Diese Arbeit wurde von einem Hypatia Stipendium der Radboud University Medical Center, ein Career Development Award von der Human Frontier Science Program, die Gravitation Programm 2013 von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO; unterstützt. ICI-024.002.009), ein VIDI gewähren von NWO (ALW VIDI 864.14.001) und einem Starting Grant vom European Research Council (ERC) siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (Grant Agreement Nummer 336479).

1. Vorbereitung der Proben Mikroskop
<ol>
	<li>Ausdruck der Qa-SNARE Syntaxin 4 mit mCitrine (Syntaxin 4-mCitrine; Spender Fluorophor) verschmolzen und die R-SNARE VAMP3 verschmolzen, mCherry (VAMP3-mCherry) Hinweis: Andere Schlingen mit fluoreszierenden Proteinen verschmolzen, deren C-terminalen transmembranen Helices können auch verwendet werden. Statt mCitrine-mCherry kann auch andere Donor-Akzeptor-Paare von Spektral getrennte Fluorophore verwendet (z. B.GFP-YFP).<ol>
		<li>Wachsen Sie HeLa-Zellen und sich teilen Sie 900.000 HeLa-Zellen über drei 35 mm-Durchmesser Glasschalen unten geeignet für die Mikroskopie. Hinweis: Grundsätzlich kann dieses Protokoll für andere eukaryotic Zelle Arten und Mikroskopie Gerichte angepasst werden.<ol>
			<li>Pflegen HeLa Zellkulturen in T75 Fläschchen mit 10 mL hohe Glukose Dulbecco's geändert Eagle Medium (DMEM), ergänzt um 10 % fetalen Kälberserum (FCS) und 1 % Antibiotikum Antimykotikums (mit Amphotericin B, Penicillin und Streptomycin) bei 37 ° C und 5 % CO 2 in einer Zelle Kultur Inkubator.</li>
			<li>Ergänzen das Medium zweimal in der Woche und die Zellen 01:10 aufgeteilt, einmal pro Woche oder wenn die Zellen erreichen 85-90 % confluency zu neuen T75 Fläschchen (500.000 Zellen/Kolben, im Durchschnitt).</li>
			<li>Entfernen Sie der DMEM und waschen Sie HeLa Monolagen zweimal mit 8 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 3 min.</li>
			<li>Entfernen der PBS und 2 mL PBS mit 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA).</li>
			<li>Die Zellen für 5 min bei 37 ° C und 5 % CO2 in Zelle Kultur Inkubator inkubieren und anschließend leicht schütteln der Flasche HeLa-Zellen von der Unterseite des Kolbens zu trennen.</li>
			<li>Spülen Sie die Zellen mit 10 mL des Mediums, übertragen Sie die Aussetzung an eine 15 mL Tube und entfernen Sie eine 10 µL Aliquot für die Zählung zu.</li>
			<li>Verdünnen Sie die Aliquote 1:1 mit 0,4 % Trypan blau Fleck und zählen Sie die Zellen mit einer Bürker Hemocytometer9. Hinweis: Zählen Sie zwei 4 x 4 Quadrate und mehrere Zellzahl von 10.000 für die Anzahl der Zellen/mL.</li>
			<li>Nach Zelle zählen, nehmen 900.000 Zellen aus der 15 mL Tube, teilen Sie sie über die 3 unteren Glasschalen (siehe Schritt 1.1.1), und bereiten Sie zur Transfektion.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Die Zellen durch Elektroporation10 transfizieren (siehe Tabelle der Materialien) mit Syntaxin-4-mCitrine-Konstrukt (Spender nur, Sample #1), Syntaxin 4-mCitrine zusammen mit VAMP3-mCherry (Sample #2) und Syntaxin 3 verschmolzen, mCitrine und mCherry () Beispiel #3). Hinweis: Andere Zelle Transfektion Methoden können auch gebrauchte11sein. Das Tandem-Konstrukt in Probe #3 ist eine Positivkontrolle für die Schätzung der kürzesten Lebensdauer vorhersehbaren (d.h.maximal erwartete Bund).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultur, die die Zellen im hohen Glukose DMEM mit 10 % FCS und 1 % Antibiotikum Antimykotikums bei 37 ° C mit 5 % CO2 in eine Zelle Kultur Inkubator versorgt über Nacht.</li>
	<li>Aspirieren DMEM und waschen Sie die Zellen einmal mit live Cell imaging Medium (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7,4, mOsm = 300; sehen Sie Tabelle der Materialien) für 2 min und legen Sie anschließend die Zellen in frischen Bildgebung Medium.</li>
</ol>
2. Aufzeichnung der FLIM Daten
<ol>
	<li>Ort Beispiel #2 unter dem Zeitbereich FLIM confocal Mikroskop mit einem gepulsten Anregungsquelle für die Spender Fluorophor (d.h., mCitrine) und zeitaufgelöste Datenerfassung. Halten Sie die Zellen bei 37 ° C mit einer beheizten Bühne. Hinweis: Die confocal Mikroskop in diesem Protokoll verwendeten ist ausgestattet mit einem 63 X 1.20 NA Wasser eintauchen Ziel, ein weißes Licht Pulslaser (80 MHz Taktung, &#60; 100 Ps Pulsdauer), ein Photon Multiplikator Schlauch (PMT) und ein Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC ) System (siehe Tabelle der Materialien für spezifische Setup verwendet). Andere FLIM-Mikroskope werden auch gebrauchten (z.B.Single-Photon Avalanche Dioden (SPAD) statt PMTs, Einzel-Wellenlänge gepulste Laser anstelle eines Weißlicht-gepulste Laser).</li>
