Kolwicz על הערותיהם מועילות ותמיכה טכנית בפיתוח בשיטה זו. מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH ומדען הפיתוח גרנט מאיגוד לב האמריקאי למלחמת העולם.

1. ניסוי הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התמיסה איזוטונית מאוזנת מלח (50 מיליליטר) המכילה: 140 mM NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 2.5 מ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ MgCl 2 ו10 HEPES מ&quot;מ (pH 7.2) עבור in vivo הדמיה שרירי שלד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של חיץ קרבס-Henseleit (KHB) המכיל: 118 mM NaCl, 5.3 מ&quot;מ KCl, 1.2 מ&quot;מ MgSO 4, 0.5 mM EDTA ו25 מ&quot;מ NaHCO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בועת KHB עם 95% O גז המכיל 2/5% CO 2 למשך 10-15 דקות לפני התוספת של 2 מ&quot;מ CaCl 2. הוספת מצעים מטבולים (למשל 10 גלוקוז מ&quot;מ ו0.5 פירובט מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשירי ניתוח על ידי חיטוי המהדק, מספריים, מלקחיים ב70% אתנול ולאחר מכן לשטוף בDDH 2 O. מעוקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת זלוף לב, להתאים את הטמפרטורה באמבט המים וסירקולטור, לקבוע את המהירות של משאבת peristaltic עד 6 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בועת KHB עם 95% O 2גז / 5% CO 2, ולנטר את קצב זרימה ואת הטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס, על ידי בדיקה טמפרטורת סיבים אופטית) של השפכים. המערכת צריכה על 20 דקות לאיזון גז וטמפרטורה. </li></ol> 2. ההדמיה confocal של שרירי שלד בVivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר עם pentobarbital (80 מ&quot;ג / קילוגרם, ip). בעלי החיים יגיעו להרדמה כירורגית (אין תגובה לקמצוץ הבוהן) בתוך 10-15 דקות ולהישאר במצב זה עבור 1-1.5 שעות, מספיק לvivo ההדמיה של שרירי שלד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר שערות על אחד hindlimbs ולעקר את העור עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בעור בצד החיצוני של האיבר כדי לחשוף את שרירי הגסטרוקנמיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים epimysium בעדינות עם מלקחיים חדים ועושה חתך דרכו במספריים. בהמשך לנתח כדי להסיר את epimysium ולחשוף את סיבי השריר שמתחתיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעינת vivo של TMRM לתוך השלדשריר, כולל TMRM (500 ננומטר) בתמיסת מלח מאוזנת איזוטוני לטבול שרירים ל30 דקות ולאחר מכן לשטוף החוצה על ידי פתרון ללא חיווי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר בצד שלה במיקרוסקופ confocal (Zeiss LSM 510) השלב ולרסן את האיבר האחורי במצב שרירי שלד החשוף פונים נגד coverslip שמהווה את החלק התחתון של החדר. Coverslip הוא בין רקמת השריר והמטרה ההפוכה (שמן 40X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הרגל בעדינות כדי ליצור קשר הדוק בין הרקמות וcoverslip. לטבול את השרירים החשופים בתמיסת מלח מאוזנת איזוטוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא שני (2D, XY) תמונות confocal ממדיות בקצב דגימה של שנייה אחת לכל מסגרת. האינטנסיביות של כל פיקסל דיגיטציה בעומק של 8 ביט. בדרך כלל, סריקה סידורי מכילה 100 מסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות רציפים על ידי ראשון מרגש ב405 ננומטר ואיסוף ב&gt; 505 ננומטר אז ב488 ננומטר תוך איסוף ב&gt; 505 ננומטר לexcitatio אורך גל כפולההדמיה n של MT-cpYFP. השתמש עירור רציף ב405, 488 ו543 ננומטר, ולאסוף פליטה ב 505-545, 505-545, ו&gt; 560 ננומטר, בהתאמה, עבור הדמיה עירור גל משולשת של MT-cpYFP וTMRM. </li></ol> 3. ההדמיה confocal של לב perfused מאוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר vivo ההדמיה של שרירי שלד, להזריק את העכבר עם 200 