Wir sind verpflichtet, unseren technischen Assistenten: U. Bröder und H. Shkarlet, die uns während der experimentellen Verfahren geholfen. Diese Arbeit wurde teilweise von EU-Zuschüssen (UniVax, Vertrag Nr. 601738 und TRANSVAC2, Vertrag Nr. 730964) und ein Stipendium der Helmholtz-Gemeinschaft (HAI-IDR) finanziert. Die Finanzierungsquellen hat keinen Einfluss auf die Forschung design, Erzeugung von Manuskript oder Entscheidung, zur Veröffentlichung übermitteln.

Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden aus dem C57BL/6-Hintergrund. Alle Tiere wurden unter Pathogen-freies Bedingungen gehalten. Alle Experimente wurden nach den normativen das deutsche Tierschutzgesetz (TierSchG BGBl. durchgeführt. ICH S 1105; 25.05.1998) und des unteren Sachsen-Ausschusses für die Ethik von Tierversuchen und das Landesamt (untere Sachsen Stand für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit), unter der Genehmigung Nr. 33,4-42502-04-13/1281 und 162280 angenommen wurden.
1. CFSE-Färbung des OT-I T-Zellen und Adoptiv-Transfer
Hinweis: OT-ich Mäuse sind Transgen generierten Tiere, die einen T-Zell-Rezeptor (TCR) Ausdrücken mit festen α und β-Ketten, die zusammen die Immuno-Dominant-Peptid der OVA, erkennen SIINFEKL10,11. Infolgedessen haben diese Mäuse eine deutlich hohe Anzahl von SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen (97 %)12 im Vergleich zu normalen oder OVA geimpften Mäuse (≤ 1 %)13.
<ol><li>Isolierung von nachvollziehbar CD8+ T-Zellen von OT-ich Mäuse mit dem Ausdruck T-Lymphozyten-spezifischen Thy1ein (Thy1.1) Allel:<ol>
<li>Einschläfern 6-9 Wochen alten OT-ich Mäuse durch CO2 Inhalation gefolgt von zervikale Dislokation14. Die Milz und große Lymphknoten (leisten-, axillären und zervikalen Paare nur) indem die Haut mit chirurgische Scheren, ablösen der Haut aus dem Körper mit Hilfe von chirurgischen Zangen und Pinzetten zu sezieren und legen Sie sie in Petrischalen (60 x 15 mm) jeweils ein 100 µm Pore Netz Tasse Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung.</li>
		<li>Pflegen Sie Petrischalen (jeweils mit einem Mesh-Cup) in 3-5 mL des kompletten RPMI Medium (RPMI 1640, 10 % V/V FCS, 100 U/mL Penicillin, Streptomycin 50 µg/mL) auf Eis gehalten.</li>
		<li>Pürieren Sie die Organe mit Hilfe von einem Spritzenkolben oder ein ähnliches steriles Instrument (vorherige schneiden ist nicht erforderlich) und sammeln Sie die entstandene Suspension Einzelzelle in 15 mL Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zellen in 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugation und lyse der Erythrozyten aus der Milz wieder aussetzen das Pellet in 1 mL/Milz Ammoniumchlorid Puffers (ACK-Puffer, im Handel erhältlich). Brüten Sie die Zellen für 1,5 min auf Eis, und waschen Sie anschließend die Zellen mit 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugieren (wie zuvor).</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie das Pellet in das gleiche Rohr in 1 mL PBS (pH 7,2) mit 5 % fötalen Rinderserum für magnetische Isolierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um magnetische Isolierung durchzuführen, gehen Sie zu der negativen Auslese der CD8+ T-Zellen durch die Verwendung eines magnetischen isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers oder Protokolle15veröffentlicht.</li>
	<li>Zur Durchführung CFSE-Färbung, zuerst die Anzahl der CD8+ T Zellen gewonnenen OT-ich Mäuse mit einem automatisierten Zelle Zähler (Partikelzähler). Fleck 1-5 x 107 Zellen/mL in ein Volumen von 1-5 mL mit 5 µM CFSE mit PBS-Puffer für 7 min bei 37 ° C, lichtgeschützt in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.</li>
