Diese Arbeit wurde von der National Medical Research Council, Singapore finanziert.

1. Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus <ol><li> Vor der Kennzeichnung Reaktion zu reinigen Dengue-Virus mit Saccharose-Kissen und bereiten die notwendigen Reagenzien und Geräte wie im Protokoll angegeben. </li><li> Bereiten Sie frische 0,2 M Natriumbicarbonat-Puffer, pH 8,5 (Kennzeichnung Puffer) und 1,5 M Hydroxylamin, pH 8,3 (Stop-Reagenz), kurz bevor die Kennzeichnung und Filter mit 0,2 um Spritzenfilter sterilisieren. </li><li> Verdünnen Sie ca. 3x10 8 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) von gereinigtem Dengue-Virus in 1 ml Kennzeichnung Puffer in einem 2 ml Tube. Dies kann anteilig für Batch-Kennzeichnung von Virus skaliert. </li><li> Das lyophilisierte Alexa Fluor 594 (AF594) Succinimidylestern bis 1mm in der Kennzeichnung Puffer unmittelbar vor der Etikettierung Reaktion. Andere Fluorochrome aus der Alexa Fluor Farbstoff-Serie können je nach eigenen Bedürfnissen eingesetzt werden. Minimierung der Exposition gegenüber von diesem Schritt ab Licht. </li><li> Add 100 &amp;mgr; der 1mM AF594 Farbstoff der verdünnten Virus unter leichtem Rühren mit der Pipettenspitze. </li><li> Inkubieren Sie die Kennzeichnung Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln. Mix von sanften Kipps alle 15 Minuten. </li><li> Drehen Sie das Rohr kurz in einer Tischzentrifuge und fügen 100 &amp;mgr; von Stop-Reagenz, um die Reaktion Mischung unter leichtem Rühren mit der Pipettenspitze. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln. Mix von sanften Kipps alle 15 Minuten. </li></ol> 2. Purifying Alexa Fluor markierte Dengue-Virus <ol><li> In der Zwischenzeit Gleichgewicht der Reinigung Säule mit Puffer der Wahl. In diesem Versuch wird ein PD-10 Säule mit 25 ml HNE-Puffer (5 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA), pH 7,4, vor Gebrauch. </li><li> Übernehmen der markierten Virus an die Spitze der Säule und sammeln Sie die Flow-Through einmal die markierten Virus in der Matrix. Füllen Sie die Spalte mit HNE-Puffer, wenn alle markierten Virus der Matrix eingetragen hat. Verwerfen Sie den ersten 2,5 ml Flow-Through und sammeln Sie die nächsten 2 ml des markierten Virusfraktion. </li><li> Aliquotieren und lagern gereinigt AF594 gekennzeichnet Dengue-Virus in -80 ° C, weit weg von der Lichtquelle. </li></ol><ol><li> Tauwetter ein Aliquot und bestimmen den Titer der markierten Virus durch Plaque-Assay bevor Sie das Batch-markierter Virus. </li><li> Seed 5x10 4 pro Vertiefung von Vero-Zellen, in M-199 Wachstumsmedium, in einem 4-Well-Platte mit einem Deckglas auf dem Boden des gut einen Tag vor der Infektion. </li><li> Entfernen Sie den Kulturüberstand in gut und infizieren die Zellen mit Multiplizität der Infektion von 1 des markierten Virus in 100 &amp;mgr; l Volumen (verdünnt in M-199 Wartungs-Medium bei Bedarf) für 10min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Impfkulturen und waschen Sie die Deckgläser zweimal in 1xPBS. </li><li> Fix die Zellen in 3% paraformalydehyde für 30 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in 1xPBS. </li><li> Permeabilisieren die Zellen mit Permeabilisierung Lösung mit 0,1% Saponin und 5% BSA in 1xPBS für 30 Minuten. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit unverdünntem Zentrifugation-geklärte Überstand von 3H5 monoklonaler Antikörper Hybridom-Kultur für 1 Stunde in einer feuchten Kammer, vor Licht geschützt. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in Waschpuffer (1xPBS mit 1mM Calciumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1% Saponin). </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit AF488 Anti-Maus-IgG-Antikörper, 1:100 in Permeabilisierung Lösung verdünnt, für 45 Minuten in feuchten Kammer, vor Licht geschützt. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in Waschpuffer und spülen Sie einmal in deionisiertem Wasser. </li><li> Dab den Rand des Deckglases gegen ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser abtropfen lassen und Montage auf Glasträger mit 8μl Mowiol 4-88 mit 2,5% Dabco. </li><li> Lassen Sie die Montage-Lösung über Nacht eingestellt bei 4 ° C vor der Anzeige mit einem Zeiss-konfokalen Mikroskop. Sequential Akquisitionen sollte spannend Fluorophor in einer Zeit, und das Umschalten zwischen den Detektoren gleichzeitig durchgeführt werden. </li><li> Die Bilder werden dann für die Co-Lokalisierung des E-Proteins Antikörper-Färbung mit den markierten Virus mit dem Zeiss LSM Zen-Software auf den Grad der Kennzeichnung Schätzung analysiert. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für die Ausbeute an Dengue-Virus mit AF594 Farbstoff markiert ist in Abbildung 2 dargestellt. Normalerweise sollte weniger als 10-fach Drop von der ersten Titer nach erfolgreicher Kennzeichnung eingehalten werden. Allerdings ist anzumerken, dass alle Puffer bereit für die Kennzeichnung, erfolgreich zu sein und die Alexa Fluor Succinimidylestern sollte sofort nach der Rekonstitution verwendet werden, da sie hydrolysieren in reaktiven freien Säuren in wässrigen Lösungen 8 frische werden müssen. Als nächstes muss der markierten Virus, um eine ausreichende Fluoreszenz vor der Verwendung in Experimenten überprüft werden. Eine einfache Immunfluoreszenztest auf Vero-Zellen durchgeführt und der Grad der Etikettierung können von der Co-Lokalisation des markierten Virus mit Anti-E-Protein Antikörper-Färbung abgeschätzt werden. Trennenal-Zellen wurden untersucht und eine typische konfokale Abbildung ist in Abbildung 3 dargestellt. Co-Lokalisation Analyse der Bilder mit der LSM Software Zen gezeigt überlappen Koeffizienten zwischen 0,65 bis 0,8, was darauf hindeutet, dass etwa 65 bis 80% der Virionen mit dem Farbstoff markiert wurden. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1.Die Schema der Darstellung der Alexa Fluor Farbstoff Kennzeichnung von Dengue-Virus Verfahren. Erstens, die relevant Puffer und gereinigt Dengue-Virus vorbereitet sind. Die Alexa Fluor Farbstoff rekonstituiert und hinzugefügt, um die Dengue-Virus in der Kennzeichnung verdünnt. Die Reaktion wird dann 1 Stunde später mit der Zugabe von Stop-Reagenz beendet. Anschließend wird der markierte Virus durch eine Größenausschluss-Säule gereinigt, um freie Farbstoff zu entfernen. Schließlich ist die Bezeichnung Virus durch Plaque-Assay erneut titriert und getestet für die Fluoreszenz. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Mittlere Anzahl der lebensfähigen Virionen (pfu / ml) als auf einem Plaque-Assay vor und nach AF594 Kennzeichnung bestimmt. Ein Aliquot des AF594 gekennzeichnet Dengue-Virus wird aufgetaut und wieder titriert mittels Plaque-Assay und es zeigt typischerweise weniger als 10-fach Drop aus der Ausgangspunkt Titer. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von Duplikaten. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Co-Lokalisation von AF594 Etiketten mit Dengue-Virus E-Proteine ​​in Vero-Zellen. Zellen auf Deckgläsern gewachsen Vortag wurden mit AF594 gekennzeichnet Dengue bei MOI von 1 für 10 Minuten bei 37 ° C infiziert Anschließend wurden die Zellen fixiert und mit anti-E-Antikörper, untersucht und für Kolokalisation von E-Protein (grün) und AF594 Kennzeichnung (rot). Fluoreszenzsignale wurden visualisiert unter 63X Vergrößerung mit Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop. Scale-Bar ist 10 um. Gelb zeigen Bereiche von Kolokalisation, wie im Kasten dargestellt.