יחידות של הפרין (IP). עשר דקות מאוחר יותר, להרדים את העכבר על ידי פתיחת בית החזה ובמהירות להסיר את הלב עם ריאות ובלוטת התימוס קשורות אליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את הריאות במאגר קר כקרח. זהה את האונות של בלוטת התימוס ולקלף בעדינות לאחור כדי לחשוף את אב העורקים עולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטת התימוס ולבודד את אב העורקים על ידי הסרת כל רקמה הסובבת בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בקצה העליון של אב העורקים עולים לפני הסניף הראשון של קשת אב העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקיר של אב העורקים בעדינות עם שני מלקחיים תפירת מיקרו כדי לחשוף את לומן ומניח בזהירות את אב העורקים על cannula (PE50 צינור). אב העורקים הוא נערך במקום עם מהדק כלי מיקרו בזמן שתפרים קשורים במהירות ברחבי אב העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המהדק, לבדוק היטב את הצינורית עם מלקחיים כדי לוודא שהקצה של הצינורית הוא מעל שורש אב העורקים. קשרים נוספים מתווספים ככל שיידרשו כדי להחזיק את הלב במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת peristaltic ותנקב לב ב1 מיליליטר / דקה. הלב יתחדש מכה על זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המיקום של מערכת זלוף ולשים לב על הבמה מיקרוסקופ. יש שלב מתאם המאפשר חימום של החדר שמחזיק את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תמיסת זלוף KHB בתא עד להטביע את הלב באופן חלקי. לפקח על טמפרטורה של החדר על 37 ° C. הסר את השפכים מהתא באמצעות משאבת peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיל את המהירות של משאבת peristaltic בהדרגה כדי לספק זרימה מספקת (כ 2 מיליליטר / דקה) ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות של התייצבות, תנקב heart עם 10 blebbistatin מיקרומטר ו100-500 TMRM ננומטר. פעימת לב תהיה להאט לאחר 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל לחץ עדין על הלב כדי להבטיח קשר הדוק של הלב עם coverslip בחלק התחתון של החדר ולדכא את פעימות לב נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את אותו תהליך הדמיה confocal של שריר הלב שלם כמתואר בשלב 2.8 לעיל. להתאים את מישור המוקד בזהירות כדי לחשוף את התמונה הברורה ביותר האפשרית. </li></ol> 4. עיבוד תמונה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלים המסופקים על ידי מודול &quot;פיזיולוגי ניתוח&quot; של תוכנת confocal לנתח שינויי חום וקרום המיטוכונדריה בודדים פוטנציאליים. מודול זה נכלל לעתים קרובות בתוכנת תמונת רכישה של מערכת confocal ומאפשר קביעה של אזורים מסוימים בתמונה, כמו גם תפוקה של עוצמת הקרינה עם תוויות זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מסד הנתונים ולאחר מכן את קובץ התמונה 2D הסידורי להיות מנותחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;האזורשל העניין (ROI) אומר &quot;כדי לעבור ל&quot; ממוצע של ROIs&quot; המצב. לחץ על &quot;האזור של העניין (ROI) אומר&quot; כדי לעבור למצב &quot;אומר של ROIs&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבטל את התצוגה של ערוצים אחרים מלבד ערוץ cpYFP 488 ננומטר לבחירת ההבזקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זום בתמונה באופן ידני להעביר פס שקף לשחק תמונות 2D סדרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות הבזקי סופראוקסיד המיטוכונדריה אחת על ידי איתור האתר שבו עליות אות ניאון transiently. השתמש בכלי ROI המתאים כדי לסמן את ההבזקים. העקבות מראים שינוי הקרינה תלוי זמן של כל החזר על השקעה תופיע לצד התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בחירת כל ההבזקים, להפעיל את התצוגה של ערוצים אחרים. בחר את ההחזר על ההשקעה על התמונה חיצונית של התא לחיסור אות רקע. פלט