	<li>Stillen Sie die CFSE-Färbung der Zellen das gleiche Volumen (1:1) des fötalen Rinderserum hinzufügen zu, und inkubieren sie zusätzliche 7 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL PBS zweimal.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler. Festlegen der Zellzahl auf 3-5 x 107 Zellen/mL PBS um 3-5 x 106 Zellen/Maus in 100 µL intravenös zu injizieren (i.v.) über die Rute Vene.</li>
	<li>Zum Heck Vene Injektionen durchführen zu immobilisieren die Mäuse in entsprechenden wachstumsbefürworter. Wärmen Sie den Rückenbereich und Tail der Mäuse injiziert werden, mithilfe einer Rotlicht-Lampe, zwischen 20 bis 25 cm entfernt von den Mäusen für 1-3 min zum Heck Vene Vasodilatation zu ermöglichen. Hinweis: Dadurch Leichtigkeit Vene Erkennung und Verwaltung der Zellsuspension.</li>
	<li>(Mit der Hand zwischen die Mäuse und die Lampe platziert) sicherzustellen, dass es nicht zu heiß für die Mäuse und wenn die Rute Venen deutlich sichtbar sind, fahren Sie mit der Injektion. Injizieren Sie die Zellen in der seitlichen oder dorsalen Schweif Ader mit einer 1mL Spritze mit einem 25-Gauge-Nadel16.</li>
</ol>2. Immunisierung (Endo-freie OVA +/-adjuvante)
<ol><li>Legen Sie die Mäuse transplantiert mit OT-ich Zellen (Schritt 1.7, Abbildung 1) in einer Narkose-Kammer und Isofluran in Sauerstoff durch eine Anästhesie Maschine14zu verwalten.</li>
	<li>Wenn die Maus völlig eingeschlafen unter Narkose ist, nehmen Sie es aus der Kammer und rasieren Sie das Fell der Maus auf den Bereich über den Gluteus Superficialis (seitlichen unteren Rücken) mithilfe einer elektrischen Haar Beschneidemaschine, um eine saubere Injektion durchführen mit einen guten Blick auf das Einsatzgebiet.</li>
	<li>50 µL des Impfstoffes, s.c. in den rasierten Bereich mit einer 25-Gauge-Nadel zu injizieren.</li>
</ol>3. Isolation von Lymphozyten und Färbung für Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Isolierung von Lymphozyten und splenocyten<ol>
<li>Einschläfern Sie die geimpften Mäuse durch CO2 Einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation.</li>
		<li>Extrahieren Sie der Entwässerung und entfernten Lymphknoten und der Milz und legen Sie sie in separaten Petrischalen mit 100 µm Pore Netz Tassen Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung. Führen Sie die Schritte 1.1.2 durch 1.1.3.</li>
		<li>Abgießen Sie den überstand nach Zentrifugation und wieder auszusetzen Sie, die Zelle Pellets in das gleiche Volumen der Überrest PBS (ca. 100 µL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Färbung für Flow-zytometrie-Analyse<ol>
<li>In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen bereiten Sie einen master-Mix enthält die Färbung Antikörper in den Konzentrationen, die in Tabelle 1dargestellt, ein 2 X so nachgiebig Färbung Mischung konzentriert. Bereiten Sie genügend Volumen des master-Mix, 100 µL pro Probe zu haben. Die Zellen und die master-Mix 1:1 mischen und bei 4° C für 30 min inkubieren. Hinweis: Der letzte Färbung Band pro Probe sollte 200 µL (100 µL der Zelle Pellet + 100 µL Antikörper-master-Mix).</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugation, wie unter 1.1.3, Hinzufügen von 10 mL PBS, zweimal.</li>
		<li>Wieder aussetzen der gefärbten Zellen in 0,5-1 mL PBS für Erwerb und die Übertragung der Aussetzung zu Flow Cytometer Röhren. Immer die Proben auf Eis und vor Licht geschützt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. die Durchflusszytometrie
<ol><li>Immer Vorfilter die Zellproben mit 70-100 µm filtern.</li>
	<li>Die Fluorophore detailliert in Tabelle 1 (Perlen oder Zellen) bereiten Sie einheitliche Färbung Entschädigung Kontrollen vor. Hinweis: Entschädigung sollte durchgeführt im Cytometer oder Analyse-Software17,18,19 und auf alle Proben angewendet werden.</li>
	<li>Folgen Sie der gating-Strategie in Abbildung 2dargestellt. Kurz, Tor Populationen im forward Scatter Höhe vs. forward Scatter Bereich (Abbildung 2A), und wieder Seite streuen breit vs. Scatter Seitenbereich (SSA, Abb. 2 b), um Dubletten auszuschließen.</li>