	<li>Wählen Sie eine Zelle mit sichtbarer Ausdruck der mCitrine und mCherry-Label SNARE-Proteine und zeichnen ein konfokale Bild von 256 × 256 Pixel mit gleichzeitiger Anregung der beiden Fluorophore vor jeder Messung FLIM. Ein Pixel-Schritt von ca. 2-fach kleiner als die Beugung räumlichen Auflösung des Mikroskops begrenzt (~ 200 nm) eingesetzt werden. Für mCitrine begeistern Sie bei 516 nm und sammeln Emission von 521-565 nm; für mCherry bei 610 nm und sammeln Emission von 613-668 nm begeistern. Hinweis: Verwenden Sie nicht die Position der Abbildungsebene zu nah an den Boden der Schale (innerhalb von ~ 2 µm-Abstand), da dies in einer Reflexion-Spitze in der Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm führt. Simultane Anregung von Donor und Akzeptor Fluorophore wird bevorzugt, da dadurch das potentielle Problem der Probe Bewegung zu überwinden. Sequentielle Anregung kann jedoch auch verwendet werden.</li>
	<li>Datensatz ein FLIM Bild per Mausklick Ausführen FLIM FLIM Bild mit den gleichen Dimensionen und räumliche Auflösung als die konfokale Bild aufgezeichnet wird bei Schritt 2.2 aufgezeichnet. Zeichnen Sie die Bild mindestens 50.000 Photonen für ganze FLIM Zellanalyse oder mindestens 400 Photonen/Pixel. Nur die mCitrine Spender Fluorophor und nicht die mCherry Akzeptor Fluorophor begeistern, und somit bei 516 nm und sammeln Emission von 521-565 nm begeistern.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3 für mehrere Zellen und für die anderen Sample #1 (nur Spender) und Sample #3 (mCitrine-mCherry-Tandem-Konstrukt).</li>
	<li>Zeichnen Sie eine Instrument-Response-Funktion (IRF). Tune den Monochromator Emission Detektor zur Anregung Wellenlänge (z.B. Rekord Emission von 510-550 nm) und zeichnen Sie ein FLIM-Bild mit der Streuung zurück aus einem sauberen Glas Deckglas durch Anklicken der Schaltfläche Ausführen FLIM. Verwenden Sie die gleiche Erregung Wellenlänge (516 nm) und laser-macht, wie für die Aufnahme der Zellendaten Schritte 2.1-2.4. Hinweis: Wenn mehrere Gipfel in der IRF sichtbar sind oder die Emission Monochromatoren optimiert werden können, kann der IRF auch mit einer Lösung aus Fluoreszenzfarbstoff mit ultraschnellen Lebensdauer zum Beispiel gemessen werden durch Fluoreszenzlöschung von organischer Farbstoff in eine gesättigte wässrige Lösung von Kaliumjodid. Darüber hinaus ist es nicht unbedingt erforderlich eine IRF, aufzeichnen, weil Zerfall Hang der Fluoreszenz Histogramme auch ohne Entfaltung der IRF montiert werden kann. Jedoch ein IRF ermöglicht, um die Timing-Eigenschaften von der Photon-Detektor verwendet zu korrigieren und dadurch macht die Passungen der Lebensdauer Histogramme genauer.</li>
</ol>
3.Umwandlung der Photon-Aufnahmen, FLIM Bilder
<ol>
	<li>Downloaden Sie und installieren Sie die PT32ICS Umwandlung Software5. Hinweis: Die Lebensdauer-Daten können auch von anderer Software, einschließlich Software von verschiedenen Herstellern Mikroskop analysiert werden.</li>
	<li>Konfigurieren Sie die PT32ICS-Software.<ol>
		<li>Legen Sie die Größe auf 256 × 256 Pixel Bildgröße über Einstellungen | Größe.</li>
		<li>Stellen Sie den Kanal 2 über Einstellungen | Größe. Hinweis: Der Kanal der mCitrine Emission ist ausschließlich abhängig von der Konfiguration des Mikroskops. Ein falscher Kanal führt ein FLIM-Bild mit keine Photonen (d.h., schwarzes Bild) und als Ergebnis eine leere "LifetimeTable.txt"-Datei. Der richtige Kanal erkennbar durch Versuch und Irrtum.</li>
		<li>Ausgabe auf ImageJ (Xyz) festgelegt (oder TRI2 (Xyt)) für die Erzeugung von FLIM Bilder (Schritt 3.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drücken Sie Konvertieren und laden Sie ein oder mehrere Photon Spuren (.pt3 Dateien). Um mehrere Photon Spuren auszuwählen, halten Sie die Strg -Taste gedrückt. Hinweis: Die neuere 64-Bit-.ptu-Format kann auch umgewandelt werden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die PT32ICS-Software generiert die folgenden Dateien in demselben Ordner wie dem pt3-Dateien gespeichert werden: ein Photon Stapel pro .pt3 Photon Spur in Image Cytometry standard-Format (.ics), eine Bitmap-Datei pro .pt3 Photon Spur (BMP), eine Textdatei pro Conversion (_Report.txt), das Informationen über die Photon-Statistiken (d.h. die Anzahl der Photonen in jeder .pt3 Photon Ablaufverfolgung, die zeitliche Auflösung des Detektors) und eine zweite Textdatei pro Conversion (_LifetimeTable.txt), enthält die Summe Fluoreszenz Lifetime Histogramme in tabulatorgetrennte Format für jede .pt3-Photon-Spur. Hinweis: Die .ics-Datei kann für einzelne Pixel passend um FLIM Bilder, zum Beispiel mit TRI2 Software12,13 oder SLIM Kurvenanpassung Bibliothek in Fidschi ImageJ14,15erzeugen verwendet werden. Diese Datei auch Phasor Analyse16, zum Beispiel mit der Zeit Gated Phasor Plugin für Fidschi von Spechron einsetzbar. Die Bitmap-Datei enthält keine Lebensdauer-Informationen. Die zweite Text-Datei ist für die gesamte Zelle FLIM Analyse in Schritt 4 verwendet.</li>
</ol>
4. Montage der Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramme für die Whole-Cell FLIM Analyse
Hinweis: Dieser Schritt (deconvoluted Befestigung der IRF) erfordert Software, die deconvoluted Montage. Montage der Piste der Fluoreszenz Histogramme ohne Entfaltung der IRF kann mit anderer Software erfolgen.