הקרינה הממוצעת של כל החזר על השקעה יחד עם תוויות הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר ההבזקים בכל אחד מקובץ תמונת הסריקה הסידורי יחד עם הזמן ושטח של הסריקההתא. השימוש ב-Excel כדי לחשב הבזק תדירות כמו מספר הבזקים לכל 100 שניות / שטח תא 1,000 מיקרומטר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתכנית שפותחה במיוחד עבור כתובה בנתונים אינטראקטיביים שפה (IDL, ResearchSystems) כדי לחשב את הפרמטרים של כל פלאש (אמפליטודה, זמן להגיע לשיא וזמן דעיכה). תוכנת IDL היא זמינה באופן מסחרי וניתן לקבל את התכנית שפותחה במיוחד עבור ניתוח לבזק פרמטר מן המחבר על פי דרישה. </li></ol>

<ol>
	<li>Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium,+ATP,+and+ROS:+a+mitochondrial+love-hate+triangle.">Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).</li><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondria. , (2008).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+heart+failure.">Mitochondria in heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).</li><li>Griffiths, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+heart+disease.">Mitochondria and heart disease.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Pieczenik, S. R., Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+molecular+pathways+of+disease.">Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease.</a> Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).</li><li>Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+utilization+for+calcium+uptake+and+force+production+in+different+types+of+human+skeletal+muscle+fibres.">ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 531, 393-403 (2001).</li><li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+human+heart.">Mitochondria in the human heart.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+III.+The+steady+state.">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state.</a> J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).</li><li>Lambert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+mitochondria.">Reactive oxygen species production by mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes.">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).</li><li>Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-targeted+fluorescent+probes+for+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).</li><li>Belousov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Flashes+in+Single+Mitochondria.">Superoxide Flashes in Single Mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li><li>Wei-Lapierre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respective+Contribution+of+Mitochondrial+Superoxide+and+pH+to+Mitochondria-targeted+Circularly+Permuted+Yellow+Fluorescent+Protein+(mt-cpYFP)+Flash+Activity.">Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity.</a> J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+superoxide+flash+and+metabolism-coupled+mitochondrial+permeability+transition+in+living+animals.">Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals.</a> Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+superoxide+flashes:+metabolic+biomarkers+of+skeletal+muscle+activity+and+disease.">Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease.</a> FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).</li><li>Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes:+illuminating+new+insights+into+cardiac+ischemia/reperfusion+injury.">Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).