	<li>Tor der Bevölkerung aus Figur 2 b durch Plotten BV 650 (Auto-Fluoreszenz) vs. FITC (CFSE) um echte CFSE-zu diskriminieren gefärbten Zellen aus hohen Auto-fluoreszierende Zellen. Enthalten Sie Perlen oder Zellen befleckt mit Antikörper konjugiert BV 650 in Entschädigung Steuerelemente. Dieses Grundstück (Abbildung 2) BV 650 vs. FITC wird verwendet, um die OT Tor-ich CFSE gefärbten Zellen.</li>
	<li>Tor der Bevölkerung aus Figur 2 C für Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) um Zellen aus Spender vs. Empfänger Mäusen zu unterscheiden. Hinweis: Zellen abgeleitet von OT-ich Spender Mäuse sind Thy1.1+ (CD90.1), WT (C57BL/6, Empfänger) Mäuse-abgeleitete Zellen Thy1.2+ (CD90.2) (Abb. 2D). Einige Labore haben OT-ich Mäuse in einem Thy1.2 Hintergrund und WT (C57BL/6) in einem Thy1.1. In diesem Fall müssen Sie einen Antikörper gegen Thy1.2 für OT verwenden-ich Handy-gating.</li>
	<li>Re Tor CD8+ Zellen von Thy1.1+ Bevölkerung durch Plotten es auf ein Tor, bestehend aus BV 450 (CD4) vs. APC (CD8) (Abb. 2E).</li>
	<li>Anzeigen die Bevölkerung in Abbildung 2E mithilfe eine Histogrammanzeige von der CD8 gated+ Zellen zeigen CFSE (FITC, 530/15-Kanal - blaue Laser-), Tor die proliferierte Bevölkerung durch die Einbeziehung der Intensitäten von 102 bis auf die Ebene wo die ungeteilten Kontrolle Bevölkerungen sind (Intensitäten ~ 105, abhängig von der Wirksamkeit der CFSE-Färbung und die Spannungseinstellung auf das Durchflusszytometer) (Abb. 2F).</li>
	<li>Machen Sie einen zusätzliches Tor (nicht in Abbildung 2 dargestellt) Plotten FITC vs. L/D-Marker (450/20 Kanal, UV-Laser), um tote Zellen parallel zur Verbreitung Bewertung bewerten.</li>
	<li>Erwerben Sie mindestens 5000 Ereignisse für die Entschädigung Steuerelemente und 10,000 Ereignisse (Tor E, Abbildung 2) aus den Proben in einem Durchflusszytometer. Laufen die Cytometer mit geringer oder mittlerer Durchfluss (Flussraten von 20.000 Veranstaltungen/s nicht überschreiten).</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Moderne Impfstoffe sind im Idealfall Composedof gereinigte Antigen und Hilfsstoffe, mit den möglichen Zusatz eines Liefersysteme wie Liposomen, virusähnliche Partikel, Nanopartikel oder live Vektoren. Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung eines Impfstoffes ist, die richtigen adjuvanten nach den klinischen Bedürfnissen wählen. Bestandteil des Lieferumfangs könnte begünstigt eine humorale vs. zelluläre Immunantwort (oder beides), die Wahl eines lokalen vs. einer systemischen Immunantwort (oder beides) und die Art des Speichers, die der Impfstoff in der Zielpopulation generieren muss. Ein wesentlicher Aspekt der adjuvanten Bewertung ist seine Fähigkeit, CTL erzeugen schnell bestimmen. Hier präsentierten wir eine Methode basiert auf der bereits bekannten Techniken, um die Funktionen des CTL Antwort in Vivo in einem Mausmodell schnell bestimmen, indem Sie messen OT-I CD8 T-Zell-Proliferation. Diese Methode ermöglicht die Vorhersage der Potenz der Immunantwort ausgelöst durch Adjuvantien (Verbreitung von OT-I T-Zellen) in nur 4 Werktagen. Diese Methode weiter erleichtert den Vergleich von den Aktionen der Adjuvantien in Bezug auf die Immunantwort (lokal vs. systemische) und seine wirksame Maßnahmen. Hier haben wir ein Beispiel gezeigt, wie Immunisierung mit verschiedenen adjuvante Behandlungen (ADJ1 vs. ADJ2) die Immunantwort beeinflussen wird. Die Wirkung der ADJ2 beschränkte sich auf der näheren Umgebung der Verwaltung, wo es die Immunantwort in die drainierenden Lymphknoten aktiviert, während der Einwirkung von ADJ1 mit der gleichen Dosis weiter verbreitet, generieren eine CTL Reaktion auf die lokale und systemische Ebene, sondern war mit weniger Potenz als ADJ2 in den Lymphknoten.