<ol>
	<li>Öffnen der Daten Analyse-Software-Programm in der Lage, passend mit Dekonvolution (Table of Materials) und importieren Sie die Textdatei mit dem Histogramm für jedes Photon Trace (_LifetimeTable.txt) über Datei | Import | Einzelne ASCII.</li>
	<li>In der Tabelle zu reorganisieren, so dass die IRF in der zweiten Spalte der Tabelle (über Kopieren und Einfügen). Legen Sie die IRF in der zweiten Spalte B neben die Zeitwerte in die erste Spalte A.</li>
	<li>Entscheiden über die Qualität der aufgezeichneten Photon Spuren durch Auswahl von alle Spalten durch Drücken von Strg + A und Grundstück auswählen | Multi-Panel | 9 Panel. Photon-Spuren mit einer hohen Reflexion Spitze (Abb. 4F) nicht analysieren.</li>
	<li>Wählen Sie alle Spalten, in denen die qualitätsgesicherte Lebensdauer Histogramme, die neben der IRF in Spalte B mit Strg ausgestattet werden Schlüssel und Laden der nicht-linearen Montage über Analyse | Montage | Nicht-lineare Kurve Fit | Im Dialog.</li>
	<li>Deconvoluted Fit-Funktion (erhältlich in der ergänzenden Datei 1) zu laden, indem Sie die Analyse-Software diese Funktion hinzufügen (über Kategorie | Benutzerdefinierte | Funktion | Fügen Sie). Wählen Sie die Fit Funktionsdatei "FLIM_convoluted_IRF.fdf". Diese Funktion passt die Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit einer Mono-exponentiellen Zerfall-Funktion mit der IRF (d. h., die zweite Spalte in der Tabelle B) deconvoluted (Gleichung 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(Gleichung 1) mit t die Zeit τ die scheinbare Fluoreszenz Lifetime, A die Amplitude und y0 Offset. Hinweis: Eine weitere Möglichkeit ist die Lebensdauer Histogramme mit einem Bi-Fit Exponentialfunktion (Gleichung 2) passen: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(Gleichung 2) Durch die Festsetzung der Lebensdauer der langsamen Komponente (τ1), die einzige Bedingung des Spenders (Schritt 1.1.2: Sample #1) und dass der schnellen Komponente (τ2) zu den Tandem-Konstrukt (Sample #3), dies ermöglicht die Schätzung des Anteils der SNARE-Proteine im Komplex (F) von der Amplituden der langsamen (A1) und schnelle Komponenten (A2; siehe Diskussion; ( Gleichung 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(Gleichung 3) Die Fit-Funktionsdatei für deconvoluted Bi-exponentielle Anpassung "FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf" gibt es in ergänzende Datei 2.</li>
	<li>Wählen Sie ausgestattet Kurven | X-Datentyp genauso wie als Eingabedaten. Hinweis: Dadurch wird das entsprechende X-Achsenskalierung der angepassten Kurven.</li>
	<li>Passen Sie die Kurven durch drücken passen. Hinweis: Wird die Passform zu konvertieren und "Berichtsbogen" mit eine Tabelle mit der Fluoreszenz-Lebensdauer, Offsets und Amplituden im Array zu erzeugen. Es wird auch ein Datenblatt mit der angepassten Kurven und die Residuen der Passung generieren.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll zeigt den Einsatz des Bund-FLIM zur Visualisierung der SNARE Interaktionen zwischen Syntaxin 4 und VAMP3 in lebenden HeLa-Zellen. Syntaxin-4 ist ein QS-SNARE-Protein überwiegend Ortung bei der Plasmamembran wo vermittelt es Exozytose1,2,20,21. VAMP3 ist ein R-SNARE die bezeichnet man hauptsächlich um zur Wiederverwertung Endosomal Fächer zu finden und vermittelt handeln in anderen Endosomen sowie hinsichtlich der Plasmamembran1,2,20. Jedoch kann der Bund-FLIM-Assay für das Studium anderer SNARE-Proteine leicht angepasst werden. Die einzige Bedingung ist, dass diese Fallstricke eine C-terminalen transmembrane Helix, enthalten das ist der Fall für die meisten SNARE-Proteine durch weit1,2. Darüber hinaus kann das hier beschriebene Protokoll zur Visualisierung der SNARE-komplexe in eukaryotischen Zelltypen jeglicher Art, einschließlich Pflanzen und Hefe angepasst werden. In diesem Protokoll wird die Verkürzung der Fluoreszenz-Lebensdauer von Spender-Fluorophor als ein gewisses Maß an Bund verwendet. Als einen komplementären Ansatz die Lebensdauer der Akzeptor Fluorophor könnte untersucht werden, da die sensibilisierte Emission verursacht eine deutliche Anstieg Phase tritt die eindeutige Beweis, dass Resonanz-Energie-Transfer bietet.