</li><li>Wei, L., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+SGP+symposium+on+mitochondrial+physiology+and+medicine:+mitochondrial+superoxide+flashes:+from+discovery+to+new+controversies.">Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies.</a> J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).</li><li>Johnson, I., Spence, M. T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.2.">Ch. 12.2.</a> The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 510-511 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes:+elemental+events+of+mitochondrial+ROS+signaling+in+the+heart.">Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+reveal+novel+properties+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+excitability+in+cardiomyocytes.">Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes.</a> Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li><li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion:+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers.">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li><li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors.">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).</li><li>Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+calcium+waves+and+redox+changes+precede+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+in+the+intact+heart+during+hypoxia+and+reoxygenation.">Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation.</a> Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש הדמיה אירועי המיטוכונדריה אחת בחי או באיברי perfused יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות ל17,19,21,22,24,25 הערכת תפקוד המיטוכונדריה. הטכניקה המתוארת כאן יכולה להשיג בזמן אמת בנחישות באתרו של תפקוד המיטוכונדריה במצב פיסיולוגי אמיתי ברזולוציה subcellular. התכונה זו שימושית במיוחד, בשילוב עם מדידות אחרות, כדי ללמוד את התפקיד של המיטוכונדריה בתפקוד התקין של איבר מסוים או סוג תא in vivo מערכתי. זוהי טכניקה מורכבת, המשלבת מערכת זלוף מתוחכמת מיקרוסקופיה confocal ועם השליטה בפרמטרים שונים. עם זאת, טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לקשר את חילוף החומרים של הגלוקוז בגוף כולו עם תפקוד המיטוכונדריה שרירים 17,19,20 ומועסקת כיום על ידי בנו ללמוד את התפקוד המיטוכונדריה במחלות לב. Perfusio לב Langendorffמערכת n תואמת להערכת תפקוד לב באמצעות ניטור לחץ החדר השמאלי והדמית 2 + ארעיים תאיים Ca בכל פעימה. לחלופין, ניתן perfused אינדיקטורים ניאון אחרים כגון MitoSOX או DCF כדי להקל בהדמיה באתרו של רמות ROS מצב יציב בשריר הלב. לב Langendorff perfused כבר בשימוש נרחב כדי להעריך את התגובה של לב (למשל גירוי β-adrenergic ידי dobutamine) פיסיולוגי או (reperfusion איסכמיה למשל) פתולוגי הפרעות 26-28. ניתן לשלב טיפולים מסוג זה במערכת confocal ההדמיה כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה אחת בתגובה ללחצים. מגבלות של שיטה זו כוללות את הבחירה של רקמות / איברים שהם אפשריים עבור הדמיה חיה חיות. רקמות שטחיות כגון שרירי שלד, מבנים תת עורי ועצבים שטחיים הן אידיאליים עבור ההדמיה confocal בani החיmal. איברים פנימיים מבחינה טכנית בלתי הולמים עבור הדמיה חיה חיים בשל הפגיעה הנרחבת בעכבר תוך חשיפת האיברים. עם זאת, ניתן להגדיר איברים פנימיים עד לזלוף איבר / תרבות, כגון לב Langendorff perfused או תרבות הפרוסה מוח, אם ניתן לקיים סביבה כוזב פיזיולוגית. בנוסף, למיקרוסקופ confocal עומק הדמיה אפקטיבי של 30-50 מיקרומטר, המאפשר