Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der Pennsylvania Department of Health unterstützt. Dr. Miguel Garcia Toscano wurde ein Postdoc-Fellow an der Temple University, die Alfonso Martin Escudero Foundation im Rahmen dieser Studie finanziert. Wir wollen Ilija Yordanov und Kevin Kotredes für die Herstellung des Videos danken.

1. Blinddarm Ligation und Punktion als Maus-Modell für Menschenrechte Sepsis Für dieses Verfahren C57BL / 6 Mäuse (7-9 Wochen alt) verwendet werden. <ol><li> Anesthetize der Maus durch die Injektion intraperitoneal eine Lösung von 1:1 Ketamin (75mg/kg) und Xylazin (15mg/kg). Als Referenz injizieren 30 ul der 1:1-Lösung in eine Maus mit einem Gewicht von 20 Gramm wiegt. Alternativ können Mäuse betäubt werden mit inhalativen Isofluran mit einem Betäubungsmittel Verdampfer. </li><li> Shave den Bauch der Maus und desinfizieren Bereich, indem zuerst betadine Lösung durch Abwischen mit einem 70% igem Alkohol (Nummer 1 in der Bildfolge unten). Chlorhexidin kann als Alternative Antiseptikum verwendet werden. Optional: ein steriles Abdecktuch verwendet werden, um zu erhalten, den Bereich sauber sein. </li><li> Unter aseptischen Bedingungen der Praxis ein 1 bis 2 cm Mittellinie Laparotomie und setzen den Blinddarm mit angrenzendem Darm (2 und 3). </li><li> Der Blinddarm ist eng mit einem 6,0 Seidenfaden (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) ligiert an ihrer Basis unter dem Ileocoecalklappe und ist perforiert oder zweimal mit einer 19-Gauge-Nadel (4, 5) auf dem gleichen Seite des Blinddarms. Bitte beachten Sie, dass die Länge der ligiert Blinddarm als der Abstand von dem distalen Ende des Blinddarms der Ligation Punkt definiert den Grad der Schwere zu bestimmen. Ein Abstand von&gt; 1 cm produziert hochwertige Sepsis, während ein Abstand von ≤ 1 cm produziert mid-to-low grade Sepsis. Beachten Sie auch, dass die Verwendung der Blinddarm Perforation hier gezeigte Verfahren unterscheidet sich vom Standard durch und durch Punktion Technik (Einführung einer Nadel durch den Blinddarm). Beide Methoden zuverlässig die gleiche Sepsis Ergebnis. Allerdings ist ein Nachteil der durch und durch Technik, die es nicht ermöglichen die Steuerung der Menge an Kot extrudierten, wenn der Blinddarm gequetscht wird. </li><li> Der Blinddarm ist dann sanft gepresst, um eine kleine Menge von Fäkalien aus der Perforation Stätten (6) zu extrudieren. Der Blinddarm ist es, die Bauchhöhle zurück und das Bauchfell ist mit 6,0 seidenen Suturen geschlossen. (7). </li><li> Die Haut wird mit Reflex 7mm Clips (RS-9258, Roboz Surgical Instruments) oder Michel Wundklammern (7 mm, RS-9270) (8) geschlossen. </li><li> Resuscitate Mäusen durch Injektion subkutan 1 ml vorgewärmten 0,9% iger Kochsalzlösung mit einer 25G-Nadel. Diese Flüssigkeitstherapie Maßnahme induzieren die hyperdynamischen Phase der Sepsis. Dieser entscheidende Schritt weiter in der Diskussion beschrieben. </li><li> Optional: Inject subkutan Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) oder Tramadol (20mg/kg Körpergewicht) für postoperative Analgesie. Darauf hingewiesen, dass diese Opiate können Atmung und Bewegung zu unterdrücken und diese Effekte können als Zeichen einer Sepsis fehlinterpretiert werden. </li><li> Die Tiere werden vorübergehend auf ein Heizkissen gelegt oder alternativ kehrte sofort in einen Käfig mit der Exposition gegenüber einer Infrarot-Wärmelampe von 150W bis sie wieder aus der Narkose. Die Recovery-Zeit von 30 min bis 1 Stunde. </li><li> Geben Sie freien Zugang zu Futter und Wasser (Hydrogel) auf dem Boden des Käfigs gelegt. </li><li> Mäuse sind alle 12 Stunden für das Überleben 1.59 Wochen beobachtet oder eingeschläfert zu verschiedenen Zeitpunkten für die Analyse von verschiedenen Parametern. </li></ol> Als Kontrolle für die experimentelle Gesamtplanung, würde sham Tiere der Laparotomie-Technik ohne Ligatur und Punktion folgen. Sechs bis 12 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff Mäuse werden lethargisch und entwickeln Fieber, Piloerektion, Durchfall, huddling und Unwohlsein; alle Symptome der Sepsis. Mäuse, die mit sehr schweren Sepsis kann kaum vor dem Tod zu bewegen und zeigen einen dramatischen Rückgang der Körpertemperatur. Bei diesem Schritt Mäusen sollte eingeschläfert zu anhaltenden Schmerzen und Leiden erspart werden. <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig0.jpg" alt="Abbildung 0" /> 2. Häufigste analysierten Parameter Zur Auswertung der Ergebnisse des Verfahrens können verschiedene Parameter in Organen, Zellextrakte oder Körperflüssigkeiten analysiert werden. Proben können zu unterschiedlichen Zeitpunkten von 3 Stunden bis 1 Woche nach dem chirurgischen Eingriff gesammelt werden. <ol><li> Mäuse überleben. </li><li> Zytokine und Chemokine im Serum, Bauchhöhle und Organextrakte. <ol><li> Interleukin-6: Produziert und veröffentlicht von Monozyten, dendritische Zellen, Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, Granulozyten, Mastzellen und viele weitere