Derzeit, die Bund-FLIM-Technik, SNARE-komplexe in lysosomalen Fächer zu visualisieren möglicherweise nicht. Für das Syntaxin-3-mCitrine-mCherry-Tandem-Konstrukt mCherry Fluoreszenz oft mehr kumulierten in einer Juxtanuclear Gegend, finden Sie das lysosomale Fächer wahrscheinlich entspricht, während das mCitrine-Signal häufiger in die zelluläre ist Peripherie-5. Eine ähnliche Juxtanuclear Ansammlung von mCherry im Vergleich zu mCitrine wurde beobachtet, wenn die gleichen SNARE-Proteine verschmolzen diese fluoreszierenden Proteinen Co ausgedrückt5waren. Lysosomen zeichnen sich durch einen extrem niedrigen pH-Wert (&#60; 4) und eine hohe Aktivität der proteolytischen Enzyme. Die Juxtanuclear Ansammlung von mCherry ist wahrscheinlich durch einen höheren Widerstand von der mCherry-Fluorophor lysosomalen Abbau im Vergleich zu den mCitrine-Fluorophor verursacht. Es ist nicht durch pH-Wert-abschrecken der mCitrine, da Juxtanuclear Ansammlung von mCherry auch bei der Fixierung der Zellen5 tritt. So die Bund-FLIM Technik unterschätzt die Höhe der Bund in den Juxtanuclear (lysosomalen) Regionen und dazu müssten andere fluoreszierende Reporter-Proteine, die die harten Bedingungen in das Lumen der Lysosomen zu überleben.
Bund-FLIM im Prinzip ermöglicht eine (semi-) quantitative Abschätzung der Bruchteil der SNAREs in Komplex5. Wie wir in diesem Protokoll erklärt, erfordert dies den Einbau von Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit Doppel-exponentiellen Zerfall Funktionen (Gleichung 2), wo die Amplitude der schnellen Komponente ist in komplexen (proportional zu dem Anteil der SNAREs ( Gleichung 3). Diese Armatur mit einem zwei-Komponenten-Modell ist jedoch technisch anspruchsvoll. Armatur mit mehreren freien Anpassungsparameter (zwei Fluoreszenz-Lebensdauer und zwei Amplituden) erfordert eine sehr große Anzahl von Photonen, zumal die Parameter einander beeinflussen und kleine Fehler in der Lebenszeit die Amplituden und Vice betrifft umgekehrt. Um diese Anpassung Probleme zu überwinden, die Fluoreszenz-Lebensdauer der langsamen Komponente auf die Lebensdauer der Geber einzige Bedingung (d. h.keine FRET; nur mCitrine vorhanden) fixiert werden können und zu konstruieren, die der schnellen Komponente auf die Lebensdauer der Tandem) maximale erwartete FRET). Allerdings sollte dies auch mit Sorgfalt, interpretiert werden, da die Fluoreszenz-Lebensdauer möglicherweise nicht identisch mit diesen Staaten Kontrolle und können aus mehreren Gründen (Self abschrecken, Dipol-Orientierung, Variationen in der Mikroumgebung) abweichen. In der Nähe mehrere SNARE-komplexe (&#60; 10 nm) kann Ergebnis im Abstand-abhängige FRET, das gleiche Prinzip, mit dem Bund als "molekulare Herrscher", verwendet werden kann aber in diesem Fall verdeckt die Quantifizierung der SNARE-komplexe. Darüber hinaus ist eine quantitative Schätzung nicht immer sinnvoll, weil die beschrifteten SNAREs mit endogenen (unbeschriftete) Schlingen konkurrieren. Infolgedessen ist die Expression des mCherry-Label SNARE eine ausschlaggebende Faktor für den Anteil Bund5. Aufgrund dieser Vorbehalte empfiehlt es sich, die fluoreszierende Lebensdauer Histogramme mit einer Mono-exponentiellen Zerfall Funktion (Gleichung 1) passen. Dies hat den Vorteil, dass es keiner kein-priori Kenntnisse über die Lebensdauer und die daraus resultierende scheinbare durchschnittliche fluoreszierende Lebensdauer ein solides Maß für SNARE Komplexbildner5 bietet.