Wichtige Schritte für die erfolgreiche Evaluation ein Adjuvans CTL Kapazität sind die Wahl der jungen OT-ich Tiere (als eine Quelle von CD8 T-Zellen) und die Verwendung von Endotoxin-freie Eizellen für die Immunisierung. Seit OT-ich Mäuse sind Transgene Tiere generiert, um CD8 T-Zellen zu produzieren, die OVA Peptid SIINFEKL in einem MHC zu erkennen-ich Kontext, die künstliche Selektion der Maus TCR erhöht die Auftritte der hyper proliferative CD8+ T Zellen20 mit dem Alter. Eine Entzündung der axillären Lymphknoten ist damit ein häufiger Bestandteil Alter OT-ich Mäuse. Wenn man dies berücksichtigt, es empfiehlt sich, junge OT verwenden-ich Tiere wenn möglich (6-9-Wochen alten Tiere) und um zu vermeiden, Isolieren von Zellen aus einem erweiterten Organe (entweder Milz Lymphknoten). Die Verwendung von vergrößerten Organe mit wuchernden CD8 T-Zellen wird den ganze Test auswirken, da am ehesten Unterschiede in der Verbreitung zwischen Kontrollen und Behandlungen nicht erzielt werden. Eine ähnliche Gefahr für die Diskriminierung der adjuvanten CTL Erzeugungskapazität konnte mithilfe OVA Protein mit Spuren von Endotoxin, die eine stärkere Immunantwort gegenüber Endotoxin-freie OVA21,22 (siehe entlocken können generiert werden Materialien und Reagenzien), da Endotoxine starke Immuno-Modulatoren pro se 23 sind. Daher muss die OVA-Protein verwendet für die Immunisierung Endotoxin-frei sein. Die Verwendung von 20 oder 50 µg von Endotoxin-freie OVA richtet sich nach der Immunisierung Route wird 50 µg eine geeignete Dosis für subkutane Prüfung von Adjuvantien. Darüber hinaus die Verwendung von hohen Konzentrationen von CFSE wurde in der Literatur berichtet, der gefärbten Zellen24 töten und könnte auch das Scheitern des Assays.
Einige Änderungen oder Verbesserungen an verschiedene Techniken verwendet in dem Protokoll wurden umgesetzt, um den Stress der Tiere, Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Experimente zu reduzieren. Zum Beispiel im Zusammenhang mit der Heizung der Tiere zu minimieren, indem Sie nur Heizung hinten und das Heck der Mäuse und nicht das ganze Tier, oder subkutane Injektion zu vermeiden Stress durch Betäuben der Tiere vor der Impfung. Die Narkose ist nicht erforderlich, durch Tierschutzbestimmungen für eine subkutane Injektion, aber nach unserer Erfahrung es Reproduzierbarkeit verbessert, verringernd, Variationen von der Stressantwort eingeführt.
Eine große Einschränkung dieser Methode ist, dass da CFSE der Membran von Zellen Flecken, die hohe Helligkeit in der Regel die Erkennung von Signalen aus dem Zytosol beeinträchtigt. Daher, wenn die Bestätigung von CTL Kapazität benötigt wird, sollte die Sekretion von IFN-γ durch einen spezifischen Sekretion Assay 25und nicht durch intrazelluläre Zytokin Färbung bewertet werden.
Die Verwendung der Messung der Verbreitung, der CTL Erzeugungskapazität von Adjuvantien in nur 4 Tagen zu schätzen hat den Vorteil kürzerer Zeit als traditionelle CTL26 Assays und es ist eine gute Interessenten im Fall wo weitere Experimentieren erforderlich Bestätigung durch andere Methoden ist erforderlich.