ההדמיה של כמה שכבות של תאים שמתחת לפני השטח האיברים. זה אפשרי, כי מערכת זו יכולה להיות משולבת עם המיקרוסקופ רב פוטון, שבו יש עומק הרבה יותר גבוה חדירה (למשל עד 1 מ&quot;מ) וכבר בשימוש כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה בלב שלם 29. חפץ תנועה הוא נושא קריטי נוסף שצריך להילקח בחשבון. מיטוכונדריה שברירי שלד ולב myocytes הראתה תנועה מינימאלית במהלך הסריקה. יתר על כן, חפץ תנועה מושרה דופק ניתן לדכא או בוטל על ידי זלוף עם blebbistatinnd הפעלת לחץ עדין על הלב. בסוגי תאים אחרים, כמו תאי עצב וfibroblasts, מיטוכונדריה עשויה לעבור תנועות קבועה ודרמטיות. במהלך עיבוד הדמיה וניתוח, צריך להיות מזוהה כל שינוי אות בשל חפץ תנועה בזהירות ומורחק. אתגרים נוספים של טכניקה זו כוללים שמירה על מצבו המתאים לאורך כל הניסוי, בקרות חיוביות ונתונים לפרשנות. הדמיה שרירי שלד בעכברים מורדמים, משטח השריר החשוף צריך להיות שקוע במאגרים פיסיולוגיים בכל זמנים. סימנים חיוניים של העכבר כמו נשימה צריכים להיות במעקב לאורך כל הניסוי. ללימודי לב perfused, חמצון מתאים, בקרת טמפרטורה ואספקת מצע נדרשים. בקרות חיוביות מומלץ לוודא את מצבו ואת ההיענות של הרקמות. לשם כך, ניתן להזריק עכברים עם אינסולין או גלוקוז ולבבות perfused יכול להיות stimu חשמליlated או perfused עם isoproterenol. יש לשים לב הבזקי סופראוקסיד מוגבר לאחר טיפולים אלה (איור 4) 19,20. בנוסף, הזמן לשגות התמונות נלקחות כאשר חפץ התנועה מדוכא דרך פעימות לב עיכוב, אשר מייצר תנאים תת פיסיולוגיים עקב ירידה בעומס עבודה. לכן, ניסוי לב perfused צריך להיחשב ככוזב מדוקדקת של מצב in vivo. לבסוף, הטכניקה פותחה באמצעות confocal Zeiss (LSM 510). מערכת confocal אחרת (למשל ניקון, אולימפוס או לייקה) יכול לשמש אם המערכת עומדת בדרישות הבאות: (1) יש מצב סריקת מסגרת הזמן לשגות, (2) יש לו קצב דגימה של 1 שניות / מסגרת, ו (3) יכול להגיע לרזולוציה אחת mitochondrion (מיקרומטר x 2 מיקרומטר לדוגמא 1). התוכנה של מערכת confocal בדרך כלל מאפשרת עיבוד תמונה פשוטה וניתוח, כגון הגדרת פלט ROIs ועוצמת הקרינה עם tIME תוויות. לחלופין, תוכנת J תמונה יכולה לשמש לניתוח תמונה וחישוב פרמטר הבזק. לסיכום, ההדמיה של אירועי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד בשרירי שלד in vivo או בלב perfused היא גישה ייחודית לקביעת תפקוד המיטוכונדריה בזמן אמת. טכניקה זו היא התקדמות משמעותית מעל במבחנה המדידות המסורתיות ותספק הערכה מדויקת יותר של תפקוד המיטוכונדריה ומערכת היחסים שלה עם תהליכים תאיים / פונקציות בתנאים פיסיולוגיים אמיתיים.

מיטוכונדריה לשחק תפקיד מרכזי בbioenergetics תא, איתות של רדיקלים חופשיים, הומאוסטזיס חיזור, רגולציה יון, ו1,2 קביעת גורל תא. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ולעתים קרובות מלווה ביסוד פתוגנזה של מחלות 3-6. במיוחד במערכות השרירים כגון לב ושרירי שלד, נשימה המיטוכונדריאלי מספקת את הרוב של ה-ATP לתמיכה ברגולציה בזמן של סידן תוך תאי ו7,8 פיתוח כוח חזק. שרירים אלה יש מספר גדול של מיטוכונדריה כי לעתים קרובות לכבוש עד 20-40% מכלל נפח התא והם &quot;קבועים&quot; בין myofilaments 2. למרות מחקרים רבים, ההבנה של הרגולציה התפקוד המיטוכונדריה, במיוחד in vivo ובתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שלנו, מוגבלת. אחת הסיבות הוא כי רוב השיטות שפותחו להערכת תפקוד המיטוכונדריה להסתמך על בvitro או vivo לשעבר גישות, כגון ניטור צריכת החמצן של מיטוכונדריה המבודדת בתוספת מצעים מלאכותיים, והקביעה העקיפה של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות מורפולוגיה (מיקרוסקופיה למשל אלקטרון), פעילות האנזים (פעילות aconitase למשל), או רמות ה-ATP תאית 9-11 . לאחרונה, אינדיקטורים ניאון מולקולה קטנים עם העשרת המיטוכונדריה היחסית יושמו כדי לספק הצצה אותות המיטוכונדריה, כוללים