I. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer NanoDrop Technologie basiert auf einem innovativen Probenretention System, das die Oberflächenspannung zu halten und zu messen Mikrovolumens Proben zwischen zwei optischen Sockel ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren nutzt. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer verwendet diese Technologie, um schnell und einfach messen 0,5-2 ul Tröpfchen von Proteinen, DNA, RNA und andere Biomoleküle. Diese Fähigkeit ist immer wichtiger geworden als molekulare Techniken ständig weiterentwickeln, um kleinere Mengen an Material für die Analyse verwenden. Die Mikrovolumens Spektrophotometer ideal für Bedingungen, unter denen Probe ist begrenzt. Doch die Einfachheit der Benutzung, schnelle Messzyklus und, und umfangreiche Konzentrationsbereich auch das Spektralphotometer geeignet, wenn ausreichende Mengen der Probe vorhanden sind. Der Messzyklus ist auch stark reduziert, dass den Wissenschaftlern geholfen Steigerung der Effizienz in ihrem Workflows. Die Mikroprobe wird direkt auf der Detektion Oberfläche platziert und eine Flüssigkeitssäule zwischen den Enden der optischen Fasern durch die Oberflächenspannung erzeugt. Diese Flüssigkeitssäule bildet eine vertikale Strahlengang. Ein Xenon-Blitz-Lampe bietet der Lichtquelle und einem Spektrometer unter Verwendung eines linearen CCD-Array verwendet wird, um das Licht, das durch die Probe geht zu analysieren. Entfernen traditionellen Containment-Geräte wie Küvetten aus dem System hat mehrere Vorteile: sehr geringe Mengen von Probe für die Messung benötigt, Reinigung erfordert einfach Abwischen der optischen Oberflächen mit einem Labor zu wischen, und die Weglänge in Echtzeit während der Messung verändert werden. Die NanoDrop 2000c bestimmt die optimale Weglänge automatisch (1 mm bis 0,05 mm) und bietet die umfangreichste Palette von möglichen Proteinkonzentration Messungen ohne Verdünnungen. Durch die Verkürzung der Weglänge, können höhere Konzentrationen an Protein gemessen werden. Hierdurch werden die Notwendigkeit, Verdünnungen für die meisten Protein-Proben durchzuführen. Zum Beispiel kann die NanoDrop 2000c messen BSA-Konzentrationen so hoch wie 400 mg / mL. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer ist ein volles Spektrum Spektralphotometer für die Messung der Absorption von DNA, RNA, Proteine ​​und andere Biomoleküle. Dieses Video-Protokoll wird auf der Messung von Proteinen zu konzentrieren. II. Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung Mit A280 Absorptionsmessung a. Das Prinzip der A280-Messungen Das Protein A280 Verfahren ist anwendbar auf gereinigte Proteine, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin Rückstände oder Cystein-Cystein Disulfidbrücken und zeigen Absorption bei 280 nm enthalten. Diese Methode verwendet die A280 Extinktionswert in Kombination mit entweder der Masse Extinktionskoeffizienten oder die molare Extinktionskoeffizient, um die Konzentration des gereinigten Proteins zu berechnen. Der Vorteil der direkten A280 Messungen ist, dass die Erzeugung einer Standardkurve nicht erforderlich ist, um Protein-Konzentration bestimmen. Wenn die Probe ein charakterisierten Protein-Lösung, Zelllysat oder Proteinrohextrakt, dann mit einem der vorkonfigurierten kolorimetrische Methoden finden Sie auf der NanoDrop 2000/2000c, wie BCA, Pierce 660 nm, Bradford und Lowry-Assays wird empfohlen. b. Mikrovolumen Protein A280 Messungen - Startup <ol><li> Wählen Sie das Protein A280 Anwendung aus dem Hauptmenü. </li><li> Wählen Sie die Art der Probe aus der Dropdown-Liste gemessen werden. Die Standardeinstellung ist für die meisten unbekanntes Protein Mischungen, in denen 1 Abs = 1 mg / mL. Empfohlen Wenn die Messung einer zuvor geprägt gereinigtes Protein, dann ist entweder die Masse Extinktionskoeffizienten oder molaren Extinktionskoeffizienten und Molekulargewicht kann eingegeben