Obwohl auf OVA als Antigen, beschränkt und daher auf die Verwendung von OT-I T-Zellen, die vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften der Aktivierung durch verschiedene Adjuvantien nach dem Sortieren der proliferierte Zellen induziert. Eine der möglichen Anwendungen ist die Studie der metabolischen Signaturen induziert durch verschiedene Adjuvantien in der proliferierte OT-I T-Zellen und ihre Beziehungen mit der Entwicklung der Speicher27. Zusätzliche sekundäre Vorführungen konnten die biologischen Eigenschaften der stimulierten Zellen, z. B. den Ausdruck von Zytokinen oder Degranulation Marker durch Durchflusszytometrie oder ihre zytotoxische Kapazität durch die Durchführung von in-vivo CTL Tests8, bewerten 26 , 28. Da diese Anwendung die Einschränkung des Konsums bei Mäusen hat, können Extrapolation auf den Menschen durch Ausnutzung Vorführungen basierend auf humanisierten Mäuse29,30,31durchgeführt werden.
Diese Methode, da wir hier vorgestellt haben ist robust genug, um als erste Screening für die Auswahl der zellulären Antwort Aktivatoren verwendet werden und auch flexibel genug, um verändert oder zur weiteren Analyse der proliferierte T-Zellen gekoppelt werden. Zusammenfassend ist dieses in-vivo schnellbewertung adjuvante CTL Erzeugungskapazität ein ideales Werkzeug für Impfstoff Laboratorien in Wissenschaft und Industrie, die eine schnelle Charakterisierung der Wirkungsweise ihrer adjuvante Kandidat Moleküle interessiert sind.

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren Impfstoffe sind wichtige therapeutische Interventionen, die entwickelt wurden, um bestimmte Arten von Krebs1zu kämpfen. CTL sind auch wichtig für prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger2. Darüber hinaus CTL sind eine der wenigen immun Abwehrmechanismen in Gefahr Bevölkerungen wie Neugeborene3,4 wen auch abhängig von CTL gegen frühen Lebens Infektionen5funktionell aktiv. In diesem Zusammenhang führte Impfstoffe gegen Respiratory Syncytial Virus (RSV), die mit Adjuvans entwickelt wurden, die nicht CTL-Antworten (Alaun) entlocken wird ein Totalausfall des Impfstoffes führt zu schwerwiegenden Komplikationen bei Infektionen bei Säuglingen6. Diese negativen Auswirkungen der Impfung können rückgängig gemacht werden, indem eine CD8+ T-Zell Antwort7. Wir haben bereits gezeigt, dass die wichtigsten Zytokine (Typ-I-Interferone) hervorgerufen durch einige Stimulator der Interferon-Genen (STING)-Agonisten unerlässlich für die CTL-Antworten generiert durch diese Adjuvantien8, teilweise sind durch die Messung der Verbreitung von OT-I T-Zellen nach Impfung und anhand dieser Ergebnisse als ein Maß für die CTL induzierende Fähigkeiten beobachtet Impfung Zeitpläne9erweitert. Die Messung der Verbreitung von OT-ich CD8+ T-Zellen in einem Wild-Typ (WT) C57BL/6 Empfänger Maus durch Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Farbstoff Verdünnung ist eine robuste Einschätzung der Fähigkeit des Adjuvans eines Impfstoffs zu generieren Kreuz-Grundierung von SIINFEKL, (die Immuno-dominante Peptid von Ovalbumin, Eizellen). Variationen dieser Technik sind weit verbreitet für die Beurteilung der Verbreitung von OT-ich CD8+ und OT-II CD4+ T Zellen. Zum Beispiel hat es in Abwesenheit des ausgewählten Zytokine (KO-Mäusen) oder impfstoffwirksamkeit nach Antigen-Rückruf bei WT Tieren Messen eingesetzt. Wir entwickelten ein kurzes Protokoll (4 Tage-Experiment) in dem nach Passive Übertragung der CFSE--gefärbten OT-ich CD8+ T-Zellen, eine subkutane (s.c.)-Immunisierung, bestehend aus einer Dosis von 50 µg von Endotoxin-freie OVA ergänzt mit Test Adjuvantien verabreicht (Abbildung 1). Die Follow-up der Ergebnisse 48 h nach der Impfung bietet zuverlässigen Beweis für die Fähigkeit des Adjuvans, CTL-Antworten zu generieren. Mit dieser Strategie ist es möglich, die Wirksamkeit der lokalen Immunantwort in die drainierenden Lymphknoten nach Immunisierung sowie das Ausmaß der Reaktion zu bewerten, durch Messung der CTL-Aktivität in der Milz (oder entfernte Lymphknoten).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Special Order</td>
			<td>Flow Cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Proliferation Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480007</td>