פוטנציאל ממברנה, סידן ומיני חמצן תגובתי (ROS), בתאים שלמים 11-13. יתר על כן, כמה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) חיזור מבוסס ואינדיקטורים ROS פותחו כדי להשיג הערכה ספציפית יותר של חיזור תאיים הממודר או ROS מאותת 14-16. בקרב זה, פיתחנו אינדיקטור מקודד גנטי סופראוקסיד, חלבון פלואורסצנטי הצהוב permuted המעגלי, וtargeteד אותו למיטוכונדריה (MT-cpYFP) 17. יכול להיות נרגש MT-cpYFP ב405 או 488 ננומטר עם שתי פסגות הפליטה ב 515 ננומטר. הפליטה ב 488 עירור ננומטר היא דווקא מגיבה לסופראוקסיד כפי שמוצג על ידי קודם במבחנה בכיולי vivo 17,18. הפליטה ב 405 עירור ננומטר משמשת כבקרה פנימית (עיין באיור 1 של Ref 17 למידע מפורט על ספקטרום הפליטה ועירור של MT-cpYFP בתנאים שונים). עם confocal הדמיה הזמן לשגות, אינדיקטור זה מזהה מתפוצץ אירועי סופראוקסיד ייצור, בשם הבזקי סופראוקסיד, במיטוכונדריה בודדת של תאים שלמים. הבזק סופראוקסיד משמש כפונקציה משולבת של נשימה המיטוכונדריאלי, שלילת קוטביות קרום נלווית חולפת המיטוכונדריה וייצור ROS 17-20. לאחרונה, יש לנו שנוצרו העכברים הטרנסגניים MT-cpYFP הפאן רקמות באמצעות וקטור PUC-CAGGS-MT-cpYFP 17,19 על רקע C57/BL6 ואימתו את הביטויים חזקיםשיאון של אינדיקטור זה בלב, שרירי שלד ורקמות אחרות (איור 2). העכברים מהונדסים יהיו זמינים לחוקרים אקדמיים מעוניינים על פי דרישה וMTA אישור על ידי אוניברסיטת וושינגטון. במחקר זה, אנו מתארים בהדמיה באתרו של הבזקי סופראוקסיד בלב perfused Langendorff כמו גם in vivo הדמיה של אירועי הבזק שברירי שלד של עכברים הטרנסגניים הרדים MT-cpYFP 17,19. טכנולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועי ייצור ROS המיטוכונדריה אחד במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית או in vivo 21,22 זמן אמת. זה גם אפשרי על מנת להשתמש במערכת לניטור פרמטרים המיטוכונדריה אחת אחרים כגון פוטנציאל קרום וסידן עם אינדיקטורים ניאון מתאימים. הערכה נוספת, בו זמנית או במקביל של תפקוד המיטוכונדריה עם אירועים תאיים (למשל ארעיים סידן) או את תפקוד לב (לדוגמא:. פליטת חלקיק) יכול להיות מושגת. הפרעות פתולוגיות, כגון איסכמיה ו reperfusion, יכולות להיות מיושמות על לב perfused כדי להעריך את ההשפעה של מתח על תפקוד המיטוכונדריה בודד בשריר הלב ללא פגע.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitochondrion הוא אברון תאיים קריטי אחראי על ייצור אנרגיה ואיתות תאית במערכות אוקריוטים. תפקוד המיטוכונדריה לעתים קרובות מלווה ותורם למחלות בבני אדם. רוב הגישות שפותחו כדי להעריך את התפקוד ותפקוד המיטוכונדריה מבוססים על במבחנה או מדידות vivo לשעבר. יש תוצאות מניסויים אלה בקביעת יכולת תפקוד המיטוכונדריה in vivo מוגבלות. כאן, אנו מתארים גישה חדשנית אשר מנצלת מיקרוסקופיה confocal סריקה עבור ההדמיה של רקמות שלמות בaminals החי, המאפשרת ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה אחת באופן בזמן אמת בגוף חי. ראשית, עלינו ליצור עכברים מהונדסים המבטאים את מחוון סופראוקסיד המיטוכונדריה הממוקד, חלבון permuted מעגלית צהוב ניאון (MT-cpYFP). MT-cpYFP הרדים עכבר קבוע במתאם שלב מחוייט וזמן לשגות תמונות נלקחות from שרירי שלד החשוף של hindlimb. העכבר הקריב לאחר מכן והלב מוגדר לזלוף Langendorff עם פתרונות פיסיולוגיים ב 37 ° C. לב perfused ממוקם בתא מיוחד על הבמה מיקרוסקופ confocal ולחץ עדין מוחל כדי לשתק את הלב ולדכא את פעימות לב חפץ בתנועה מושרה. הבזקי סופראוקסיד מזוהים על ידי ההדמיה confocal 2D בזמן אמת בתדר של מסגרת אחת לשנייה. פתרון זלוף יכול להיות שונה כדי להכיל את מצעי נשימה שונים או אינדיקטורים ניאון אחרים. זלוף גם יכול להיות מותאם כדי לייצר מודלים מחלה כגון איסכמיה ו reperfusion. טכניקה זו היא גישה ייחודית לקביעת הפונקציה של המיטוכונדריה בודדת ברקמות שלמות וin vivo.