Zelltypen. Es spielt eine wichtige Rolle in der akuten Phase Reaktion und Entzündung. </li><li> Tumor-Nekrose-Faktor-α: Pleiotrophic Zytokin, das eine zentrale Rolle in Entzündungs-und Apoptose spielt. Produziert von Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen, dendritischen Zellen und Fibroblasten. </li><li> nterleukin-1β: Produziert von Monozyten, NK-Zellen, dendritische Zellen, B-Zellen und T-Zellen. Induziert Fieber und akute Phase-Protein-Synthese. </li><li> Interleukin 10: Fördert Phagozytose-und Th2-Reaktionen, sondern unterdrückt Antigen Präsentation und Th1 proinflammatorische Reaktionen. </li><li> Interleukin 10: Fördert Phagozytose-und Th2-Reaktionen, sondern unterdrückt Antigen-Präsentation und Th1 proinflammatorische Reaktionen. </li><li> Monozyten chemotaktische Protein-1 (auch als CCL2 bekannt): Rekruten Monozyten, T-Gedächtniszellen und dendritischen Zellen zu Websites von Gewebe Verletzungen und Infektionen. </li><li> KC (CXCL1): Produziert von Makrophagen und Endothelzellen. Maus KC ist ein potenter Neutrophilen Lockstoff und Aktivator. </li><li> RANTES: A monocyte chemoattractant. Es kann chemoattract unstimulierten CD4 + / CD45RO + Gedächtnis-T-Zellen und stimuliert CD4 + und CD8 + T-Zellen mit na ve und Speicher Phänotypen. </li><li> Interferon-γ: Secreted von Th1-Zellen, zytotoxische T-Zellen, dendritische Zellen und natürliche Killerzellen (NK)-Zellen. Erhöht die Antigen-Präsentation und lytische Aktivität in Makrophagen und unterdrückt Th2-Zell-Aktivität. Fördert den Kraftschluss und bindend für alle Leukozyten-Migration erforderlich und fördert NK-Zell-Aktivität. </li><li> High-mobility group B-1-Proteins: In Monozyten ist ein nuclear factor kappa B Aktivator durch die Bindung an den zellulären Rezeptor für vorab glycation Endprodukte (RAGE), Aktivierung die Freisetzung von entzündungsfördernden Mediatoren in der späten Phase der Sepsis. </li></ol></li><li> Myeloperoxidase Bestimmung in Organen als Maß für die Neutrophilen-Infiltration. Myeloperoxidase (MPO) ist ein Peroxidase-Enzym am reichlichsten in neutrophilen Granulozyten. Es ist eine lysosomale Protein in Azurgranula der neutrophilen gespeichert. MPO ist eine Häm-Pigment, das seine grüne Farbe verursacht in Sekreten reich an Neutrophilen, wie Eiter und einige Formen von Schleim. </li><li> Bakterien in den Organen und Blut zu laden, zu messen als die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Der CLP Verfahren wurde zunächst in der C57BL / 6 Maus-Stamm durchgeführt. Wir testeten verschiedene Parameter zu modulieren, die Schwere der Sepsis durch Veränderung der Länge der Ligation und die Dicke der Nadel in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Unter diesen beiden Faktoren scheint die Länge der Ligation effektiver zu sein als die Dicke der Nadel Prozent Überleben zu ändern. Wie in Abbildung 1 dargestellt, provoziert die Erhöhung der Länge der Ligation von mehr als 1 cm einer Zunahme der Mortalität von 100% im Vergleich zu Mäusen mit einem Ligation von ≤ 1cm. Die Erhöhung der Dicke der Nadel reduzierte auch die Prozent Überlebensrate von 100% (mit einer 22G Nadel) auf 55% (mit einer 19G Nadel) mit zwei Reifenschäden. Wir testeten auch die Wirkung von CLP auf C57BL / 6 und 129SvJ Mäusen zu bestimmen, ob verschiedene Mausstämme ähnliche oder unterschiedliche Anfälligkeit Display CLP-induzierten Sepsis. Abbildung 3 zeigt, dass unter den gleichen Bedingungen, 129SvJ Mäuse anfälliger für Infektionen als C57BL / 6, mit einer erhöhten Sterblichkeit Prozent angegeben wurden. <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Auswirkung der Ligatur Länge des Blinddarms in das Überleben der Tiere. CLP wurde in C57BL / 6 Mäuse mit zwei verschiedenen Längen cecal Ligation durchgeführt. Diese einzelnen Parameter dramatisch wirkt sich das Überleben der Tiere, da alle Tiere in der Gruppe mit einer Ligation Bereich mehr als 1 cm in weniger als 3 Tagen starb, als mit einer Gruppe von Tieren, die eine Ligation Fläche von 1 cm ca. verglichen. (N = 8). <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Einfluss der Nadeldicke auf das Überleben. CLP wurde in C57BL / 6 Mäuse mit zwei verschiedenen Nadel Größen 19G und 22G durchgeführt. Mäuse mit dem Blinddarm perforiert mit einer 19G Nadel zeigte eine 55-60% Überleben. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse mit dem Blinddarm perforiert mit einer 22G Nadel 100% ige Überlebensrate, obwohl sie die typischen Symptome der Entzündung erlebt während der ersten 3-4 Tage; die verschwanden nach 4 Tagen (n = 8). <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Vergleich der Sepsis Anfälligkeit zwischen zwei unterschiedlichen Mausstämme. Die CLP-Modell wurde in 129SvJ und C57BL / 6 unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Am Ende des Testzeitraums die prozentuale Überleben der 129SvJ Stamm wurde 25% weniger als in den C57BL / 6 Stamm, was auf eine höhere Anfälligkeit für Entzündungen, die durch polymikrobiellen Infektion induziert. (N = 6).