Dennoch, wird erwartet, dass quantitative FRET-FLIM Bildgebung von Zweikomponenten-Modelle potente zukünftige Anwendungen haben wird. SNARE-Kodierung Gene innerhalb der Chromosomen können mit fluoreszierenden Reporter Proteine, zum Beispiel durch CRISPR/CAS9 fusioniert werden. Dies führt in der fluoreszierenden Etikettierung von endogenen SNARE-Proteine mit endogenen Proteingehalte und keinen Hintergrund der unbeschrifteten SNAREs und ermöglicht damit eine sinnvolle quantitative Schätzung des Anteils der SNARE-komplexe durch Bund-FLIM. Während der Ausdruck endogenen SNAREs könnte sein ziemlich niedrig und geben relativ niedrige fluoreszierende Signale, es wird erwartet, dass eine ausreichende Anzahl von Photonen, vor allem für die ganze Zelle FLIM eingeholt werden kann (die nur ein paar 1.000 Photonen erfordert). Darüber hinaus können diese Bund-FLIM-Messungen mit empfindlicher Avalanche Photodiode Detektoren durchgeführt werden, auch in höheren Fluoreszenz-Signale und bessere Photon Statistiken führt.

Membran des Menschenhandels ist ein zentrales Merkmal der eukaryotischen Zellen, wo Membranvesikel Knospe aus aus ein Spender Organell zu verschieben und dann verschmelzen mit einem Ziel Organelle1,2. Mit Ausnahme von Mitochondrien sind all diese Membran Fusion Schritte durch Mitglieder der SNARE Protein Familie1,2katalysiert. Die SNARE-Protein-Familie besteht aus etwa 36 Mitglieder in Säugetierzellen und etwa 20 Mitglieder in Hefe2. SNARE-Proteine enthalten ein oder zwei ~ 52 Rückstände-Long, nativ unstrukturierte Regionen aufgerufen SNARE-Motive. SNARE-Proteine sind oft angebunden, um Membranen durch eine C-terminale transmembranen Helix1,2. Fallstricke können kategorisiert werden, basierend auf der zentralen Reststoffen tragen sie auf der SNARE-Komplex in Arginin (R) und Glutamin (Q) Schlingen1,2. Membranfusion wird durch das Zusammenspiel von 3 oder 4 cognate SNAREs angetrieben, die zusammen 4 SNARE-Motive und verteilen sich über den Donor und Akzeptor Membran1,2. Ein SNARE-Komplex besteht aus einem R-SNARE-Motiv und drei Q-SNARE-Motive (Qa, Qb und Qc genannt). Komplexbildung beginnt bei der N-Termini der SNARE-Motive, bilden eine so genannte Trans-SNARE-Komplex, und geht in Richtung der C-Termini, bilden eine enge α-helikale coiled-Coil Bundle bezeichnet eine Cis-SNARE-Komplex. Die Komplexbildung sogar eine einzelne Schlinge komplexe zieht der Donor und Akzeptor Membranen zusammen und überwindet die Energiebarriere für Membrane Fusion3.
Bestimmte Transportwege innerhalb der Zellen unterschiedliche SNARE-komplexe zuweisen ist oft technisch anspruchsvoll. Obwohl SNAREs eindeutig auf die Besonderheiten der Membran des Menschenhandels beitragen, sind sie promiscuous, funktional überflüssig, und ihre Funktionen überlappen1,2. Aus diesem Grund führen Störung Experimente gezielt SNAREs, z. B. durch gen-Knockout, RNA-Interferenz, die Einführung Antikörper zu blockieren oder mit löslichen SNARE-Fragmente als dominierende negative, häufig nicht klar Phänotypen wie andere 2,4Schlingen zu kompensieren. Darüber hinaus ist es schwierig, vorgelagerten Menschenhandel Veranstaltungen, spezielle Membran Fusion Schritte unterscheiden, weil mehrere Transport-Routen-2SNAREs beteiligt werden können. Lokalisierungs-Arbeiten von Schlingen durch Mikroskopie Ansätze, mit Immunolabeling oder genetische Fusion Reporter fluoreszierende Proteine, leiden, die: (i) Schlingen lokalisieren, mehrere Organellen, wie vermitteln sie oft mehrere Menschenhandel Schritte und (Ii) Ihre Lokalisierungen bedeuten nicht automatisch, dass sie funktional mit SNARE Komplexbildung befaßt sind. Zu guter Letzt SNARE-komplexe mit Immunopräzipitation Experimente unter Verwendung eines von den Schlingen als Köder und die anderen Schlingen als Ziele identifiziert werden können, aber dies erlaubt keine Zuordnung dieser komplexe spezifische Organellen oder Handelsrouten. So gibt es derzeit keine alternative Technik, SNARE-komplexe mit Organellen Auflösung zu visualisieren. Immunfluoreszenz ist nicht in der Lage, SNARE Interaktionen zu beweisen aber zeigen nur das Vorhandensein oder Fehlen von Co Lokalisierung, während Immunopräzipitation nur zeigen kann SNARE Interaktionen in der gesamten Zelle Bevölkerung aber nicht zuordnen der Organellen wo diese Wechselwirkungen auftreten.
