Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder (NIH / NIDCD 009269, 012831 und ARRA administrative Ergänzung NIH Zuschüsse) zu Weihong Lin unterstützt. Wir danken besonders Herrn Tim Ford bei UMBC für seine technische Unterstützung bei Videoaufnahmen und Bearbeitung. Wir möchten auch Dr. Daphne Blumberg, Ms. Chere Petty bei UMBC und Mr. Nicholas McCollum von Olympus America Inc. danken für ihre Unterstützung bei der Ausrüstung Videoaufnahmen.

1. Maus Nose Vorbereitung Wir verwendeten erwachsenen C57BL / 6 Hintergrund Mäuse in dieser Studie. Alle Tierpflege und Verfahren werden durch die Animal Care und Use Committees (IACUC) der University of Maryland, Baltimore Landkreis genehmigt. 1.1 Der Erwerb der Nase aus paraformaldahyde fixierten Mäusen <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Bones Schädel einer Maus A:. Dorsale Ansicht des Schädels B:. Ventralansicht des Schädels mit dem Unterkiefer entfernt. Der Schädel wurde aus einer 40 Tage alten Maus hergestellt. Einzelne Knochen werden zur besseren Visualisierung gefärbt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <ol><li> Perfundieren transkardial einzelnen Mäusen nach th behebene Protokoll von Lin et al., (2008) 16. Kurz gesagt, wurden die Mäuse tief narkotisierten mit Tribromethanol (Avertin 250 ug / g Körpergewicht), transkardial mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB, 30-50 ml), gefolgt von einem Phosphat gepufferte Fixiermittel perfundiert mit 3% Paraformaldehyd, 19 mM L-Lysin monohydrochloride und 0,23% Natrium-m-Perjodat (ca. 35-50 ml). Man kann auch die Schritte in der JoVE Artikel für Tier Perfusion 35. </li><li> Verwenden Sie eine Schere abzuschneiden Unterkiefer (oder der Unterkiefer) und entfernen Sie die Haut auf dem Kopf. </li><li> Trennen der gesamte Kopf vom Rest des Körpers. </li><li> Entfernen Sie den Gaumen. Außerdem reinigen und entfernen Sie die restlichen Bindegewebe und Muskulatur auf der Oberfläche des Schädels, um die Probe in den 1A und 1B gezeigt bekommen. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie die Schädelknochen, die das Gehirn und Riechkolben. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe und Knochen. Keinete, für den erweiterten Gewebe Vorbereitung, in der das Gehirn und Nase verbunden bleiben, werden nur die Schädelknochen entfernt. Für immunhistochemische Untersuchungen wurde das Gewebe für 1,5 h nach befestigt und in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 25% Saccharose über Nacht. Nasal Gewebe sollte gehalten befeuchtet werden während der Präparation durch Eintauchen in das gepufferte Saccharose-Lösung mehrmals. </li></ol> 1.2 Der Erwerb der Nase frisch eingeschläfert Mäuse <ol><li> Einzelne Mäuse wurden auf eine saubere Käfig übertragen und belichtet, um CO 2-Gas, das durch Genickbruch 5 min nach dem letzten Atemzug folgte. Um das Blut in der Nase Gewebe zu reduzieren, verwenden Sie eine Schere, um die Truhe zu öffnen und schneiden das Herz, damit das Blut abfließen kann. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 bis 1.1.5, mit Ausnahme der Post-Fixierung und Kryokonservierung mit 25% Saccharose. Die Probe sollte gehalten befeuchtet und gewartet werden mit Kochsalzlösung mit Tyrode (in mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 Na-Pyruvat, 10 D-Glucose und 10 N-2-Hydroxyethyl-N&#39;-2-ethansulfonsäure-Puffer (HEPES, eingestellt auf pH 7.4). Alternativ faltet ein Stück Kimwipes, tränken sie mit Tyrode-Lösung und Ort unter der Probe während Sezieren und gelegentlich tauchen die Probe in der Tyrode-Lösung oder einige Tropfen Lösung auf das Gewebe zu halten befeuchtet, um die Lebensfähigkeit der Zellen und Gewebe zu erhalten . </li></ol> 2. Schneidezahn, Vordere Vomer und Oberkiefer Knochen Removal <ol><li> Starten Sie von einer ventralen Sicht. Suchen Sie die vomer Knochen und brechen die Knochen vomer entlang seiner Länge mit einer Zange oder Pinzette mit Zähnen, um die meisten ventralen Teil des Knochens zu brechen. </li><li> Mit gezackten Zange, entfernen Sie die defekte Segmente des vomer Knochen sanft Aufdrängend die Knochenfragmente vom Vomeronasalorgan (VNO). Hinweis für Mäuse weniger als einen Monat alt, oder wenn nur Interesse an der MOE, diese beiden steps übersprungen werden. </li><li> Halten Sie den Kopf fest mit einer Pinzette. Verwenden Sie die Zange, um den vorderen Teil der beiden Schneidezähne und der Region verbunden Frontzahnbereich des Oberkiefers zwischen den beiden Schneidezähnen und dem vomer Knochen brechen. </li><li> Brechen Sie den ventralen Teil des rechten Oberkiefers in dem Bereich knapp vor der Jochbogen bis zur Höhe der Rückenflosse Jochbein Platte. </li><li> Flip über die Nase für eine Rückenflosse Sicht. Verwenden Sie die Zange, um den vorderen rechten Oberkiefer des dorsalen Platte Jochbein zu brechen. Der gesamte vordere rechten Oberkiefer des Jochbein Platte sollte locker sein. Verwenden Sie die feinen Pinzette vorsichtig trennen jede Nasengewebe zugrunde liegenden Oberkiefer, und dann sanft abhebt das Knochenstück. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 auf der linken Schneidezahn und linken vorderen Oberkiefer Lösen und entfernen Sie sie nach dem Nasenbein entfernt wurde. </li></ol> 3. Nasenbein und Jochbein Dorsal Plattenentnahme <ol><li> Verwenden Sie die gezackten Zange oder die Zange wiederBewegen Sie den Rest der Stirnbeine nur kaudal der nasalen Knochen. Nach dem Entfernen dieses Stück Knochen, kann der kaudalen Teil des Nasenbein mit einer Pinzette gegriffen werden. </li><li> Verwenden Sie die Zange, um den vorderen Teil des Jochbogen, die dem Jochbein Platte angeschlossen ist zu brechen. </li><li> Nehmen Sie die feinen Pinzette am seitlichen Rand der dorsalen Ende des Jochbein Platte und vorsichtig drehen die Knochen und entfernen Sie es. Wenn der Knochen nicht locker ist, verwenden Sie die Zange, um es vorsichtig spannen, um es für die Entfernung zu lockern. </li><li> Verwenden Sie die feinen Pinzette oder einer Rasierklinge die mediale Naht zwischen der rechten und linken Nasenbein lockern. </li><li> Verwenden Sie die Zange, um die gezackten kaudalen Ende der rechten Nasenbein greifen. Bewegen Sie die Knochen von einer Seite zur anderen, um sie vom darunter liegenden Gewebe zu trennen. Es ist sinnvoll, die Zange entlang der kaudalen Drittel des Nasenbein bewegen zum Bewegen der Knochen einer Seite zur anderen. Wie das Nasenbein trennt, langsam heben die Knochen aus dem kaudalen Ende. </li><li> Während ter Nasenbein leicht angehoben wird, kippen die Knochen seitlich zu einer seitlichen outcropping des Knochens, die mit dünnen respiratorischen Epithel ausgekleidet ist zu offenbaren. Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen dieses Gewebe aus dem Nasenbein. Fahren Sie mit dem Nasenbein heben. Wenn der Knochen vollständig vom darunter liegenden Gewebe getrennt, mit einer Schere abgeschnitten Nasenbein am rostralen Ende. </li><li> Die Schritte 3.1, 3.5 und 3.6 für die Entfernung von links Nasenknochens. </li><li> Die Schritte 3.2 und 3.3 für die linke Seite der Nase. </li></ol> 4. Lateral Jochbein Plattenentnahme <ol><li> Entfernen Sie das Jochbein Platte einen Seite zu einem Zeitpunkt. Entweder Jochbein Platte zuerst entfernt werden. </li><li> Von einer ventralen Sicht brechen die Oberkiefer schlechter als die Jochbogen bis zum Bruch der Jochbogen erreicht. </li><li> Von einer dorsalen Sicht vorsichtig greifen die Jochbogen und heben Sie Vorderkante und den seitlichen. Wenn das Jochbein Platte ist immer noch zu jedem Gewebe befestigt ist, nehmen Sie die feinenZange und sanft die Verbindungen trennen, zwischen dem Gewebe und dem Knochen. </li><li> Wiederholen Sie für die Jochbein Platte auf der anderen Seite der Nase. </li></ol> 5. Orbit Knochen Removal <ol><li> Von einer ventralen Sicht brechen die Knochen palantine zwischen den Backenzähnen der Nase. </li><li> Verwenden Sie die Zange, um die 3 Backenzähne und der Oberkiefer auf jeder Seite der Nase zu brechen. </li><li> Brechen und entfernen Sie alle verbleibenden dicke Stücke von Knochen ventralen und posterioren den Nasenmuscheln auf jeder Seite der Nase. </li></ol> 6. Siebbeins Removal <ol><li> Brechen Sie einen beliebigen Teil der Siebbein vorstehende kaudal der Nasenmuscheln. Dies ist notwendig, um den Verlust der Nasenmuschel Gewebe zu vermeiden beim Abnehmen dünne Stücke des Siebbein Abdecken der Nasenmuscheln. </li><li> Für die rechte Seite der Nase, legen Sie die feinen Pinzette an der vorderen Kante des Siebbein und sanft entfernen. Wenn ein Teil des Knochens bleibt, wiederholen Sie den Vorgang, bis alleder dünne Knochen bedeckt die Nasenmuscheln entfernt wurde. Die Nasenmuscheln nicht brauchen, um in den meisten Präparaten entfernt werden. In alten Mäusen, wird der Siebbeinplatte spröde. Wenn Kryoschneiden der nasalen Gewebe benötigt wird, entfernen Sie kleine Stücke von der Platte mit feinen Pinzette, um den möglichen Schaden durch die Knochen zu reduzieren. </li><li> Wiederholen Schritt 6.2) für die linke Seite der Nase. </li><li> Entfernen Sie alle restlichen Knochenfragmente vor dem Schneiden. Hinweis: bei Tieren mehr als ein Jahr alt, der posterodorsal Bereich des Septum Knochen ist etwas dick und hart. Man kann diesen Teil entfernen mit feinen Pinzette. Führen Sie die Spitze der Zange in beiden Seiten des Knochens an die dorsale Abschnitt des Septum Knochen und dem Futter Epithelgewebe trennen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Knochen zu greifen und halten Sie die Probe. Verwenden Sie eine andere Pinzette, um den oberen knöchernen Teil aus dem unteren Teil der knorpeligen Nasenscheidewand brechen und entfernen Sie sie. </li></ol><ol><li> Richten Sie den Sauger Vakuumpumpe. </li><li> Legen Sie die Nase in einer Einbettform. Tauchen Sie die Nase in OCT Medien. </li><li> Verwenden Sie einen Staubsauger, um Luftblasen in der Nase Gewebe gefangen zu entfernen. Dieser Vorgang dauert bis zu 5 min. </li><li> Nach Entfernen von Luftblasen, stellen das Gewebe in der gewünschten Orientierung. </li><li> Frieren Sie das OAT und Gewebe in der Form unter Verwendung von Trockeneis. Das eingebettete Gewebe kann dann sofort kryogeschnitten oder bei -80 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ol>