<ol>
	<li>Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States:+analysis+of+incidence,+outcome,+and+associated+costs+of+care.">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).</li><li>Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigma+of+sepsis.">The enigma of sepsis.</a> J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).</li><li>Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+acute+lung+injury+and+acute+respiratory+distress+syndrome+trials+testing+low+tidal+volumes.">Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes.</a> Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).</li><li>Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis:+setting+the+stage.">Animal models of sepsis: setting the stage.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).</li><li>Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+sepsis+and+sepsis-induced+kidney+injury.">Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury.</a> J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).</li><li>Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+susceptibility+during+murine+septic+peritonitis.">Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis.</a> J Surg Res. 102, 45-49 (2002).</li><li>De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+influencing+the+response+to+injury,+inflammation,+and+sepsis.">Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis.</a> Shock. 23, 11-17 (2005).</li><li>Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+the+inflammatory+response+and+survival+following+haemorrhage+and+subsequent+sepsis.">Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis.</a> Cytokine. 14, 162-169 (2001).</li><li>Turnbull, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+age+on+mortality+and+antibiotic+efficacy+in+cecal+ligation+and+puncture.">Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture.</a> Shock. 19, 310-313 (2003).</li><li>Miyaji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethyl+pyruvate+decreases+sepsis-induced+acute+renal+failure+and+multiple+organ+damage+in+aged+mice.">Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice.</a> Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).</li><li>Torres, M. B., De Maio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+exaggerated+inflammatory+response+after+CLP+correlates+with+a+negative+outcome.">An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome.</a> J Surg Res. 125, 88-93 (2005).</li><li>Doi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP214,+an+analogue+of+alpha-melanocyte-stimulating+hormone,+ameliorates+sepsis-induced+acute+kidney+injury+and+mortality.">AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality.</a> Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).</li><li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+resuscitation+attenuates+early+cytokine+mRNA+expression+after+peritonitis.">Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis.</a> J Trauma. 41, 622-627 (1996).</li><li>Zanotti-Cavazzoni, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+resuscitation+influences+cardiovascular+performance+and+mortality+in+a+murine+model+of+sepsis.">Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis.</a> Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).</li><li>Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tramadol+and+buprenorphine+on+select+immunologic+factors+in+a+cecal+ligation+and+puncture+model.">Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model.</a> Shock. 34, 250-260 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.<br /&gt; Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Guide für Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, und von der Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss an der Temple University.