werden, um die Protein-Konzentration genauer zu bestimmen. </li><li> Wählen Sie die Konzentration Einheiten aus der Dropdown-Liste. </li></ol> c. Mikrovolumen Protein A280 Messungen - Blanking <ol><li> Stellen Sie eine leere mit einem geeigneten Puffer. Es ist wichtig, um den Puffer, in dem das Protein suspendiert verwenden. Der Puffer verwendet werden, sollten den gleichen pH-Wert und einer ähnlichen Ionenstärke als die Probelösung werden. Hinweis: RIPA Puffer beitragen zu viel Absorption bei 280 nm und sind daher nicht mit direkten A280 Protein-Messungen. Für Proteine ​​in einer RIPA-Puffer suspendiert, ist es empfehlenswert Proteinkonzentration bestimmt mit einem RIPA Puffer kompatibel Farbtestverfahren werden. </li><li> Pipette 2 ul der entsprechenden Blenden-Lösung auf den Boden Sockel, senken Sie den Arm aus und klicken Sie Blank. </li><li> Wischen Sie die leere Lösung aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen. </li></ol> d. Mikrovolumen Protein A280 Messungen Messen Wichtige Überlegungen: Die Homogenität der Probe ist extremwichtig, da so ein kleines Volumen gemessen wird. Um sicherzustellen, dass die Proben homogen sind, sanft, aber gründlich mischen die Proben unmittelbar vor der Entnahme eines Aliquots für die Messung. Vermeiden Sie die Einführung Blasen beim Mischen und Pipettieren. Aufgrund der Variabilität der Oberflächenspannung zwischen verschiedenen Proteinen, empfehlen wir loading 2 ul der Proben, um die ordnungsgemäße Spalte Bildung zu gewährleisten. Verwenden Sie immer geringer Retention Pipettenspitzen. So laden Sie eine Probe, berühren Sie die Pipettenspitze auf die geringere optische Sockel Oberfläche, während der Vertreibung der Lösung für die Lösung von der Einhaltung der Außenseite der Pipettenspitze zu verhindern. Expel weniger als den vollen Betrag der Probe Blowout und Einführung von Blasen in der Probe zu verhindern. <ol><li> Geben Sie einen Proben-ID in das entsprechende Feld, Last 2 ul der ersten Probe für die leer und klicken Sie messen beschrieben. Ein frischer 2μL Aliquot der Probe sollte für jede Messung verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie die Probe aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen. </li></ol> e. Mikrovolumen Protein A280 Messungen Reinigung Ein gewöhnlicher, fusselfreien, Labor wischen reicht oft für die Reinigung der optischen Podesten zwischen den Messungen. f. Erstellen Protein A280 Messungen Überholung Lösungen und Reagenzien Tenside kann die Messung Sockel Oberflächen im Laufe der Zeit bedingungslos und verhindert die Probenflüssigkeit Spalte zu bilden. Eine Abflachung des Tropfens auf dem unteren Sockel ist bezeichnend für die optische Oberfläche immer unbedingt. Wenn die Oberflächeneigenschaften beeinträchtigt worden, die Instandsetzung der Sockel ist wichtig, Probe Spalte Bildung zu gewährleisten. Wenn dies geschieht, buff, die optischen Flächen kräftig mit Labor wischen oder NanoDrop Pedestal Überholung Compound (PR-1), wie verwiesen. III. Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit kolorimetrischen Assays a. Das Prinzip der kolorimetrischen Nachweis Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer kann auch verwendet werden, um nicht charakterisierten Protein-Lösungen, Zelllysate, und Rohprotein Extrakten mittels kolorimetrischen Assays zu messen. Kolorimetrischen Methoden sind indirekte Methoden, die Interaktion eines Farbstoffs mit dem Protein-Komponente der Probe zu einem neuen Komplex, der Licht absorbiert im sichtbaren Wellenlängenbereich produzieren zu beteiligen. Die NanoDrop 2000c Spektrophotometer hat mehrere vorkonfigurierte kolorimetrischen Assays einschließlich BCA, Pierce 660, Bradford und Lowry-Methoden. Der BCA-Assay wird als ein Beispiel Farbtestverfahren mit einem Spektralphotometer Mikrovolumens nachgewiesen werden. (Screenshot) Die BCA (Bicinchoninsäure)-Assay ist ein gemeinsames kolorimetrischen Methode