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R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier haben wir gezeigt, eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Isolierung von intakten olfaktorischen und respiratorischen Gewebe aus der Maus Nase durch sequentielles Entfernen der umgebenden Knochen unter Schonung des Gewebes unterhalb. Wir zeigen, dass eine sorgfältige Entfernung von Knochen können sogar die zartesten Gewebe in ihrer Gesamtheit zu bewahren. Wir teilen auch Einblick in mögliche Modifikationen dieser Technik, in denen wir isolieren sowohl das Gehirn und Nase Gewebe zusammen, um die Nerven zu bewahren Verbindung. Das neue Verfahren stellt ein Mittel zur Isolierung gesamten Geruchs-und respiratorischen Gewebe in einem einzigen Exemplar zur weiteren Verarbeitung in immunhistochemischen RNA in situ Hybridisierung und physiologische Experimente. Vorteile der Knochen Removal Vor unserer Methode wurden Entkalkungsmitteln normalerweise verwendet, um Knochen für Gewebe Schnitte und Immunhistochemie erweichen. In Abhängigkeit von der Größe des Knochens und dem Alter der Tiere, Entkalkungkann ein langwieriger Prozess, der Gewebe Inkubation in Knochen Entkalker für Stunden oder sogar mehrere Tage 29,30 sein. Die Agenten häufig verwendete auch enthalten Säuren, die Auswirkungen auf das Gewebe, das zu ändern oder zu behindern Immunomarkierung 29,30 haben. Um dies zu bekämpfen, verwenden einige Forscher Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung von Calcium-Ionen aus dem Knochen 24,26-28 maskieren. Diese Methode der Entkalkung erfordert auch Tage. Die Präparation gezeigt hier in ca. 20-30 min durchgeführt werden und erfordert nicht die Anwendung von chemischen Lösungen, die Anfärbbarkeit des Gewebes verändern können. Unser Verfahren kann auch verwendet werden, um intakte Nasengewebe von frisch präparierten Nasen erhalten, was einen Vorteil für den Erhalt von lebendem Gewebe für physiologische Aufnahmen werden. Beispielsweise werden Nase Scheiben üblicherweise für Ca 2 +-Imaging von OSNs und Stützzellen im olfaktorischen Epithel 31,32. Diese Scheiben müssenhergestellt aus neugeborenen Mäusen vor den Knochen umgebenden Gewebe verhärtet. Allerdings sind bei Neugeborenen Exemplare nicht identisch mit Erwachsenen, weil die olfaktorischen Epithel weiterhin Entwicklung und Reifung postnatal. Mit unserem Verfahren können Forscher intakten olfaktorischen Gewebe von Mäusen älter als Neugeborene im Alter zu erhalten. Dies stellt einen erheblichen Vorteil, vor allem in den Studien von altersbedingten Veränderungen. Änderungen und Fehlerbehebung Wir zeigten eine effektive Sequenz zu den umliegenden Knochen zu entfernen. Allerdings gibt es andere Sequenzen von Knochen Entfernung zu intakten Nasalgewebe zu erhalten, und die Schritt für Schritt nachvollziehen kann verändert werden, je nach den individuellen Bedürfnissen der Forscher und den Geweben von größtem Interesse sein. Zum Beispiel, wenn die Vomeronasalorgan benötigt wird, sollte die vomer Knochen früh in dem Verfahren entfernt werden, weil es mehr Knochen bedeckten Bereiche zu erfassen, um das Gewebe an der gewünschten Stelle während des Entfernens zu halten sind. Durch Anpassungting die Prozedur für jede Anwendung sind Gewebe von Interesse eher zu bleiben für die weitere Verarbeitung intakt. Die nasalen Knochen in der Regel auch schwer zu entfernen, da das Gewebe unterhalb klammert sich an den Knochen und wird oft reißen, wie die Knochen entfernt werden angehoben. Zusätzlich zu wackeln die nasalen Knochen, wie in dem Video zu sehen, können kleine Pinzette vorsichtig zwischen dem Nasenbein und das darunter liegende Gewebe zu helfen, bewegen das Gewebe nach unten und weg von den Knochen während der Entfernung eingesetzt werden. Die Präparation auch variiert leicht je nach dem Alter der Mäuse. Bei jungen Mäusen, neigen die Knochen weicher zu sein, während die Knochen von älteren Mäusen mehr spröde sind und stark auf benachbarte Knochen in einigen Regionen verschmolzen. Weiche Knochen ist leichter zu trennen und in kleine Stücke als härtere Knochen entfernen. Dieser Unterschied kann leicht mit einer Pinzette zu punkten oder kratzen an Verbindungen zwischen den Knochen in ihrer Trennung und sauberes Entfernen helfen überwunden werden. Bei älteren Tieren, die posterodorsal region der Nasenscheidewand ist etwas dick und hart und sollte vor Kryoschneiden entfernt werden. Die knöchernen Teil der Scheidewand entfernt, wie in Verfahren 6.4 beschrieben. Zwar gibt es kleine Unterschiede in der Präparation für ältere und jüngere Mäuse sind, ist das Alter kein limitierender Faktor. In unseren Studien haben wir erfolgreich intakt Nasalgewebe von Mäusen im Bereich von 14 Tagen bis zu zwei Jahre alt vorbereitet. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Sezieren Schritte für Fixativ fixierten Nase und für frische Nase, obwohl die frischen Gewebe ist weicher und erfordert mehr Vorsicht Manipulation. In beiden Präparaten, halten das Gewebe befeuchtet während der Präparation ist wichtig. Es ist nicht notwendig, um die frische Gewebedissektion in Kochsalzlösung durchzuführen, jedoch periodisch Eintauchen des Gewebes in Tyrode-Lösung oder Tropfen der Lösung auf das Gewebe während zerlegt ist kritisch, da es hält das Gewebe befeuchtet und Nährstoff zugeführt seine v aufrechtzuerhaltenAFTUNG. Das hier vorgestellte Verfahren kann weiter modifiziert werden, um Knochen Entfernung, die sowohl das Gehirn und Nase intakt in einem einzigen Exemplar (2B) verlässt gehören. Diese Modifikation schont die Nervenverbindungen zwischen dem Gehirn und Nase, dass Durchlauf durch die Siebplatte. Mehr technische Geschick und Zeit für diese Präparation als die Nase allein erforderlich. Jedoch unter Beibehaltung der Verbindungen aus der Peripherie an das Gehirn ermöglicht eine vielfältige Anwendungen dieser Methode. Einschränkungen Wir haben diese Methode verwendet, um nasale Gewebe für eine Reihe von Studien, einschließlich immunhistochemischer Markierung und mRNA in situ Hybridisierung Analyse vorzubereiten, und haben erfolgreich viele Proteine ​​in Signalwegen, gefärbte Zelle Marker in verschiedenen Zellpopulationen beschriftet und morphologische Merkmale untersucht und Zellverteilung durch die Nasenhöhle 16,17,36-39. Wir haben nicht experience Einschränkungen in Kryoschneiden und Immunomarkierung. Für Studien, die Kryoschneiden der erweiterten Vorbereitung, die das Gehirn und Nasengewebe in einem einzigen Exemplar verbunden hält benötigen, empfehlen wir die Mäuse jünger als 4 Monate zu verwenden, da in älteren Mäusen die spröde Siebbeinplatte können Gewebeschäden beim Schneiden zu erstellen. Doch für frisches Gewebe für elektrophysiologische Aufnahmen bestimmt, sind die medialen Gewebe zwischen Nasenmuscheln nicht leicht zugänglich in der whole mount Vorbereitung. Entfernen von kleinen Stücken von Gewebe oder Aufspaltung in diskrete Bereiche kann das Problem zu überwinden. Da herkömmliche elektro-olfactogram an der medialen Oberfläche von Endo-Nasenmuscheln 25,33,34 gemacht wird, kann unsere Gewebeaufbereitung Aufnahmen aus anderen Regionen mit wenigen Handgriffen ermöglichen. Anwendungen jenseits Immunhistochemie Viele Anwendungen des Verfahrens für diejenigen, die die Technik beherrschen existieren. Mögliche applicatIonen sind zonale Studien über olfaktorische und Atemwege Gewebe, die mit anderen Methoden, schwierig gewesen, erhalten intakt und in ihrer ursprünglichen anatomischen Konfiguration. Anwendungen auch für die Elektrophysiologie existieren, weil gleichzeitig mit mehreren Aufnahmen auf ganze, frische Gewebe. Einige dieser Anwendungen, die nur schwer zu erfüllen in einem der vorhandenen Techniken waren, werden durch unsere Zerlegung Verfahren. Ferner kann dieses Protokoll auch auf biochemische, genomische und Proteom-Studien, die im Einklang Probenentnahme erfordern in verschiedenen Regionen für kritischen Vergleich angepaßt werden. Zusammenfassend haben wir ein Verfahren, um schnell und zuverlässig zugreifen olfaktorischen und respiratorischen Gewebe in der Maus Nase durch Entfernen der umgebenden Knochen entwickelt. Diese Methode hat wesentliche Vorteile gegenüber gängigen Techniken wie Entkalkung. Ferner erfordert unsere Methode keine chemische Behandlung, daher Gewebe sind nicht für den Einsatz in immunohistochemist begrenztry Experimente können aber auch anwendbar für in-situ-Hybridisierung und physiologischen Studien. So ist unsere Methode ein schneller, direkter Weg, um die Maus Nase für die weitere Verarbeitung vorzubereiten. Wir erwarten, dass unsere Methode olfaktorischen und respiratorischen Studien in nasalen Regionen zu erleichtern.