			<td>Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Dead Cell Marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0900-82</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>740007</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z2 coulter Particle count and Size Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>9914591DA</td>
			<td>Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td>
			<td>Hyglos(Germany)</td>
			<td>321000</td>
			<td>Ovalbumin endotoxin free tested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#181;m nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Cell strainer (100 &#181;m pore mesh cups).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Vials</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>899366014</td>
			<td>Sample vials for Z2 automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (CD90.2)</td>
			<td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Company is now Envigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)</td>
			<td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fischer (Corning)</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL tubes</td>
			<td>Fischer (Corning)</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (500 mL)</td>
			<td>Fischer (Gibco)</td>
			<td>20-012-027</td>
			<td>Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red lamp (heating lamp)</td>
			<td>Dirk Rossmann GmbH (Germany)</td>
			<td>405096</td>
			<td>Heating infrred lamp (100 wats)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (Isoflurane)</td>
			<td>Abbott Laboratories (USA)</td>
			<td>5260.04-05.</td>
			<td>Isoflurane anesthesic (250 mL flask).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td>Isoflurane anesthesia machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Base medium with Glutamine (500 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum (Gibco)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dishes</td>
			<td>Nunc (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>150340</td>
			<td>60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Clump Filter</td>
			<td>CellTrics (Sysmex)</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td>CellTrics&#174; 50 &#956;m, sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development

Die Bewertung der modernen Untereinheit Impfstoffe zeigt, dass die Generation von neutralisierenden Antikörpern wichtig, aber nicht ausreichend für die adjuvante Auswahl. Daher sind Hilfsstoffe mit humorale und zelluläre Immuno-stimulierende Funktionen, die in der Lage, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Antworten zu fördern sind dringend notwendig. So steht treu Überwachung der adjuvanten Kandidaten, die Kreuz-Grundierung zu induzieren und anschließend verbessern CTL-Generation einen entscheidenden Schritt in der Entwicklung von Impfstoffen. Hier präsentieren wir einen Antrag auf eine Methode, die SIINFEKL-spezifische verwendet (OT-ich) T-Zellen, die Kreuz-Präsentation des Modells Antigen Ovalbumin (OVA) in Vivo in Anwesenheit von verschiedenen adjuvante Kandidaten zu überwachen. Diese Methode stellt ein Schnelltest Adjuvantien mit den besten Cross-Priming-Funktionen auswählen. Die Proliferation von CD8+ T Zellen ist die wertvollste Angabe des Kreuz-Grundierung und es gilt auch als Korrelat des Adjuvans-induzierte Kreuz-Präsentation. Diese Funktion kann in verschiedenen immun Organen wie Lymphknoten und Milz ausgewertet werden. Das Ausmaß der CTL-Generation auch überwacht werden kann, wodurch es Erkenntnisse über die Natur eines einheimischen (Lymphknoten vor allem entleeren) oder eine systemische Reaktion (entfernte Lymphknoten und/oder Milz). Diese Technik weiter erlaubt mehrere Modifikationen zum Testen Medikamente, die können hemmen bestimmte Wege Kreuz-Präsentation und bietet auch die Möglichkeit in verschiedene Stämme von konventionellen und gentechnisch veränderten Mäusen verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen wird die Anwendung, die wir hier präsentieren nützlich für Impfstoff-Labors in Industrie oder Wissenschaft sein, entwickeln oder ändern chemischen Hilfsstoffe für Impfstoff-Forschung und Entwicklung.