Um diese Einschränkung zu umgehen, wurde eine neuartige Methode, für die quantitative Darstellung der SNARE-komplexe in lebenden Zellen mit Organellen Auflösung vor kurzem von Verboogen Et Al. entwickelt. 5 diese Methode basiert auf den Ausdruck von Paaren von SNAREs mit spektral verschobenen fluoreszierende Proteine C-Terminal mit ihrer transmembranen Helices verschmolzen. Nach Abschluss der Membranfusion und Bildung eine Cis-SNARE Komplex, diese Fluorophore an die C-Termini von transmembranen Helices sind sofort zu einander gegenübergestellt. Die Fluorophore sind dann auch die Förster erreichbar (in der Regel &#60; 5 nm), was im Bund von Grün verschoben Spender Fluorophor rot-verschoben Akzeptor Fluorophor5,6. ÄRGERN Sie sich Ergebnisse in abschrecken der Spender Fluorophor und eine erhöhte Emission von den Akzeptor Fluorophor, der aus der Verhältnisse der Donor und Akzeptor-Emission (ratiometrischen Bund) gemessen werden können. Allerdings ist ratiometrischen Bund zwischen zwei unterschiedlichen Molekülen, durch Fluoreszenz Übersprechen und verschiedenen Ebenen der Donor und Akzeptor Schlingen auf verschiedenen Organellen und unter den Zellen7,8eine Herausforderung. Bund kann auch aus der Fluoreszenz-Lebensdauer gemessen werden, die die Zeit zwischen der Erregung und die Emission eines Photons ist. Wenn der Spender Fluorophor seine Energie durch loslassen kann Bund, dieser konkurrierenden Prozessergebnisses in eine scheinbare Verkürzung der Fluoreszenz-Lebensdauer. Dies kann durch FLIM7,8gemessen werden. Lebenszeit FRET ist wesentlich robuster als ratiometrischen Bund zur Messung von Interaktionen zwischen zwei unterschiedlichen Molekülen, wie die Fluoreszenz-Lebensdauer eine intrinsische Eigenschaft einer Fluorophor ist und unempfindlich gegen seine Konzentration ist. Darüber hinaus ist Bund durch Approximation quantitativ, weil die Effizienz der Bund umgekehrt proportional zu der sechsten Potenz der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor Fluorophore (im Wesentlichen eine Treppenfunktion). Daher ermöglicht durch den Einbau der Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit einem zwei-Komponenten-Verfall-Modell von FLIM aufgezeichnet, Bund-FLIM für die (semi-) quantitative Schätzung des Anteils der SNARE Moleküle SNARE Komplexbildung5beteiligt.
Vor kurzem wurde dieser Bund-FLIM-Methode von Verboogen Et Al. verwendet SNARE Komplexbildung in primären dendritischen Zellen des Immunsystems5zu visualisieren. Es zeigte sich, dass bei der Begegnung mit einem pathogenen Reiz, dendritische Zellen umleiten ihrer Membran Menschenhandel begleitet von einer erhöhten Komplexbildner des R-SNARE Membran Vesikel-assoziierten Proteins (VAMP) 3 mit Qa-SNARE Syntaxin 4 speziell auf die Plasmamembran. Diese erhöhte SNARE Komplexbildung ist wahrscheinlich müssen die sekretorische erhöhte Kapazität für die Sekretion von inflammatorischen Zytokinen wie Interleukin-6-5erfüllen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentellen Schritte für den Erwerb von FRET-FLIM-Daten für die Visualisierung und (semi-) quantitativen Messung der SNARE-komplexe.Es wird erklärt, wie man die ganze Zelle Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit Mono - und Bi-Zerfall Exponentialfunktionen, wodurch die scheinbare Fluoreszenz-Lebensdauer als quantitative Schätzung auf SNARE Interaktionen zu passen. In diesem Protokoll die weit verbreiteten HeLa-Zelllinie wird als Beispiel verwendet, aber die Methode kann leicht erweitert werden, um die SNARE-komplexe in anderen eukaryotischen Zellen zu studieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 4-mCitrine&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92422</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;VAMP3-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92423</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 3-mCitrine-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92426</td>
			<td>Positive control for maximum achievable FRET.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>Willco Wells</td>
			<td>HBST-3522</td>
			<td>Other live cell imaging chambers will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Pen/Strep will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed white light laser</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other pulsed laser sources can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system</td>
			<td>PicoQuant</td>
			<td>PicoHarp 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT32ICS conversion software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software programme capable of deconvolution</td>
			<td>Originlabs</td>
			<td>OriginPro 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity</td>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;rker Haemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#160;CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>B Braun Melsungen&#160; AG</td>
			<td>362 3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 2 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108417</td>
			<td>CAS: 60-00-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td>CAS: 72-57-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEON cell electroporation device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy

Lösliche N- Ethylmaleimide sensible Protein (NSF) Anlage Protein-Rezeptor (SNARE) Fusionsproteine sind der Schlüssel für Handel mit Membran, wie sie Membranfusion in eukaryotischen Zellen katalysieren. Die SNARE-Protein-Familie besteht aus ca. 36 verschiedenen Mitgliedern. Bestimmte intrazelluläre Transportwege sind durch bestimmte Gruppen von 3 oder 4 SNARE-Proteine, die somit auf die Besonderheiten und Treue des Handels mit Membran katalysiert. Allerdings ist die genaue Funktion des SNARE-Proteine zu studieren technisch anspruchsvoll weil SNAREs sind sehr reichlich und funktional überflüssig, mit den meisten SNAREs mit mehreren und überlappende Funktionen. In diesem Protokoll wird eine neue Methode zur Visualisierung von SNARE Komplexbildung in lebenden Zellen beschrieben. Diese Methode basiert auf der SNARE-Proteine C-Terminal mit fluoreszierenden Proteinen verschmolzen zum Ausdruck zu bringen und messen deren Zusammenspiel von Förster Resonance Energy transfer (FRET) mit Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie (FLIM). Durch den Einbau der Fluoreszenz Lifetime Histogramme mit einem Mehrkomponenten Verfall Modell, ermöglicht FRET-FLIM (semi-) quantitativen Einschätzung des Bruchs des SNARE-Komplexbildung bei verschiedenen Vesikel. Dieses Protokoll um SNARE Komplexbildung an der Plasmamembran und Endosomal Fächern in Säugetieren Zelllinien und primäre Immunzellen zu visualisieren erfolgreich angewendet wurde, und kann leicht erweitert werden, um die SNARE-Funktionen auf anderen Organellen in studieren Tier-, Pflanzen- und Pilzzellen.