Der Säuger Nasenhöhle umfasst verschiedene Arten von Geweben und Organen, die unterschiedliche Funktionen erfüllen. Die Nasenhöhle bildet den Eintrag des oberen Atemwege, der Luftfahrt kann in die und aus der Lunge. Inhalierten Luft durch die Nasenhöhle, wo es einer Temperatur-und Luftfeuchtigkeits-1 sowie die Reinigung oder Filterung reizende und toxische Stoffe und infektiöse Mikroorganismen 2 zu entfernen. Beide Behandlungen werden von nasalen Epithelien und subepithelialen Gewebe, einschließlich Drüsen und Gefäßen durchgeführt und sind entscheidend für den Schutz der unteren Atemwege und die Lunge. Zusätzlich zu seiner Rolle in der Atmung und epithelialen Abwehr, die nasale Gewebe enthält auch periphere sensorische Geräte der Geruchs-und Trigeminus-Systeme, die eine breite Palette von chemischen Substanzen zu erkennen in der durchströmenden Luft. Je nachdem, welches System aktiviert ist, können sensorische Erkennung von Chemikalien in der Nase zu entlocken entwederein Gefühl der Geruch, Reizung oder Schmerzen 3,4. Die periphere olfaktorische System ist komplex und besteht aus mehreren anatomisch getrennt olfaktorischen Sinnesorgane innerhalb der Nasenhöhle gemacht. Unter ihnen ist die wichtigste olfaktorischen Epithel (MOE) die größte, die bis macht etwa 45-52% der nasalen Epithelien in Nagetieren 5 und wird in der hinteren Region. Im anteroventral Region, gibt es ein Paar von röhrenförmigen Strukturen Vomeronasalorgan 6, die entlang jeder Seite der Nasenscheidewand sitzen bekannt. Zwei weitere kleine Gruppierungen von Riechzellen, als Septalorgan von Masera 7,8 und dem Gruneberg Ganglion 9 bekannt, wohnen zusammen das ventrale Septum und die dorsale Eingangsbereich der Nasenhöhle, beziehungsweise. Diese peripheren Organen enthalten Neuro-Epithelien mit Besonderheiten in der Morphologie, Zell-Marker Expression und physiologische Funktion. Gemeinsam erkennen sie Tausende von GerüchenMoleküle mit exquisiten Empfindlichkeit 10-12. Zusätzlich zu den olfaktorischen Organe, die Nasenhöhle beherbergt auch andere Sinnesorgane. Es ist bekannt, dass peptiderge Trigeminus Fasern in der Nasenschleimhaut, insbesondere das respiratorische Epithel 13,14 sind. Einige dieser Fasern erkennen reizende und giftige Chemikalien und sind verantwortlich für die Initiierung Schutzreflexe wie Husten und Niesen 4,15. Reizt Geruchs-und Bitterstoffe kann auch durch eine kürzlich entdeckte Population von einsamen chemosensory Zellen (SCC), von denen viele von Trigeminus Fasern 16-19 innerviert werden erkannt werden. Diese SCCs sind in höherer Dichte im Eingangsbereich der Nasenhöhle und vomeronasal Eintrag Leitungen befindet, deutete an, dass sie auch dazu dienen, eine Schutzfunktion 16-18. Somit kann Nasenepithelien wesentlichen unterscheiden sich in Funktion, Morphologie und Zell-Zusammensetzung in Abhängigkeit von ihreranatomischen Stellen. Selbst innerhalb eines einzelnen und spezialisierten Epithel, gibt es regionale Unterschiede. Die MOE ist ein solches Beispiel. Die MOE-Linien verschiedene Nasenmuscheln, die kompliziert und sind gewellt Strukturen. Wegen ihnen verschiedenen Regionen der MOE Erfahrung unterschiedlichen Luftmengen und somit unterschiedliche Diffusion und Clearance-Raten in der Luft Geruchsmoleküle 20. Es ist auch bekannt, dass Riechneuronen (OSN) Expression eines bestimmten Geruchsstoff-Rezeptor in einer von vier Zonen umgangen der MOE 21,22 befinden. Wie dieser Unterschied wirkt Lage eines OSN Antwort auf Duftstoffe weitgehend nicht bekannt. Darüber hinaus zeigen einige OSN Populationen regionalen Vorlieben. Guanylylcyclase-D (GC-D)-exprimierenden OSNs haben zonale Ausschüttungen zugunsten der Cul-de-sac Regionen der ectoturbinates 23,24. In jüngerer Zeit fanden wir eine Subpopulation von kanonischen OSNs die transient receptor potential Kanal M5 drückt (trpM5) und wird vorzugsweise in der