Um die Behandlungen mit einer anderen Kombination von Adjuvantien (ADJ1 und ADJ2) zu testen, beurteilten wir die CTL-Erzeugungskapazitäten durch Messung der Verbreitung von adoptively übertragenen OT-ich CD8+ T-Zellen durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2). Hierzu gebeizt wir zuvor isolierte Zellen aus der drainierenden Lymphknoten und der Milz (Tabelle 1). Durch die Messung der Proliferation von CD8+ T Zellen in Lymphknoten und Milz, konnten wir eine höhere CTL Erzeugungskapazität von ADJ2 in den Lymphknoten (Abbildung 3) bestätigen im Vergleich zu ADJ1, OVA allein oder PBS Kontrolle. Im Gegensatz dazu haben wir beobachtet, dass ADJ2 war nicht in der Lage, eine CTL-Antwort in einem systemischen Fach (Milz) zu generieren, während ADJ1 zeigen hohe Verbreitung durch Milz CD8 war+ T-Zellen, nicht nur im Vergleich zu den Kontrollen (PBS und OVA) aber auch überlegen zu ADJ1. Durch die Aktion des ADJ2 mithilfe dieser schnelle in-Vivo -Verbreitung-Assay sezieren, können wir ihre starke Wirkung als eine lokale, aber keine systemische CTL-Generator bestätigen. Darüber hinaus wirkt sowohl auf den lokalen Standort der Einspritzung (Lymphknoten) ADJ1 sowie als systemisch mit einer erhöhten OT-ich Verbreitung in der Milz. Die erzielten Ergebnisse erlauben uns, die adjuvante Aktivität und seine Ausdehnung, veranschaulicht durch die beobachteten Effekte von ADJ2 (lokal) und ADJ1 (systemischen) charakterisieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig1.jpg"> Abbildung 1: der Assay-Zeitleiste. Die Assay-Zeitleiste stellt die ersten OT-ich T Zelle übertragen an Tag 0, s.c.-Impfung am Tag 1, und die Probenahme Milz und Entwässerung Lymphknoten 2 Tage später. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig2.jpg"> Abbildung 2: Flussdiagramm der gating-Strategie gefolgt, die Proliferation von CD8 Messen+ T Zellen (OT-ich, Thy1.1+) durch Durchflusszytometrie. Zwei Proben werden in verschiedenen Farben (rot und blau) für eine bessere Visualisierung dargestellt. A-B. Einzelne Zellen sind von Dubletten sukzessive in den ersten beiden Toren diskriminiert, durch Plotten vorwärts-Scatter-Höhe vs. vorwärts-Scatter-Bereich und Breite Streuung Seite vs. Seitenbereich streuen. C. gated in B Zellen werden durch ihre Fluoreszenz-Intensität von BV 650 Kanal (Auto-Fluoreszenz) aufgetragen gegen ihre CFSE-Intensität (wobei Diming Zellen Divisionen/Verbreitung angibt) im 530/30 YG Kanal angezeigt. Dieses Tor ermöglicht die Auswahl von true CFSE-positive Zellen durch diskriminierende diejenigen, die hohe Auto-Fluoreszenz haben. D. CFSE-positive Zellen wurden gated mit ihrer hohen Fluoreszenzintensität von Pe-Cy7 (Thy1.1, Marker für OT-ich Zellen) vs. ihre APC-Intensität (CD8). E. BV 450 (CD4) aufgetragen gegen APC (CD8) für zuvor gated Thy1.1 positive Zellen markieren genau CD8+ T Zellen. F. gated zuvor CD8+ Zellen werden in einem Histogramm gegen die CFSE-Intensität, schließlich die zunehmende Bevölkerung Tor dargestellt. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig3.jpg"> Abbildung 3: adjuvante CTL Generation angetrieben. Die Fähigkeit, lokale oder systemische CTL-Antworten zu entlocken ist für 2 verschiedene adjuvante Behandlungen (ADJ1 und ADJ2) entlang Antigen und PBS-Steuerelemente dargestellt. Die Verbreitung der adoptively übertragenen OT-I T-Zellen wird untersucht, in die drainierenden Lymphknoten (leisten-, für die beispielhaft subkutaner (SC)) und in der Milz, wie in der Abbildung Zeilen angegeben. Die Zellproliferation wird gemessen, um das Ausmaß der Immunantwort genau vergleichen in allen relevanten Behandlungen (Spalten), in seiner lokalen (Drainierende Lymphknoten) oder systemischen (Milz) Aktionsradius. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Farbstoffe - Antikörper</td>
			<td>Klon</td>
			<td>Fluorophor/Kanal-filter</td>
			<td>Konzentration 2 X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thy1.1 (CD90.1)</td>
			<td>HIS51</td>
			<td>PE-Cy7-780/60 YG</td>
			<td>1:750</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>53-6,7</td>
			<td>APC - 670/14 R</td>
			<td>1:280</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>RM4-5</td>
			<td>BV 421-450/50 V</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CFSE</td>
			<td>-</td>
			<td>FITC - 530/30 YG</td>
			<td>(nach CFSE--Färbung-Protokoll)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM (Tote Zelle Marker)</td>
			<td>-</td>
			<td>-/ U.V. - 450/50 UV</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Keramikschalen Antikörper für die Durchflusszytometrie. Fluorophor-konjugierten Antikörpern Klone verwendet und empfohlen, Färbung Konzentrationen (2 X).