על פי פרוטוקול זה, in vivo הדמיה של אירועי המיטוכונדריה אחד יכולה לעשות בשרירי שלד של עכברים מורדמים ואחריו בהדמיה באתרו בלב perfused (איור 1). ההגדרה האופטימלית של תנאי ההדמיה תבטיח תמונות ברורות של רקמות שרירים ללא פגע ועם הרזולוציה mitochondrion אחד (איור 2). TMRM משמש לעתים קרובות כדי לוודא את מיקומו של MT-cpYFP וצריך להראות דפוס חפיפה מלא עם אות MT-cpYFP (איור 2). TMRM הוא אינדיקטור זמין מסחרי למדידת פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בתאים שלמים 23. הספקטרום שלה ניתן להבחין מזה של cpYFP. יתר על כן, על ידי שימוש בשיטת העירור הרציף, אותות הפליטה של TMRM וMT-cpYFP לא להפריע זה ל17 אחרים. נציג תמונות שמוצגים באיור 3 מצביעות על כך שעכו הבזק סופראוקסיד המיטוכונדריה אחתmpanied ידי שלילת קוטביות קרום יכול להיות מזוהה בתמונות סריקת 2D סדרתי, עם עלייה חולפת הקרינה לאורך אותות הרקע בשתי רקמות שריר השלד ושריר הלב (איור 3). חוץ מזה ברזולוציה גבוהה, עוצמת הקרינה מתאימה נדרשה גם. זו יכולה להיות מושגת על ידי ויסות עוצמת הלייזר והרווח בערוצי האיסוף. באופן כללי, אותות הקרינה הבסיסיים מהתא מוגדר בשליש לרבע מהעצמה המרבית של הערוץ. מאז רמת הביטוי של MT-cpYFP והטעינה של TMRM יכולה להשתנות בין בעלי חיים, הכוונון עדין של תנאי ההדמיה צריך להיעשות עבור כל ניסוי. שני הפרעות פיסיולוגיות ופתולוגיים, כגון מצעים מטבולי 17,19, גירוי חשמלי (איור 4) 20, איסכמי-reperfusion 17, שנוצלו כדי להראות שפעילות הבזק סופראוקסיד מגיבה לשינויים במצב מטבולים סלולריים. </p&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50818/50818fig1.jpg" /> איור 1. איור סכמטי של ההדמיה confocal של שרירי שלד ולב perfused Langendorff. העכבר המהונדס מבטא MT-cpYFP הוא הרדים ושרירי שלד על אחד hindlimbs נחשפים להדמית confocal. הלב אז perfused במצב Langendorff ותמונת confocal מתנהלת. ניתוח עיבוד תמונה והנתונים המשמש את תוכנת confocal ותכנית שפותחה בהתאמה אישית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50818/50818fig2.jpg" /> איור 2. ההדמיה confocal של סיבי שריר שלד ובשריר הלב vivo בלב perfused. תמונות א &#39;נציג מראים שרירי השלד של nontransgenic (NTG) ומהונדס MT-cpYFP עכבר (MT-cpYFP) עמוס מחוון פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, תמונות TMRM. ב הנציג מראים מיועכברי cardium של NTG וMT-cpYFP בLangendorff perfused לב. אקס: גל עירור. MT-cpYFP הוא נרגש ב405 ו488 ננומטר עם פליטה שנאסף ב505-530 ננומטר (כחול) ו505-530 ננומטר (ירוק), בהתאמה. TMRM הוא נרגש בננומטר 543 עם פליטה שנאסף ב&gt; 560 ננומטר (אדום). ברים סולם = 50 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50818/50818fig3.jpg" /> איור 3. הבזקי סופראוקסיד המיטוכונדריה יחיד שזוהו בשרירי שלד in vivo ו בלב perfused. תמונות א &#39;נציג (פנל עליון) ועקבות של שינוי תלוי זמן הקרינה (MT-cpYFP ב405 ו488 עירור ננומטר וTMRM ב543 עירור ננומטר, פנל תחתון) מראה הבזק בודד המיטוכונדריה סופראוקסיד (מודגש על ידי חצים כתומים במוגדל חלק מהתמונות) בסיבי שריר שלד. שים לב לאות המוגברת MT-cpYFP (ב 488 עירור ננומטר) מלווה בירידת אות TMRM. מתאר לעצמי ב &#39;נציגes (פנל עליון) ועקבות של שינוי הקרינה תלוי זמן (פנל תחתון) במהלך הבזק סופראוקסיד המיטוכונדריה בודד בשריר לב perfused. ברים סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50818/50818fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50818/50818fig4.jpg" /> איור 4. הגברת תדירות הבזק סופראוקסיד בלב perfused על ידי גירוי חשמלי. הלב היה מגורה חשמלי (צעדה, הרץ 4 V ו -2) במשך 2 דקות. הנתונים הם ממוצע ± SEM, n = 8 תאים. *:. P &lt;0.05 לעומת מנוחה <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50818/50818fig4large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo at JoVE.com