lateralen und ventralen Bereiche 25 befinden. Diese Ergebnisse zeigen, dass MOE ist nicht einheitlich. Allerdings ist, wie diese regionalen Unterschiede olfaktorischen Codierung beeinflussen nicht verstanden. Dies ist zum Teil, weil gründliche physiologische Untersuchung der MOE und die Nase ist durch die Schwierigkeiten bei der Beschaffung intakt Nasenepithelien mit erhaltenen anatomischen Organisation mit aktuellen Methoden beschränkt. Die Nasenepithelien werden überwiegend von den vorderen Knochen des Schädels, einschließlich der nasalen, Oberkiefer, Palatin, Jochbein und ethmoid Knochen umgeben. Bei erwachsenen Mäusen und anderen Nagetieren Modelle, sind diese Knochen hart und schwierig, ohne eine Beschädigung der in enger Beziehung Nasengewebe, insbesondere die empfindliche Nasenmuscheln entfernen. Oft wird auf chemischer Basis zur Entkalkung Knochen erweichen, damit Kryoschneiden von Nasalgewebe für morphologische, immunhistochemische und in situ Hybridisierung Studien, jedoch Abhängigkeitding auf dem Alter des Tieres, kann die Entkalkung dauern über Nacht bis zu 7 Tage 24,26-28. Diese Behandlung ist auch begrenzt, da es erfordert Gewebes Fixiermittel erhalten. Darüber hinaus können chemische Entkalkung hart sein und Einfluss auf die Immunmarkierung von einigen empfindlichen Antikörper 29,30. Aus physiologischen Studien wird lebendes Gewebe erforderlich, und somit diese Versuche sind oft auf isolierte OSNs oder MOE Scheiben von Neugeborenen, deren Schädelknochen sind dünn und weich 17,31,32 erzielt worden. Physiologische Untersuchungen können auch nutzen whole mount Präparaten durch Spaltung des Kopfes 25,33,34, aber in der Regel nur die mediale Oberfläche der Nase ist leicht zugänglich, die Begrenzung physiologischen Aufnahmen auf anderen Gebieten. Hier beschreiben wir eine wirksame, manuelle Methode zur Zerlegung intakt Nasalgewebe mit erhaltenen ursprünglichen anatomischen Organisation und Morphologie vorzubereiten. Wir nacheinander entfernen Sie die wichtigsten Knochen des vorderenSchädel unter einer Dissektionsmikroskop eine fast völlig intakt Nasenepithel aussetzen, während die dünnen Nasenmuscheln intakt, es sei denn die Mäuse sehr alt sind und Kryoschneiden benötigt wird. Wir verlängern auch die Methode, um die Verbindung zwischen den nasalen Gewebe und Riechkolben, sowie den Rest des Gehirns zu erhalten und ermöglicht so die gleichzeitige Prüfung von sowohl peripheren und zentralen Schaltungen. Unsere Methode kann verwendet werden, um vorzubereiten Paraformaldehyd-fixierte, sowie frische, Live Nasengewebe werden. So ist unsere Methode zu erwarten morphologische, immunhistochemische und physiologische Untersuchungen der Atmung, Geruchssinn und nasal Schaden und Krankheit zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501333</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 3 </td><td>WPI</td><td>503235</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 55</td><td>WPI</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont AA</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11210-20</td><td></td></tr><tr><td>Specimen forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>WPI</td><td>501753</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors, Straight</td><td>Miltex</td><td>V95-304</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tissue embedding&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Plastic embedding mold</td><td>VWR</td><td>15160-215</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator vacuum pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-960-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Section staining &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutral red</td><td>ACROS Organic</td><td>CAS 553-24-2</td><td>Nuclei staining</td></tr></tbody></table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