Hier zeigen wir im Detail, wie der CLP-Modell in Mäusen durchführen und modulieren den Grad der Schwere. Im Vergleich zu anderen Tiermodellen der Sepsis, kann CLP in jedem Mausstamm unterschiedlichen Alters und Geschlechts durchgeführt werden. Es ist eine relativ einfache und kostengünstige chirurgischen Eingriffs. In diesem Modell hat der Grad der Schwere eine direkte Auswirkung auf den Prozentsatz des Überlebens. Die Länge der Ligation werden die Dicke der Nadel und die Anzahl der Einstiche Parameter gesteuert zu modulieren die Schwere / Mortalität von CLP kann. Folglich zu dramatischen Veränderungen in CLP Schwere zu erhalten, kann der Benutzer die Länge der Ligation, während leichte Modifikation in der Schwere durch Einstellung der Dicke der Nadel eingeführt werden können. Andere wichtige Parameter, die eine erhebliche Variabilität in der CLP Ergebnisse vorstellen könnte sind die Mausstamm 6,7, Geschlecht 8 und Alter des Tieres 9. In diesem Zusammenhang zeigen wir, dass verschiedene Mausstämme unterschiedliche Empfindlichkeiten Display, das Verfahren, wenn unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. In der Tat sind die Unterschiede im Plasma Cytokinspiegel und Gewebeschäden zwischen verschiedenen Mausstämmen 10-12 festgestellt. Einbeziehung der Flüssigkeitszufuhr und analgetische Verwaltung sind Faktoren, die erhebliche Variabilität in der CLP-Modell einführen können. Zum Beispiel erhöht Flüssigkeitszufuhr Überlebensrate möglicherweise durch Verringerung der Produktion von Anfang pro-inflammatorischen Zytokinen 11, 13, 14 so Maskierung der Auswirkungen möglicher therapeutischer Interventionen. Im Gegensatz dazu kann Schmerzmitteln zu unterdrücken Atmung und Bewegung in der Tier-und provozieren eine irreversible Wirkung in keinem Zusammenhang mit Sepsis. Ihre Verwendung kann somit Einfluss Überlebensrate und der Funktion der Immunzellen 15. Im Ergebnis bei der Durchführung der CLP-Modell alle diese Bedingungen und die technischen Parameter müssen sorgfältig abgewogen werden, um reproduzierbare und konsistente Ergebnisse zu erhalten. Daher ist eine genaue Kenntnis und Beherrschung des Verfahrens absolut notwendig, um die CLP-Modell genau durchzuführen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Ketaset </td><td> 0856-2013-01 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> AnaSed </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Insulinspritze 29G </td><td> Exel </td><td> 26028 </td><td></td></tr><tr><td> Seidenfaden, 6-0 PROLENE </td><td> Ethicon </td><td> 8680G </td><td></td></tr><tr><td> 19G und 25G-Nadel </td><td> BD </td><td> 305186 </td><td></td></tr><tr><td> Rasierapparat </td><td> Allgemeine Versorgung </td><td> Allgemeine Versorgung </td><td></td></tr><tr><td> Infrarot-Heizung-Lampe </td><td> Allgemeine Versorgung </td><td> Allgemeine Versorgung </td><td></td></tr><tr><td> Michel Wundklammern 7mm </td><td> Roboz Chirurgische Instr </td><td> RS-9270 </td><td></td></tr><tr><td> Ohrbügel Mask </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-130-4181 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Schere </td><td> Roboz Chirurgische Instr </td><td> RS-6702 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine Lösung </td><td> VWR </td><td> 63410-992 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Pinzette </td><td> Roboz Chirurgische Instr </td><td> RS-5135 </td><td></td></tr><tr><td> 70% igem Alkohol-Pad </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-031-350 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphin </td><td> Bedford Labs </td><td> 55390-100-10 </td><td></td></tr><tr><td> Tramadol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 42965 </td><td></td></tr></tbody></table>