oft für verdünnte Proteinlösungen und Proteine ​​in Gegenwart von Komponenten, die signifikante UV (280 nm) Absorption benutzt haben. Im Gegensatz zu den Protein A280-Methode erfordert die Protein BCA-Methode, die eine Standardkurve generiert, bevor Probe Proteinkonzentrationen gemessen werden kann. Das Verfahren nutzt Bicinchoninsäure (BCA) als Nachweisreagenz. Die Cu-BCA-Chelat in Gegenwart von Protein gebildet wird bei 562 nm gemessen und normalisiert bei 750 nm. b. Mikrovolumen BCA Assay Messungen BCA Assay Vorbereitung <ol><li> BCA-Reagenz A, BCA-Reagenz B, Kompatibilität Reagenz Rekonstitution Puffer und Albumin (BSA)-Standards: Die benötigten Reagenzien sind in das Reduktionsmittel kompatibel Kit (.. Thermo Scientific Pierce Kat.-Nr. 23250) enthalten. </li><li> Äquilibrieren alle unbekannten Proteinen und Protein-Standards auf Raumtemperatur und gründlich mischen. </li><li> Bereiten Sie genügend frisches arbeiten Reagenz für die Standards und Proben zu messen mit einem 50:1-Verhältnis von Reagenz A: B </li><li> Für die Mikro-Assay, mit einem Verhältnis von 1:1 arbeiten Reagenz zur Probe. Fügen Sie 10 ul der Arbeit Reagenz in jedes Röhrchen mit genügend Rohre für alle Proben und Standards abdecken. Für den High-Bereich Assay verwenden ein 20:1-Verhältnis von Arbeit Reagenz zur Probe. Add 190 &amp;mgr; l der Arbeit Reagenz in jedes Röhrchen mit genügend Rohre für alle Proben und Standards abdecken. Lesen Sie die Pierce BCA-Kit Literatur, um festzustellen, welches Verhältnis eignet sich für Ihre Proben. </li><li> Fügen Sie 10 ul Standard bzw. Probe in jedes Röhrchen Reagenz. Gut mischen durch vorsichtiges Vortexen. </li><li> Die Röhrchen bei 37 ° C für 30 Minuten. </li><li> Lassen Sie die Reaktionen auf Raumtemperatur (~ 10 Minuten) ausgleichen. </li></ol> c. Mikrovolumen BCA Assay Messungen Generierung Standardkurve <ol><li> Wählen Sie das Protein BCA-Methode aus dem Hauptmenü. Wenn die Wellenlänge Überprüfung angezeigt wird, sicherzustellen, wird der Arm nach unten. </li><li> Geben Sie die Werte für jedes Standard-Konzentration im rechten Fensterbereich Tisch. Die Software ermöglicht die Referenz-und bis zu 7 additional Standards. Die Bezugs-und / oder Standards sollten in Wiederholungen gemessen werden. Hinweis: Die Mindestanforderung für Standardkurve Generation ist die Messung von zwei Normen oder die Messung der Null-Referenz und mindestens ein Standard. Es wird empfohlen, zusätzliche Standards wie nötig, um die erwarteten Assaykonzentration abdecken einbezogen werden. </li><li> Stellen Sie eine leere. Der Rohling für kolorimetrische Assays ist in der Regel H 2 O. deionisiertem </li><li> Pipette 2 &amp;mgr; l dH 2 O auf den Boden Sockel, senken Sie den Arm aus und klicken Sie Blank. Nur eine leere ist notwendig, um alle nachfolgenden Messungen der Referenz-und-Standards abdecken. </li><li> Stellen Sie die Referenz durch Pipettieren einer 2 ul-Aliquot, die nur arbeiten Reagenz und Puffer ohne Protein auf den unteren Sockel. Senken Sie den Arm aus und klicken Sie messen. </li><li> Unter der Standards Registerkarte, markieren Sie den gewünschten Standard und Pipette 2 ul der gewünschten Norm auf den unteren Sockel. Senken Sie den Arm aus und klicken Sie messen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Standards. Achten Sie darauf, alle Standards vor Maßnahme zur Messung von Proben. Um Standardkurve klicken Sie auf Standard-Kurve. </li></ol> d. Mikrovolumen BCA Assay Messungen 2 ul Protein-Messungen <ol><li> Nach all den Standards gemessen worden sind, auf die Proben-Button. Geben Sie die Proben-ID. Last 2 ul der Probe auf die untere Sockel und klicken Sie auf Messen. Ein frisches 2 ul-Aliquot der Probe sollte für jede Messung verwendet werden. </li><li> Wischen Sie die Probe aus dem unteren und oberen Sockel mit einem trockenen Labor zu wischen. </li></ol> e. Mikrovolumen BCA Assay Messungen Reinigung und Wiederaufbereitung Führen Sie die Reinigung und Instandsetzung in der direkten A280 Absorptionsmessungen beschrieben. Repräsentative Ergebnisse: Mikrovolumen Proteinkonzentration Bestimmung wird entweder durch eine direkte Messung A280 oder eine indirekte kolorimetrische Assay durchgeführt. Die A280-Messung beispielsweise bestimmt Proteinkonzentration auf die Extinktionskoeffizienten des Proteins von Interesse sind. Die BCA Farbtestverfahren Beispiel wird bestimmt, Proteinkonzentration einer Standardkurve mit bekannten Protein-Konzentrationen auf.