Das Säugetier Nase ist ein multifunktionales Organ mit komplizierten inneren Strukturen. Die Nasenhöhle ist mit verschiedenen Epithelien wie Geruchs-, Atmungs-und Plattenepithel die sich deutlich in anatomischen Stellen, Morphologie und Funktionen ausgekleidet. Bei erwachsenen Mäusen wird die Nase mit verschiedenen Schädelknochen bedeckt, die Begrenzung experimentellen Zugang zu den internen Strukturen, vor allem diejenigen in der hinteren wie die wichtigsten olfaktorischen Epithel (MOE). Hier beschreiben wir eine effektive Methode zur Gewinnung fast die gesamte und intakte Nasalgewebe mit erhaltenen anatomischen Organisation. Mit chirurgische Instrumente unter einem Binokular, wir nacheinander entfernen Sie die Schädelknochen rund um die Nasen-Gewebe. Dieser Vorgang kann auf beiden Paraformaldehyd-fixierten und frisch seziert, gehäutet Maus Köpfe durchgeführt werden. Der gesamte Vorgang dauert Zerlegung etwa 20-30 min, die deutlich kürzer als die experimentelle Zeit für herkömmliche chemische-basierten de erforderlich istVerkalkung. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, um Luftblasen zwischen Nasenmuscheln, die kritisch für den Erhalt intakter dünnen horizontalen oder koronalen oder Sagittalschnitten vom Nasengewebe Vorbereitung ist gefangen zu entfernen. Nasal Gewebe unter Verwendung unserer Methode kann für whole mount Beobachtung des gesamten Epithelien sowie morphologische, immunozytochemische, RNA in situ Hybridisierung und physiologische Studien verwendet werden, insbesondere in Studien, in denen regional spezifische Prüfung und Vergleich von Interesse sind.