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Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

8.6K Aufrufe.  Helmholtz Centre for Infection Research. Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Serie: Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers. This makes them a potentially valuable tool for the treatment of many different diseases. With the advent of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and continuing research with human embryonic stem cells (hESCs) there is a need for assays that can demonstrate that a particular cell line is pluripotent. Germline transmission has been the gold standard for demonstrating the pluripotence of mouse embryonic stem cell (mESC) lines1,2,3. Using this assay, researchers can show that a mESC line can make all cell types in the embryo including germ cells4. With the generation of human ESC lines5,6, the appropriate assay to prove pluripotence of these cells was unclear since human ESCs cannot be tested for germline transmission. As a surrogate, the teratoma assay is currently used to demonstrate the pluripotency of human pluripotent stem cells (hPSCs)7,8,9. Though this assay has recently come under scrutiny and new technologies are being actively explored, the teratoma assay is the current gold standard7. In this assay, the cells in question are injected into an immune compromised mouse. If the cells are pluripotent, a teratoma will eventually develop and sections of the tumor will show tissues from all 3 germ layers10. In the teratoma assay, hPSCs can be injected into different areas of the mouse. The most common injection sites include the testis capsule, the kidney capsule, the liver; or into the leg either subcutaneously or intramuscularly11. Here we describe a robust protocol for the generation of teratomas from hPSCs using the testis capsule as the site for tumor growth.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the potential to treat a myriad of different diseases. The utility of these cells lies in the fact that they can differentiate into any cell type in the body. Here we describe the teratoma assay, which is used to demonstrate the pluripotence of hPSCs.

Teratom-Generation in den Hoden Capsule

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Forschung

Medizin

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the low-molecular-weight-heparin (LMWH), enoxaparin. There are also urgent clinical situations where it would be important if this could be determined rapidly. The present assay is designed to accomplish this. We only assayed human blood samples that were spiked with known concentrations of enoxaparin. The essential feature of the present assay is the quantification of the efficacy of enoxaparin in a patient's blood sample by degrading it to complete inactivity with heparinase. Two blood samples were drawn into Vacutainer tubes (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) that were spiked with enoxaparin; one sample was digested with heparinase for 5 min at 37 &deg;C, the other sample represented the patient's baseline anticoagulated status. The percent shortening of clotting time in the heparinase-treated sample, as compared to the baseline state, yielded the anticoagulant contribution of enoxaparin. We used the portable, battery operated Hemochron 801 apparatus for measurements of clotting times (International Technidyne Corp., Edison, NJ). The apparatus has 2 thermostatically controlled (37 &deg;C) assay tube wells. We conducted the assays in two types of assay cartridges that are available from the manufacturer of the instrument. One cartridge was modified to increase its sensitivity. We removed the kaolin from the FTK-ACT cartridge by extensive rinsing with distilled water, leaving only the glass surface of the tube, and perhaps the detection magnet, as activators. We called this our minimally activated assay (MAA). The use of a minimally activated assay has been studied by us and others. 2-4 The second cartridge that was studied was an activated partial thromboplastin time (aPTT) assay (A104). This was used as supplied from the manufacturer. The thermostated wells of the instrument were used for both the heparinase digestion and coagulation assays. The assay can be completed within 10 min. The MAA assay showed robust changes in clotting time after heparinase digestion of enoxaparin over a typical clinical concentration range. At 0.2 anti-Xa I.U. of enoxaparin per ml of blood sample, heparinase digestion caused an average decrease of 9.8% (20.4 sec) in clotting time; at 1.0 I.U. per ml of enoxaparin there was a 41.4% decrease (148.8 sec). This report only presents the experimental application of the assay; its value in a clinical setting must still be established.

Demonstration of a rapid quantitative assay of the inhibition of blood coagulation by the low-molecular-weight-heparin, enoxaparin. The contribution of enoxaparin is assessed by removing its influence through digestion with heparinase. A fuller description of the assay is detailed in our published paper.1 The assay still requires clinical confirmation.

Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen<em&gt; In-vitro-</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Sammlung und Extraktion von DNA-Speichel für Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...