Das Grundprinzip des Tests zur Messung der SNARE Interaktionen von FRET-FLIM ist in Abbildung 1dargestellt. Die C-Termini von den transmembranen Helices cognate SNARE-Proteine sind mit ein paar spektral verschobenen fluoreszierende Proteine (z.B., mCitrine und mCherry) verschmolzen. Die Bildung einer Cis-SNARE Komplex auf Membrane Fusion Ergebnisse in dieser fluoreszierende Proteine immer sofort zu einander gegenübergestellt und ärgern. Abbildung 2 zeigt repräsentative konfokale Bilder von HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Eindringmittel beschriftet SNARE-Proteine. Angezeigt eine Zelle Syntaxin 4-mCitrine (Spender Fluorophor) mit VAMP3-mCherry (Akzeptor Fluorophor), zum Ausdruck bringen, sowie Kontrolle der Zellen mit dem Ausdruck nur die Syntaxin-4-mCitrine-Konstrukt (Spender nur; ohne Bund) und Syntaxin 3 verschmolzen, beide mCitrine und mCherry im Tandem (maximale erwartete Bund). Abbildung 3 zeigt die begleitenden Fluoreszenz-Lebensdauer und FLIM Bilder erzeugt durch den Einbau der Lebensdauer Histogramme der einzelnen Pixel mit Mono-exponentiellen Zerfall Funktionen (Abb. 3A–B) und Bi-exponentiellen Zerfall Funktionen ( Abbildung 3 - ( D). Abbildung 4A zeigt die IRF unser Setup zurück Streuung von ein Mikroskop-Deckglas gemessen. In Abbildung 4 b–E, repräsentative Fluoreszenz Lifetime Histogramme der ganzen Zelle FLIM Analyse zusammen mit begleitenden Passform sind Kurven für Mono-exponentiellen Zerfall Funktionen dargestellt. Abbildung 4F zeigt ein Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm eines Experiments zu nahe an die Oberfläche der Glasabdeckung Mikroskop abgebildet ein prominenter Reflexion Peak führt. Abbildung 4 zeigt ein Lebenszeit-Histogramm mit Vertreter mit einer Bi-exponentiellen Zerfall Funktion passen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schema der Begründung zur Visualisierung von SNARE-komplexe durch Bund. (A) Strukturmodell des neuronalen SNAREs (Protein-Datenbank 3HD717) Membran Vesikel-assoziierten Proteins (VAMP) 2 (blau; (R), Syntaxin 1 (rot; Qa-SNARE), und SNAP25 (grün; enthält sowohl ein Qb und Qc-SNARE-Motiv). Dem C-Terminus des transmembranen Helix von Syntaxin-1 ist an mCitrine (Spender Fluorophor, Protein-Datenbank-3DQ1-18) konjugiert. Dem C-Terminus des transmembranen Helix VAMP2 ist an mCherry (Akzeptor Fluorophor, Protein-Datenbank 2H5Q19) konjugiert. (B) Regelung der SNARE vermittelte Membranfusion Bund führt. Nach der Membranfusion durch Bildung einer Cis-SNARE-komplexe, die Schlingen werden sofort miteinander wodurch Bund gegenübergestellt. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Ausdruck der SNARE-Proteine mit fluoreszierenden Proteinen verschmolzen. Erste Spalte: Spender Fluorophor, begeistert von 516 nm. Zweiten Spalte: Akzeptor Fluorophor, aufgeregt bei 610 nm. (A) Spender nur Zustand. Repräsentative konfokale Bild einer HeLa-Zelle mit dem Ausdruck Syntaxin 4-mCitrine (Spender Fluorophor; grün zusammenführen). Der Akzeptor-Kanal (zweite Spalte) zeigt die Fluoreszenz Übersprechen. (B) negativ-Kontrolle (ohne Bund). Repräsentative konfokale Bild einer HeLa-Zelle mit dem Ausdruck sowohl Syntaxin 4-mCitrine mit VAMP3-mCherry (Akzeptor Fluorophor; Magenta zusammenführen). (C) Positivkontrolle (maximale erwartete Bund). Repräsentatives konfokale Bild einer HeLa-Zelle mit dem Ausdruck des Syntaxin-3-mCitrine-mCherry-Tandems zu bauen. Beachten Sie, das das Fluoreszenzsignal des mCitrine und der mCherry signalisiert wird nicht vollständig überlappen, wahrscheinlich aufgrund einer geringeren Widerstand der mCitrine zu lysosomalen Abbau im Vergleich zu mCherry (siehe Diskussion). BF: Hellfeld. Skalieren Sie Bars, 20 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Abbildung 3: FLIM Bilder von SNARE Komplexbildung. (A) repräsentative Lebensdauer Fluoreszenzbilder der Zellen, die in Abbildung 2dargestellt. Die Bilder wurden durch Umwandlung der Photon-Spuren von einem TCSPC-System (.pt3) aufgenommen, das Bild Cytometry standard (.ics) mit der PT32ICS Software generiert. Einzelnes Pixel ausgestattet