Mit dieser Methode können wir zuverlässig erhalten fast vollständig intakt Nasengewebe. 2A zeigt ein Bild von erwachsenen nasal Probe aus einem Paraformaldehyd-fixierten Kopf. In dieser Probe sind alle vier Sub-olfaktorischen Sinnesorgane, einschließlich der MOE, Septalorgan, die Gruneberg Ganglion und VNO, intakt. Außerdem sind die Atemwege Epithelien und subepithelialen Gewebe, wie Drüsen und Gefäße erhalten. Wir haben erfolgreich diese Methode in einer Reihe von Studien, in denen wir untersucht Morphologie, Verteilung, Nerven Innervation und Zell-Marker-Expression in verschiedenen spezialisierten sensorischen Zellpopulationen 16,17,36-38 verwendet. 2B zeigt ein Exemplar mit dem Gehirn, Riechkolben, und Nase zusammen. Diese erweiterte Vorbereitung ist besonders nützlich in Studien, die Verbindung zwischen Nerven des peripheren und zentralen olfaktorischen Systeme erfordern. Wir haben diesen Probe durch Entfernen der Schädelknochen surrounding das Gehirn vor dem Entfernen von Gesichts-Knochen. Unser erweitertes Verfahren ermöglicht Ermittler Experimente sowohl peripheren und zentralen olfaktorischen Systems führen in einem einzigen Vorbereitung. Die nasale Gewebe in 2 gezeigt kann whole-mount Beobachtung sowie zur Herstellung von Gewebeschnitten verwendet werden. 3A zeigt einen horizontalen Schnitt Schnitt durch die beiden MOE und respiratorischen Regionen. 3B zeigt einen koronalen Abschnitt in der Mitte durch der MOE. Wir befleckt die Abschnitte mit Neutralrot für eine bessere Sicht der verschiedenen Arten von Epithel-und submuköse Strukturen an unterschiedlichen anatomischen Stellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass unsere Technik auch die empfindliche MOE Nasenmuschel Struktur und anatomischen Organisation der Nase, die umfassende und vergleichende Untersuchung der nasalen morphologische und funktionelle Veränderungen unter normalen und pathologischen Bedingungen zu ermöglichen bewahrt. <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Isoliert Nasen-und Hirngewebe A:.. Dorsale Ansicht des intakten Nase Gewebe seziert die Benutzung unserer Zerlegung Methode B:. Dorsale Ansicht einer Nase und Gehirn mit neuronalen Verbindungen zwischen den zentralen und peripheren olfaktorischen Systeme intakt <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig2large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig3highres.jpg"/> Abbildung 3. Abschnitte Nasalgewebe A:.. Ein horizontaler Schnitt, olfaktorischen und respiratorischen Epithelien sowie andere nasale Strukturen B: Frontalschnitt durch die Nasenmuscheln of die MOE in dem hinteren Teil der Nase. Beide Abschnitte waren 14 um dicke und gefärbt mit Neutralrot MOE:. Hauptstraße olfaktorischen Epithel RE:.. Respiratorischen Epithel <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Eine effektive Methode, um Manuelle Zerlege Intact Maus Nasengewebe mit erhaltener Anatomische Organisation vorbereiten

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

an-effective-manual-deboning-method-to-prepare-intact-mouse-nasal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K Aufrufe.  University of Maryland Baltimore County. 

Serie: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Multielektroden Array Recordings der Vomeronasal Epithel

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

Überprüfung der Rolle der Nasopharynx-assoziierte lymphoide Gewebe (NALT) in Maus auf Impfstoffe

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

Immunologie und Infektion

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Entwicklungsbiologie

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Ganze Berge Kennzeichnung von Cilia im Hauptriechsystem der Mäuse

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.