cecal ligation puncture procedure

Menschliche Sepsis ist durch eine Reihe von systemischen Reaktionen in Reaktion auf intensive und massive Infektion, die vor Ort durch den Host enthalten sein fehlgeschlagen gekennzeichnet. Derzeit Sepsis zählt zu den Top Ten der häufigsten Todesursachen in den USA Intensivstationen 1. Während Sepsis gibt es zwei etablierte hämodynamischen Phasen können sich überschneiden. Die erste Phase (hyperdynamischen) wird als eine massive Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und reaktiven Sauerstoffspezies durch Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, die vaskuläre Permeabilität (führt zu Hypotonie), die Herzfunktion beeinträchtigt und führt zu metabolischen Veränderungen gipfelte in Gewebsnekrose und Organversagen definiert. Folglich ist die häufigste Todesursache akutes Nierenversagen. Die zweite Phase (hypodynamic) ist ein anti-entzündlichen Prozess mit veränderten Monozyten-Antigen-Präsentation, verringerte Lymphozyten-Proliferation und Funktion und erhöhte Apoptose. Dieser Zustand, wie Immunsuppression oder Immun-Depression bekannt stark erhöht das Risiko von Infektionen nocosomial und letztlich zum Tod führen. Die Mechanismen dieser pathophysiologischen Prozesse sind nicht gut charakterisiert. Da beide Phasen der Sepsis irreversible und nicht wiedergutzumachenden Schaden verursachen kann, ist es wichtig, die immunologischen und physiologischen Zustand des Patienten zu bestimmen. Dies ist der Hauptgrund, warum viele therapeutische Medikamente versagt haben. Das gleiche Medikament in verschiedenen Stadien der Sepsis gegeben werden kann therapeutische oder anderweitig schädliche oder haben keine Auswirkung 2,3. Sepsis auf verschiedenen Ebenen zu verstehen ist es wichtig, einen geeigneten und umfassenden Tiermodell, dass der klinische Verlauf der Erkrankung vermehrt haben. Es ist wichtig, die pathophysiologischen Mechanismen, die während einer Sepsis zu charakterisieren und Kontrolle des Modells Bedingungen für die Prüfung potenzieller Therapeutika. Zur Untersuchung der Genese der menschlichen Sepsis-Forscher haben verschiedene Tiermodelle entwickelt. Die am weitesten verbreitete klinische Modell ist cecal Ligatur und Punktion (CLP). Der CLP-Modell besteht aus der Perforation des Blinddarms ermöglicht die Freisetzung von Fäkalien in die Bauchhöhle zu einem übersteigerten Immunantwort durch polymikrobiellen Infektion induziert generieren. Dieses Modell erfüllt die conditio humana, die klinisch relevant ist. Wie beim Menschen, zeigen Mäuse, die CLP unterzogen mit Flüssigkeitstherapie die erste (frühe) hyperdynamischen Phase, in der Zeit fortschreitet, um die zweite (späte) Phase hypodynamic. Darüber hinaus ist das Zytokin-Profil ähnlich wie in der menschlichen Sepsis gesehen, wo es Lymphozyten Apoptose (reviewed in 4,5) erhöht wird. Aufgrund der vielfältigen und überlappenden Mechanismen bei der Sepsis beteiligt sind, brauchen die Forscher ein geeignetes Sepsis-Modell der kontrollierten Schwere, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Watch this Scientific Journal Video about Cecal Ligation Puncture Procedure at JoVE.com

Cecal Ligation Puncture Procedure

Das Mausmodell der Blinddarm Ligatur und Punktion als ein wertvolles Instrument für das Studium der menschlichen Sepsis.

Blinddarm Ligation Punktion

Human sepsis is characterized by a set of systemic reactions in response to intensive and massive infection that failed to be locally contained by the ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

54.6K Aufrufe.  Temple University. Das Mausmodell der Blinddarm Ligatur und Punktion als ein wertvolles Instrument für das Studium der menschlichen Sepsis.