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von Thermo Fisher Scientific, dass Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Mikrovolumen Quantifizierung verwendet die intrinsische Oberflächenspannung Eigenschaften einer Probe zu einer Flüssigkeitssäule zwischen zwei Messflächen bilden. Das Fehlen eines Containment-Gerät ermöglicht die Weglänge, um in Echtzeit zu ändern, im Wesentlichen entfällt die Notwendigkeit, Verdünnungen durchzuführen. Diese Fähigkeit erhöht drastisch die Dynamik von Protein-Konzentrationen sowie die Schnelligkeit der Messung. Durch die Verwendung von minimalen Mengen der Probe, kann eine große Anzahl von Proben schnell und genau analysiert werden, so dass die Wissenschaftler mehr Messungen und eine bessere Qualitätskontrolle. Darüber hinaus, und wenn nötig, können wertvolle Proben nach der Messung zurückgewonnen werden. Wenn solche kleinen Volumina gemessen werden, ist Probenhomogenität äußerst wichtig, Stichprobenfehler zu vermeiden. Low Retention Pipettenspitzen sollte immer zum Laden Proben verwendet werden und die Spitzen sollte geändert werden zwischen Probe repliziert werden. Der Sockel Flächen müssen ordnungsgemäß gereinigt und aufbereitet, um die genauesten Ergebnisse zu gewährleisten. Schließlich ist die Mikrovolumens Spektrophotometer ideal ist, wenn Probe ist jedoch begrenzt, um die Einfachheit der Nutzung, Geschwindigkeit und umfangreichen Dynamikbereich des Spektrometers ist geeignet, wenn Probe reichlich ist.

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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
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<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Traditionelle Spektrophotometrie erfordert Platzierung Proben in Küvetten oder Kapillaren. Dies ist oft unpraktisch aufgrund der begrenzten Probenmengen oft für Protein-Analyse verwendet. Die Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spektrophotometer löst dieses Problem mit einer innovativen Probenretention System, das Mikrovolumens Proben hält zwischen zwei Messflächen mit der Oberflächenspannung von Flüssigkeiten, wodurch die Quantifizierung von Proben in Mengen so gering wie 0,5-2 ul. Die Beseitigung von Küvetten oder Kapillaren ermöglicht Echtzeit Veränderungen in Weglänge, die die Messung der Zeit verringert, während eine starke Erhöhung der Dynamik von Protein-Konzentrationen, die gemessen werden kann. Die Notwendigkeit für Verdünnungen ist ebenfalls eliminiert, und die Vorbereitungen für die Probe quantifiziert sind relativ einfach, da die Messung Oberflächen können einfach mit Labor wischen abgewischt werden. Dieses Video Artikel stellt Änderungen an traditionellen Proteinkonzentration Bestimmungsmethoden für die Quantifizierung der Mikrovolumens Mengen an Protein mit A280 Absorptionswerte oder der BCA Farbtestverfahren.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Mikrovolumen Proben werden mit einem Spektrophotometer, das natürliche Oberflächenspannung verwendet, um Proben ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren behalten quantifiziert. Der dynamische Bereich des Protein-Konzentrationen und die Geschwindigkeit, mit denen sie gemessen werden können, sind stark mit dieser Methode erhöht.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Forschung

Biologie

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...