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

Obwohl AF594 Farbstoff in diesem Bericht verwendet wurde, ist eine breite Palette von Fluorophoren in der Alexa Fluor Succinimidylestern Serie mit ähnlichen Kennzeichnung Chemie. Dies könnte zu verlängern die Kennzeichnung Anwendung über Bildgebung. Die Durchflusszytometrie kann als Alternative zur konfokalen Mikroskopie für die Einschätzung des Grades der Kennzeichnung für Fluorophore, die angeregt und detektiert werden durch die FACS-Maschine verwendet werden kann. Alexa Fluor-Farbstoffe sind kleine Moleküle, die mit freien Aminogruppen, vor allem Arginin und Lysin 9, in der Regel nach außen gerichteten Rückstände von Proteinen reagieren. In unserem Labor, Konjugation von Dengue-Virus mit 100 &amp;mgr; von Alexa Fluor 594 Farbstoff versehen ausreichende Helligkeit für die Bildgebung mit einem minimalen Verlust in der Virustiter. Unterschiedliche Helligkeit kann durch Variation der Konzentration der verwendeten Farbstoff erreicht werden. Allerdings kann die Erhöhung der Farbstoff-Konzentration zu senken Virus Lebensfähigkeit 7,10. Eine mögliche Einschränkung ist die Einmischung in die Rezeptor-Bindung durch die Blockade des Zugangs der Fluorophore. Deshalb, je nach Anwendung, sollte ein optimales Niveau der Etikettierung fest entschlossen, ein Gleichgewicht zwischen dem Grad der Kennzeichnung und funktionelle abrogation10 zu gewährleisten. Sie weisen darauf hin, dass die Konzentration auch durch die post-Verpackungen Reaktivität des Alexa Fluor Succinimidylestern 8 betroffen sein. Die direkte Markierung von Dengue-Virus mit Alexa Fluor Farbstoff hier vorgestellten erfordert keine zusätzliche Kennzeichnung vor, um den Virus zu visualisieren, so dass die Möglichkeit von nicht-spezifische Färbung von indirekten antiviralen Antikörpern. Es ermöglicht auch die Echtzeit-Verfolgung von Post-Internalisierung Ereignisse im Live Cell Imaging. Diese Methode ist relativ einfach, und weil die Konjugation ist stabil, es kann verwendet werden, um zu produzieren und zu speichern Batch-markierten Virus für mehrere Versuche, um lipophile Fluoreszenzfarbstoffe, wie langkettige carbocyanine1 ,1-Dioctadecyl-3, 3 entgegengesetzt werden, 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (DID) oder Styryl-Farbstoffe, die in der Kälte nicht länger als 3 Tage gelagert werden kann.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 Succinimidylestern </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 Säule </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Well-Platte </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> Sail Marke </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 Hybridom </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1st Base </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Zur Vorbereitung M-199 Wachstumsmedium, fügen Sie 50 ml FBS, 5 ml Natriumpyruvat und 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren zu 500ml M-199, sterile Filter. Zur Vorbereitung M-199 Wartungs-Medium, fügen Sie 15 ml FBS, 5 ml Natriumpyruvat und 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren zu 500ml M-199, sterile Filter.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

Die frühen Ereignisse bei der Interaktion zwischen Virus und Zelle kann großen Einfluss auf das Ergebnis der Infektion haben. Ermittlung der Faktoren, die diese Interaktion beeinflussen könnten zu einem besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankung führen und damit Einfluss Impfstoff oder therapeutische Design. Daher wäre die Entwicklung von Methoden, um diese Wechselwirkung Sonde nützlich sein. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung Fluorophore 1-3 und Imaging-Technologie 4 kann ausgenutzt werden, um unserem derzeitigen Kenntnisstand auf Dengue Pathogenese zu verbessern und somit den Weg zu den Millionen von Dengue-Infektionen, die jährlich zu reduzieren. Der umhüllte Dengue-Virus verfügt über eine externe Gerüst, bestehend aus 90 Hüllglycoprotein (E)-Dimere Schutz der Nukleokapsid Schale, die eine einzelne positive Strang-RNA-Genom 5 enthält. Die identische Protein-Untereinheiten auf der Virusoberfläche können somit mit einem Amin reaktiven Farbstoff markiert und visualisiert werden durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Hier präsentieren wir eine einfache Methode zur Kennzeichnung von Dengue-Virus mit Alexa Fluor Succinimidylester Farbstoff direkt in einem Natriumbicarbonatpuffer, die sehr tragfähig Virus nach der Kennzeichnung ergab aufgelöst. Es gibt kein standardisiertes Verfahren für die Kennzeichnung von lebenden Virus und bestehenden Protokoll des Herstellers für Protein-Kennzeichnung erfordert in der Regel die Wiederherstellung der Farbstoff in Dimethylsulfoxid. Die Anwesenheit von Dimethylsulfoxid, selbst in kleinsten Mengen, blockieren kann produktive Infektion von Viren und induzieren auch Zell-Zytotoxizität 6. Der Ausschluss von der Verwendung von Dimethylsulfoxid in diesem Protokoll somit reduziert diese Möglichkeit. Alexa Fluor Farbstoffe überlegen Photostabilität und sind weniger pH-empfindlicher als die gemeinsame Farbstoffe wie Fluorescein und Rhodamin 2, wodurch sie ideal für Studien zur zellulären Aufnahme und endosomalen Transport des Virus. Die Konjugation von Alexa Fluor Farbstoff keinen Einfluss auf die Anerkennung der Bezeichnung Dengue-Virus durch Virus-spezifische Antikörper und ihre vermeintliche Rezeptoren in Host-Zellen 7. Diese Methode könnte nützliche Anwendungen in der virologischen Untersuchungen.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Unter Ausnutzung der Fortschritte in der Fluorophor Entwicklung und Imaging-Technologie, eine einfache Methode, Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus entwickelt, um den frühen Interaktionen zwischen Virus und Zelle sichtbar war.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

visualizing-dengue-virus-through-alexa-fluor-labeling

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K Aufrufe.  DSO National Laboratories. Unter Ausnutzung der Fortschritte in der Fluorophor Entwicklung und Imaging-Technologie, eine einfache Methode, Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus entwickelt, um den frühen Interaktionen zwischen Virus und Zelle sichtbar war.

Serie: Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.