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

מיקרוסקופיה confocal הסריקה מיושמת הדמיה אירועי המיטוכונדריה בודדות בלב perfused או שרירי שלד בבעלי חיים בשידור חי. ניטור של תהליכי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד ותנודות פוטנציאל הממברנה בזמן אמת מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ובמהלך ההפרעות פתולוגיות.

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

confocal-imaging-single-mitochondrial-superoxide-flashes-intact-heart

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

14.5K Views.  University of Washington.  מיקרוסקופיה confocal הסריקה מיושמת הדמיה אירועי המיטוכונדריה בודדות בלב perfused או שרירי שלד בבעלי חיים בשידור חי. ניטור של תהליכי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד ותנודות פוטנציאל הממברנה בזמן אמת מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בה?...

Video: Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and arrhythmias can only be fully understood at the whole organ level. Here, we present the spectroscopic technique of local field fluorescence microscopy (LFFM) that allows the measurement of cellular signals in the intact heart. The technique is based on a combination of a Langendorff perfused heart and optical fibers to record fluorescent signals. LFFM has various applications in the field of cardiovascular physiology to study the heart under normal and pathological conditions. Multiple cardiac variables can be monitored using different fluorescent indicators. These include cytosolic [Ca2+], intra-sarcoplasmic reticulum [Ca2+] and membrane potentials. The exogenous fluorescent probes are excited and the emitted fluorescence detected with three different arrangements of LFFM epifluorescence techniques presented in this paper. The central differences among these techniques are the type of light source used for excitation and on the way the excitation light is modulated. The pulsed LFFM (PLFFM) uses laser light pulses while continuous wave LFFM (CLFFM) uses continuous laser light for excitation. Finally, light-emitting diodes (LEDs) were used as a third light source. This non-coherent arrangement is called pulsed LED fluorescence microscopy (PLEDFM).

In the heart, molecular events coordinate the electrical and contractile function of the organ. A set of local field fluorescence microscopy techniques presented here enables the recording of cellular variables in intact hearts. Identifying mechanisms defining the cardiac function is critical in understanding how the heart works under pathological situations.