Fluoreszenz-Lebensdauer, die Bilder dann generiert wurden mit der TRI2 Software12,13 mit Schwellwerte von 15-100 % Intensität, 7 Pixel binning kreisförmigen und Monoexponential passenden Algorithmus (Marquardt). Die Farbe zeigt die durchschnittliche scheinbare fluoreszierende Lebensdauer. (B) FLIM Bilder wo Lebensdauer Fluoreszenzbilder (siehe Schalttafel A) mit der Fluoreszenz-Intensität von der mCitrine Spender Fluorophor (siehe Abbildung 2) verwickelt waren. Die Faltung erfolgte mit Fidschi ImageJ mit einem maßgeschneiderten Makro (siehe Tabelle der Materialien). (C) Fluoreszenz-Lebensdauer und FLIM Bilder der HeLa-Zelle mit dem Ausdruck Syntaxin 4-mCitrine und VAMP3-mCherry, aus Platten A-B, aber jetzt mit der passenden mit Bi-exponentiellen Zerfall Kurven (mit Lebenszeiten, die fest mit der Kontrolle Bedingungen; siehe Schritt 4,4 In -Protokoll). Die Pixelfarben zeigen die geschätzte Fraktionen F von Syntaxin 4 im Komplex mit VAMP3 (Gleichung 3). (D) passen wie zentrale B, jedoch für die Bi-exponentiell. Die Faltung erfolgte mit Fidschi ImageJ mit einem maßgeschneiderten Makro (siehe Tabelle der Materialien). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Abbildung 4: ganze Zelle FLIM Analyse. (A) die Instrument-Response-Funktion (IRF) des Setups. Die IRF wurde mittels der zurück Streuung auf die Glas-Wasser-Grenzfläche (mit einer sauberen Mikroskopie Glasschale mit Wasser) gemessen.(B–E) Ganze Zelle Leben Histogramme für die Zellen, die in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt. In den Bildern alle Photonen wurden zusammengefasst. Die Kurven wurden mit der IRF deconvoluted und ausgestattet mit Mono-exponentiellen Zerfall Funktionen (Gleichung 1). Für diese Zellen stammen von 2,82 Fluoreszenz Lebenszeiten ns (mit dem Ausdruck nur Syntaxin 4-mCitrine; Spender nur zentrale B-Zellen), 2,09 ns (Zellen, die zusammen mit dem Ausdruck Syntaxin 4-mCitrine mit VAMP3-mCherry; C-Panel) und 2,08 ns (Zellen, die mit dem Ausdruck der Syntaxin 3- mCitrine-mCherry-Tandem zu bauen; maximale erwartete Bund Kontrolle; Panel D). Die Inlays zeigen die gleichen Grafiken, aber jetzt mit logarithmischer Skalierung der y-Achse. E zeigt eine Überlagerung der Verfall Kurven Platten B-D. (F) Beispiel für ein Histogramm fluoreszierende Lebensdauer aufgezeichnet zu nah an der Oberfläche des Mikroskop-Deckglas. Daraus resultiert eine große Reflexion Spitze (dargestellt durch die gelben schraffierte Fläche). (G) befestigt wie Panel C, aber jetzt mit einer Bi-exponentiellen Zerfall Kurve mit Lebenszeiten passend die Kontrolle Bedingungen (siehe Punkt 4.4 im Protokoll). Die Amplituden der schnell (A1) und langsam(2)Komponenten waren 14.42 und 0,01, beziehungsweise, was zu einem geschätzten Bruchteil der SNAREs in komplexen F 0.99 (Gleichung 3). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1. Funktionsdatei FLIM_convoluted_IRF <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2. Funktionsdatei FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für die quantitative Darstellung der Komplexbildung des SNARE-Proteine, basierend auf Förster Resonance Energietransfer und Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie ermöglicht.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Membrane Structure and Functions

SCIENTISTS IN ACTION

9.4K Aufrufe.  Radboud University Medical Center. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für die quantitative Darstellung der Komplexbildung des SNARE-Proteine, basierend auf Förster Resonance Energietransfer und Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie ermöglicht.

Serie: Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

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Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Nicht-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellhandel von PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

Integration von Imaging Durchflusszytometrie und transkriptomischen Profilierung zu veränderten Endocytic CD1d Handel bewerten

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...