Serie: Cecal Ligation Puncture Procedure

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Forschung

Medizin

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

Die Anwendung des dauerhaften mittleren Hirnarterie Ligation in der Maus

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Geändert Technik für Coronary Artery Ligation in Mäuse

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Reduction of Iatrogenic Atrial Septal Defects with an Anterior and Inferior Transseptal Puncture Site when Operating the Cryoballoon Ablation Catheter

The cryoballoon catheter ablates atrial fibrillation (AF) triggers in the left atrium (LA) and pulmonary veins (PVs) via transseptal access. The typical transseptal puncture site is the fossa ovalis (FO) &#8211; the atrial septum&#8217;s thinnest section. A potentially beneficial transseptal site, for the cryoballoon, is near the inferior limbus (IL). This study examines an alternative transseptal site near the IL, which may decrease the frequency of acute iatrogenic atrial septal defect (IASD). Also, the study evaluates the acute pulmonary vein isolation (PVI) success rate utilizing the IL location. 200 patients were evaluated by retrospective chart review for acute PVI success rate with an IL transseptal site. An additional 128 IL transseptal patients were compared to 45 FO transseptal patients by performing Doppler intracardiac echocardiography (ICE) post-ablation to assess transseptal flow after removal of the transseptal sheath. After sheath removal and by Doppler ICE imaging, 42 of 128 (33%) IL transseptal patients demonstrated acute transseptal flow, while 45 of 45 (100%) FO transseptal puncture patients had acute transseptal flow. The difference in acute transseptal flow detection between FO and IL sites was statistically significant (P &#60;0.0001). Furthermore, 186 of 200 patients (with an IL transseptal puncture) did not need additional ablation(s) and had achieved an acute PVI by a &#8220;cryoballoon only&#8221; technique. An IL transseptal puncture site for cryoballoon AF ablations is an effective location to mediate PVI at all four PVs. Additionally, an IL transseptal location can lower the incidence of acute transseptal flow by Doppler ICE when compared to the FO. Potentially, the IL transseptal site may reduce later IASD complications post-cryoballoon procedures.

The goal of this study is to demonstrate the preferential location of transseptal puncture during a cryoballoon catheter ablation procedure for the treatment of atrial fibrillation.

Reduzierung der Iatrogene Vorhofseptumdefekte mit einer vorderen und Inferior Transseptal Einstichstelle bei der Bedienung des Kryoballon Ablationskatheter

The cryoballoon catheter ablates atrial fibrillation (AF) triggers in the left atrium (LA) and pulmonary veins (PVs) via transseptal access. The typical ...

Rat Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy (ALPPS) Procedure

Recent clinical data support an aggressive surgical approach to both primary and metastatic liver tumors. For some indications, like colorectal liver metastases, the amount of liver tissue left behind after liver resection has become the main limiting factor of resectability of large or multiple liver tumors. A minimal amount of functional tissue is required to avoid the severe complication of post-hepatectomy liver failure, which has high morbidity and mortality. Inducing liver growth of the prospective remnant prior to resection has become more established in liver surgery, either in the form of portal vein embolization by interventional radiologists or in the form of portal vein ligation several weeks prior to resection. Recently, it was shown that liver regeneration is more extensive and rapid, when the parenchymal transection is added to portal vein ligation in a first stage and then, after only one week of waiting, resection performed in a second stage (Associating Liver Partition and Portal vein ligation for Staged hepatectomy = ALPPS). ALPPS has rapidly become popular across the world, but has been criticized for its high perioperative mortality. The mechanism of accelerated and extensive growth induced by this procedure has not been well understood. Animal models have been developed to explore both the physiological and molecular mechanisms of accelerated liver regeneration in ALPPS. This protocol presents a rat model that allows mechanistic exploration of accelerated regeneration.

Rat Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy ALPPS Procedure

Inducing rapid liver hypertrophy using Associating Liver Partition and Portal vein ligation for a Staged hepatectomy (ALPPS) has been proposed for resection of borderline resectable liver tumors. This model may elucidate mechanisms involved in rapid hypertrophy and allows testing of drugs that promote or block the acceleration of regeneration.

Rattenmodell der Leber Partition zuordnen und Pfortader Ligation inszenierten Hepatektomie (ALPPS) Verfahren

Recent clinical data support an aggressive surgical approach to both primary and metastatic liver tumors. For some indications, like colorectal liver ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

Vene subclavia Punktion als eine Alternative Methode zur Probe Blutentnahme bei Ratten

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

Blutentnahme durch Subclavian-Vein-Punktion in Mäusen

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...